全 文 ：［收稿日期］ 20160118(016)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81260688，81160516);贵州省国际科技合作计划项目(2012-7040);贵州省高等学校创新能力提升
计划项目(黔教合协同创新字［2013］04)
［第一作者］ 迟明艳，硕士，讲师，从事新药研究与开发，Tel:0851-88416167，E-mail:379876001@ qq． com
［通讯作者］ * 黄勇，博士，教授，从事中药活性成分及新药研发，Tel:0851-88416167，E-mail:jack_568@ 163. com
UPLC-Q-TOF /MS分析头花蓼提取物在大鼠尿液中的代谢产物
迟明艳，向文英，杨武，孙佳，廖尚高，李勇军，黄勇*
(贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室，民族药与中药开发应用教育部
工程研究中心，药学院，贵阳 550025)
［摘要］ 目的:通过 UPLC-Q-TOF /MS鉴别大鼠口服头花蓼提取物后尿液中的原型成分及代谢产物，以探索其体内代谢过
程及直接作用物质。方法:流动相 0. 1%甲酸水溶液(A)-0. 1%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脱(0 ～ 10 min，95% ～ 55% A;10 ～ 14
min，55% ～5%A;14 ～15 min，5% ～0%A;15 ～16 min，0% ～95%A)，柱温 45 ℃，流速 0. 3 mL·min －1，进样量 2 μL。以电喷雾质
谱检测，扫描范围 m/z 50 ～1 000，在负离子模式下扫描，通过比较空白尿液、给药尿液和两者的差异图谱确认灌胃后大鼠尿液中
原型成分及其代谢产物。利用 TOF/MS得到的准确相对分子质量，对尿液中头花蓼原型成分及代谢物进行鉴别。结果:鉴别出
尿液中 3个原型成分及 15个代谢产物，推测头花蓼直接作用物质可能为原儿茶酸、槲皮素和没食子酸，或其经肝脏代谢的产物。
结论:该方法可靠、有效，可用于口服头花蓼提取物后尿液中化学成分鉴别，为该药材后续的药效物质基础研究提供参考。
［关键词］ 头花蓼;原儿茶酸;槲皮素;代谢产物;代谢途径;没食子酸
［中图分类号］ Ｒ969. 1;Ｒ945;Ｒ284. 1;O657. 7 + 2 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)17-0077-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016170077
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20160628． 1132． 006． html
［网络出版时间］ 2016-06-28 11:32
Analysis on Metabolites of Polygonum capitatum Extract in Ｒat Urine by UPLC-Q-TOF /MS
CHI Ming-yan，XIANG Wen-ying，YANG Wu，SUN Jia，LIAO Shang-gao，LI Yong-jun，HUANG Yong*
(School of Pharmacy，Engineering Ｒesearch Center for Development and Application of Ethnic Medicine and
Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education，Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou
Province，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China)
［Abstract］ Objective:To identify prototype components and metabolites of Polygonum capitatum extract
in rat urine after oral administration by UHPLC-Q-TOF /MS，and explore its direct acting substances and in vivo
metabolic process． Method:The separation was performed on a ＲＲHD Eclipse Plus C18 column with mobile phase
of 1% formic acid aqueous solution-0. 1% formic acid acetonitrile solution for gradient elution，flow rate was 0. 3
mL·min －1，column temperature was set at 45 ℃ ． Using electrospray ionization (ESI)in negative ion mode with
scanning range from m/z 50 to 1 000. By comparing chromatograms difference between blank urine and urine of
administration，prototype components and metabolites of P． capitatum extract were identified． Ｒesult:Three
kinds of prototype constituents and 15 kinds of metabolites were identified in the urine． These direct acting
substances were protocatechuic acid， quercetin and gallic acid， or their products of liver metabolism．
Conclusion:This method is reliable and effective for identifying compounds in urine after oral administration of P．
capitatum extract，and it can provide a reference for further study on pharmacodynamic material basis of this herb．
［Key words］ Polygonum capitatum;protocatechuic acid;quercetin;metabolites;metabolic pathway;
gallic acid
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头花蓼又名四季红、红酸杆、省丁草等，是贵州
省中药现代化重点培育发展的“十大苗药”和“十大
中药产业链”品种之一，收载于 2003 年版《贵州省
中药材、民族药材质量标准》［1］。具有清热解毒、利
尿通淋之功效，临床上主要用于治疗肾盂肾炎、尿道
感染、跌打损伤、膀胱炎等［2-4］。目前，已从头花蓼
药材中分离出了多种化学成分，其中主要报道了没
食子酸、槲皮素、槲皮苷、龙胆酸、原儿茶酸、没食子
酸甲酯、木犀草素、儿茶素，水飞蓟宾、槲皮素-3-O-
(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷、胡萝卜苷、没食子酸乙
酯等［5-9］。但未见有对其尿液中成分及代谢成分的
鉴别报道。
在本课题组对头花蓼各部位药理筛选实验中，发
现头花蓼经水煮、乙醇沉淀、正丁醇萃取后的部位为
有效组分，主要为黄酮类及酚酸类化合物［10］。本实
验以头花蓼有效组分为研究对象，采用超高效液相色
谱-串联四极杆飞行时间高分辨质谱法(UPLC-Q-
TOF-MS)对头花蓼在大鼠尿液中成分及相应的代谢
产物进行鉴别，探索该药材可能的直接作用物质及其
体内代谢过程，为头花蓼的药效物质研究奠定基础。
1 材料
1290 Infinity型超高效液相色谱系统(美国安捷
伦科技有限公司，包括 1290 Infinity 型二元泵)，
impact Ⅱ型电喷雾四极杆飞行时间质谱仪(ESI-Q-
TOF-MS，美国布鲁克·道尔顿公司)，Allegra 64Ｒ 型
低温高速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)，
MTN-2800D型氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器
有限公司)，EL204 型电子天平［梅特勒-托利多仪器
(上海)有限公司］。
头花蓼药材(贵州威门药业股份有限公司贵州
施秉头花蓼 GAP 种植基地，由贵州医科大学龙庆德
副教授鉴定为蓼科植物头花蓼 Polygonum capitatum
的干燥全草)，没食子酸、原儿茶酸、槲皮苷对照品(贵
州省药物制剂重点实验室天然活性产物研究室制备，
经 UV，IＲ，MS，1H-NMＲ，13C-NMＲ确证结构，经 HPLC
在多个波长检测，峰面积归一化纯度均 ＞98. 0%)，头
花蓼提取物(自制，批号20140307)，乙腈、甲酸为色谱
纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。
健康 SD大鼠，体重(220 ± 20)g，由贵州医科大
学动物中心提供，合格证号 SCXK(黔)2002-0001。
2 方法与结果
2. 1 供试品的制备［10］ 取头花蓼药材，加 10 倍量
水煎煮 3 次，每次 1 h，滤过后合并滤液，减压浓缩至
相对密度 1. 05 ～ 1. 07(50 ℃)，加乙醇至溶液含醇
量达 65%，搅拌均匀，静置 12 h抽滤，滤液减压回收
乙醇并浓缩至相对密度 1. 04 ～ 1. 06(50 ℃);加 1 /2
倍量水饱和的正丁醇提取 3 次，合并正丁醇提取液，
减压回收正丁醇，残留物微波真空干燥，得头花蓼提
取物，计算收膏率 2. 3%。提取物加水超声使溶解，
配成 0. 2 g·mL －1的混悬液，备用。
2. 2 色谱条件 ＲＲHD Eclipse Plus C18色谱柱(2. 1
mm ×100 mm，1. 8 μm)，流动相 0. 1%甲酸水溶液
(A)-0. 1%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脱(0 ～ 10 min，
95% ～ 55% A;10 ～ 14 min，55% ～ 5% A;14 ～ 15
min，5% ～0%A;15 ～ 16 min，0% ～95% A)，柱温 45
℃，流速 0. 3 mL·min －1，进样量 2 μL。
2. 3 质谱条件 电喷雾离子源，扫描方式为负离子
扫描(ESI －，m/z 50 ～ 1 000)，毛细管电压 3 kV，锥
孔电压 80 V，离子源温度 110 ℃，雾化气(N2)压力
120 kPa，流速 8. 0 L·min －1，温度 200 ℃，脱溶剂气
温度 300 ℃，气体体积流量 50 L·h －1，脱溶剂气体积
流量 550 L·h －1，准确质量测定采用甲酸钠校正标准
液，校正模式选用 enhanced quadratic，数据分析为
Data Analysis 软件，Metabolite ToolsTM软件及质量亏
损过滤(MDF)。
2. 4 尿液的收集［11-14］ 选取生长状况相似的健康
SD大鼠 6 只，雌雄各半，正常饲养 1 周，饲养于代谢
笼中，给药前禁食 12 h，自由饮水，收集空白尿样，混
合。按剂量 87 g·kg －1(生药量，剂量选择依据源自
预试验)给予头花蓼提取物，连续灌胃给药 3 d，每
天 2 次，连续收集 2 ～ 72 h 的尿液。置于 － 20 ℃保
存，备用。
2. 5 尿液样品的处理［15］ 取大鼠尿液 0. 5 mL，补
加甲醇 4 mL，涡混震荡 2 min，超声 5 min，于 15 000
r·min －1离心 10 min，取上清液于氮气吹干，温度 37
℃，吹干的样品中加入甲醇 1 mL，按上述处理方法
二次沉淀蛋白，加入 50%甲醇 300 μL 溶解残留物，
UPLC-Q-TOF /MS进样分析。
2. 6 头花蓼提取物尿液中成分及代谢产物的鉴别
运用 Metabolite ToolsTM将 UPLC-Q-TOF /MS 采集
的图谱进行处理，得到生物样品和空白样品的差异
图谱，见图 1。结合已知对照品确定尿液中原型成
分。利用 Metabolite Predict对头花蓼有效组分中多
个原型单体成分进行代谢产物预测，将生成的代谢
产物 MassList导入至 Metabolite Detect中，差异图谱
与 MassList匹配，得到其可能的代谢产物，推测头花
蓼有效组分中各成分在体内可能的代谢途径。
2. 7 尿液中原型成分及相关代谢产物鉴定 尿液
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a．空白尿液;b．给药尿液;c．空白尿液与含药尿液差异图谱
图 1 头花蓼提取物在大鼠尿液中的代谢产物总离子流
Fig． 1 Total ion chromatograms of metabolites of Polygonum
capitatum extract in rat urine
中共鉴别出 3 个头花蓼原型成分，见表 1。根据头
花蓼尿液中成分的结构特征及药物在体内主要发生
的代谢反应，发现头花蓼在大鼠尿液中的 15 个主要
代谢产物，见表 2。
表 1 头花蓼提取物入尿成分
Table 1 Components of Polygonum capitatum extract in rat urine
No． tＲ /min m/z(［M － H］－) 化合物
M6 2. 5 153. 019 2 原儿茶酸
M10 6. 1 447. 093 7 槲皮苷
M13 8. 0 301. 035 1 槲皮素
1. 硫酸化;2. 甲基化
图 3 头花蓼提取物没食子酸在尿液中的主要代谢产物及可能的代谢途径
Fig． 3 Major metabolites and possible metabolic pathways of gallic acid in urine
2. 8 尿液中头花蓼提取物可能的代谢途径［16-19］
根据尿液中 15 个代谢产物及头花蓼提取物中化学
结构，推测尿液样品中以酚酸类成分的硫酸化反应、
甲基化反应为主，还存在以槲皮素为主发生葡萄糖
醛酸化反应，见表 2 和图 2 ～ 4。尿液中主要成分为
原儿茶酸、槲皮素及其代谢产物和没食子酸代谢物，
说明头花蓼直接作用物质可能为原儿茶酸、槲皮素
表 2 头花蓼提取物在尿液中的主要代谢产物
Table 2 Major metabolites of Polygonum capitatum extract in rat
urine
No．
tＲ
/min
m/z
(［M － H］－)
化学式 代谢产物
M1 1. 3 248. 970 2 C7H5O8 S 没食子酸硫酸化
M2 1. 5 248. 969 4 C7H5O8 S 没食子酸硫酸化
M3 1. 7 232. 975 6 C7H5O7 S 原儿茶酸硫酸化
M4 1. 9 262. 985 8 C8H7O8 S 没食子酸甲基硫酸化
M5 2. 2 262. 986 0 C8H7O8 S 没食子酸甲基硫酸化
M7 5. 1 461. 184 6 C15H9O13 S2 槲皮素双硫酸化
M8 5. 4 477. 067 5 C21H17O13 槲皮素葡萄糖醛酸化
M9 5. 8 491. 189 8 C22H19O13 槲皮素甲基葡萄糖醛酸化
M11 6. 7 505. 098 0 C23H21O13 槲皮素二甲基葡萄糖醛酸化
M12 7. 8 519. 078 6 C24H23O13 槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化
M14 8. 1 519. 077 9 C24H23O13 槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化
M15 8. 2 505. 096 6 C23H21O13 槲皮素二甲基葡萄糖醛酸化
M16 8. 7 519. 077 1 C24H23O13 槲皮素三甲基葡萄糖醛酸化
M17 9. 1 329. 066 4 C17H13O7 槲皮素二甲基化
M18 11. 8 343. 082 2 C18H15O7 槲皮素三甲基化
和没食子酸，或其经肝脏代谢的产物。
图 2 头花蓼提取物中原儿茶酸在尿液中的主要代谢产物及可能的
代谢途径(硫酸化)
Fig． 2 Major metabolites and possible metabolic pathways of
protocatechuic acid in urine (sulfation)
3 讨论
本研究连续收集大鼠给药后 2 ～ 72 h 的尿液，
分析头花蓼提取物在大鼠体内的生物转化规律，此
法能全面反映头花蓼在大鼠体内的整个代谢过
程［11-14］。实验中分别采用正模式、负模式对样品进
行检测，结果发现生物样品在负模式下各色谱峰响
应较好，这可能与所检测到的色谱峰中含有多个羟
基，且大量代谢物色谱峰中连有葡萄糖醛酸基团、硫
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1. 葡萄糖醛酸化;2. 甲基化;3. 二甲基化;4. 二硫酸化
图 4 头花蓼提取物中槲皮素在尿液中的主要代谢产物及可能的代谢途径
Fig． 4 Major metabolites and possible metabolic pathways of quercetin in urine
酸基团等有关。
本研究建立了 UPLC-Q-TOF /MS 分析头花蓼提
取物在大鼠尿液中代谢产物的检测方法，鉴别出尿
液中 3 个原型成分及 15 个代谢产物，推测尿液样品
中以酚酸类成分的硫酸化反应、槲皮素甲基葡萄糖
醛酸化反应为主，与文献报道的原儿茶酸、没食子酸
和槲皮素的代谢产物一致［16-19］。头花蓼主要成分
的体内代谢过程可进一步通过水解尿液中的Ⅱ相代
谢产物及相关药效学实验得以证实。本文通过检测
头花蓼提取物中化学成分在尿液中的情况，为后续
的药动学及药效物质基础研究提供参考。
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［责任编辑 刘德文］
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