全 文 ：doi:10.3969/ j.issn.1002-7351.2009.02.027
人心果原生质体分离初探
罗丽华 ,杨定海 ,林尤河 ,王业华
(海南大学园艺园林学院 ,海南 海口 570228)
摘要:以人心果幼嫩叶片组织为材料 , 研究了酶液组合 、酶解时间 、酶液中甘露醇含量 、pH 值 、温度等因素对其原生质体分
离的影响 ,结果表明:以 3%纤维素酶 R-10+0.4%果胶酶 Y-23 为混合酶液 , 0.6 mol·L-1甘露醇为渗透压稳定剂 , pH 5.6
的酶液组合 ,在 28℃的黑暗条件下振荡 ,酶解时间 2 h ,分离出的原生质体产量最佳 , 可达到 12.4×106个·g-1 。
关键词:人心果;原生质体分离;原生质体产量
中图分类号:S667.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2009)02-0127-04
Preliminary Study on the Protoplasts Isolation of Manilkara zapota
LUO Li-hua , YANG Ding-hai , LIN You-he, WANG Ye-hua
(Horticulture and Garden College of Hainan University , Haikou 570228 , Hainan , China)
Abstract:The tender leaves of Manilkara zapota were used as experiment ma terials and the influences of enzyme solution combina-
tio ns , zymohydrolysis time and mannitol concentration in the enzyme solution , pH value , and temperature on protoplast isolation
w ere studied.The results show ed that the highest yield(12.4×106/g)was obtained by treating the leaves with a mix ture of 3%
of cellulose enzyme R-10+0.4% of pectase Y-23 with pH value of 5.6 fo r 2h of zymohydrolysis time at the temperature of 28℃,
and on the oscillation condition with 0.6 mol·L-1 of mannitol as the o smotic pressure stabilizer.
Key words:Manilkara zapota ;pro toplast iso lation;pro toplast yield
　　人心果(Manilkara zapota)为山榄科(Sapotaceae)人心果属[ 1] ,原产墨西哥和中美洲地区 。我国所栽
培的人心果是 20世纪初从新加坡 、印度尼西亚等国引入 ,约有百年历史 ,分布于广东 、广西 、福建 、海南 、台
湾等省 。人心果用途广泛 ,果实可以食用 ,乳汁可制成口香糖的胶料[ 2] ,树根 、皮 、叶均可供药用 ,同时也
是优良的观赏树木。
我国在人心果种质资源保存 、优良品种培育 、栽培管理技术及生理学等方面做了大量研究工作 ,取得
了一定成果;但人心果的基础研究比较薄弱 ,研究工作起步较晚 ,与国外相比有较大差距 ,而关于它的原生
质体研究 ,至今未见报道[ 2 ,3] 。
原生质体的分离 ,是植物原生质体培养的基础 。要获得高产优质的原生质体 ,必须研究影响植物原生
质体分离过程的各种因素 ,如酶浓度及组合 ,酶解时间等[ 4] 。本研究探讨了影响人心果原生质体分离过
程的各种因素 ,建立了获得高产量 、优质的人心果原生质体的方法 ,为原生质体培养及高效再生系统的建
立奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　实验材料
实验材料为海南大学农学园人心果椭圆形果类型的嫩叶片 ,每次试验重复 3次 ,取平均值 。
1.2　实验方法
1.2.1　原生质体分离方法　采用酶解法进行分离 ,所采用的酶为纤维素酶 R-10(国药集团化学试剂有限
公司生产 ,活性为 15万 U·g -1)和果胶酶 Y-23(Sigma公司 ,活性为 1.1 U·mg-1)。
　收稿日期:2008-09-11;修回日期:2009-01-14
　作者简介:罗丽华(1974-), 女 ,福建连城人 , 海南大学讲师 ,硕士研究生 , 从事植物学和植物生理学教学科研工作。
　通讯作者:杨定海(1975-), 男 ,陕西宝鸡人 , 海南大学讲师 ,硕士研究生 , 从事植物景观研究与教学工作。
第 36 卷 第 2 期
2 0 0 9 年 6 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.36　No.2
Jun., 2 0 0 9
1.2.2　原生质体产量的测定　原生质体产量用血球计数板计数 ,以每 g 鲜重的起始材料分离得到的原
生质体个数(个·g-1)来表示 ,计算方法:
悬浮液中的原生质体数/mL=1个大方格悬浮液中的原生质体数×10×1 000
原生质体产量=悬浮液中的原生质体数/mL ×总体积 。
1.3　实验设计
1.3.1　最佳酶组合的确定　将人心果的叶子用剪刀剪下 ,用蒸馏水洗过 ,待叶面干后 ,用砂纸轻轻磨去下
表皮 ,用剪刀剪成宽 1 ～ 2 mm ,重约 0.2 g 的小片 ,放入不同浓度的纤维素酶(质量分数分别为 0.5%、1%、
1.5%、2%、3%、4%)和果胶酶(质量分数分别为 0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)的混合酶液中 ,在黑
暗处酶解 2 h ,在显微镜下观察原生质体分离情况 ,以确定纤维素酶与果胶酶的最佳浓度配比 。
1.3.2　最佳酶处理时间的确定　将叶片转入最佳酶组合液中 ,设 2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、10 h 、12 h共 6个时间
处理 ,比较不同处理时间对叶片原生质体产量和细胞碎片的影响 ,以确定最佳酶解时间。
1.3.3　最佳甘露醇浓度的确定　将叶片转入最佳酶组合液+不同浓度甘露醇的 CPW的酶液中 ,在暗处
分离最佳的酶解时间 ,甘露醇的浓度设 0.2 mol·L-1 、0.4 mol·L-1 、0.6 mol·L-1 、0.8 mol·L-1 、1.0 mol·
L-1 5个处理 ,比较不同浓度的甘露醇对叶片原生质体产量和细胞碎片的影响 ,以确定酶液中最佳甘露醇
浓度 。
1.3.4　最佳 pH值的确定　将叶片转入最佳酶组合液+最佳甘露醇浓度的 CPW 的酶液中 ,在暗处分离
最佳的酶解时间 ,把配好的混合酶液的 pH 值调成为 4.5 、 4.7 、 5.0 、5.2 、 5.4 、 5.6 、 5.8 、 6.0共 8个处
理 ,比较不同 pH 值对叶片原生质体产量的影响 ,确定最佳 pH值 。
1.3.5　最佳温度的确定　将叶片转入最佳酶组合液+最佳甘露醇浓度+最佳 pH 值的 CPW 的酶液中 ,
在不同温度条件下静置处理最佳酶解时间 ,温度设 25℃、28℃、30℃、35℃4个处理 ,比较在不同温度条件
下原生质体产量 ,以确定最佳温度 。
2　结果与分析
2.1　酶类组合对叶片原生质体分离的影响
酶类组合是影响原生质体分离的最重要因素
之一 ,不同浓度的酶液组合对叶片原生质体产量及
活性的影响明显不同 。
从表 1可以看出 ,纤维素酶质量分数<2%时 ,
原生质体产量极低甚至未发生酶解 ,随着纤维素酶
的浓度增大 ,原生质体的产量明显增加 ,细胞碎片
也增多 ,纤维素酶质量分数为 3%时 ,原生质体数
量最多 ,但当纤维素酶质量分数增大到 4%时 ,原
生质体的产量反而下降 ,细胞碎片明显增多 ,这说
明酶液在解离细胞壁的同时 ,高浓度酶液对原生质
体也有一定的毒害作用。
当纤维素酶质量分数为 3%,果胶酶质量分数
为 0.2%～ 0.4%时 ,原生质体的数量最多;当果胶
酶的质量分数为 0.6%时 ,原生质体的数量减少 ,
细胞碎片增加。进一步对纤维素酶 3%+果胶酶
0.2%～ 0.4%进行实验 , 结果见表 2。由表 2可
知 ,随着果胶酶的浓度增加 ,原生质体的数量增加 ,
当果胶酶的质量分数为 0.4%时 ,原生质体的产量
最大 ,达到 4.6×106 个·g-1 FW 。综上所述 ,纤维
表 1　纤维素酶对叶片原生质体的影响
纤维素酶/ % 果胶酶/ % 观察酶解情况 细胞破碎情况
0.5 0.05 - -
0.5 0.1 - -
0.5 0.2 - -
1.0 0.05 - -
1.0 0.1 - -
1.0 0.2 - -
1.5 0.05 - -
1.5 0.1 - -
1.5 0.2 + -
2 0.2 + -
2 0.3 ++ +
2 0.4 ++ +
3 0.2 +++ +
3 0.3 +++ +
3 0.4 +++ +
3 0.6 ++ ++
4 0.3 ++ ++
4 0.4 ++ ++
4 0.6 ++ +++
＊:-为没有 , +为少量 , ++为较多 , +++为很多 , 下同。
·128· 福 建 林 业 科 技 第 36 卷
素酶∶果胶酶=3%∶0.4%为最佳酶液配比。
2.2　酶处理时间对叶片原生质体分离的影响
从表 3可以看出 ,酶解时间对原生质体的产量
和质量有明显影响 ,酶解 2 ～ 4 h内 ,随时间的延长
原生质体的产量增加 ,6 h与 8 h比较增加不显著 ,
10 h后原生质体数量减少 ,细胞碎片明显增加 ,这
一方面说明 2 ～ 4 h的酶解时间已接近人心果的原
生质体的产量最高值 。另一方面证明了长时间(10
h以上)酶解对细胞有负面作用。综合上述因素 ,
人心果叶片分离酶解的时间应以 2 h为宜 。
2.3　甘露醇浓度对叶片原生质体分离的影响
甘露醇是原生质体分离的渗透稳定剂 ,甘露醇
的浓度对原生质体产量影响较大。由表 4 可以看
出 ,在甘露醇浓度为 0.2 ～ 1.0 mol·L-1的范围内 ,
随着酶液浓度的增大 ,原生质体的产量呈逐渐上升
的趋势 ,这是由于当溶液渗透压低于原生质体内部
渗透时 ,部分原生质体因过分吸胀而破裂 ,随着溶
液渗透压的提高 ,原生质体内外渗透压逐渐趋于平
衡 ,因吸胀而破裂的原生质体比例逐渐减小 ,产量
则稳步提高。从原生质体的形态来看 ,在甘露醇浓
度为 0.2 mol·L -1及 0.4 mol·L-1时 ,获得的原生
质体的体积过分膨胀破裂 , 1 ～ 2 h 后多数原生质
体破裂解体 ,显然此时的渗透压远低于细胞内部的
渗透压 ,不适于用来解离原生质体 。甘露醇浓度为
表 2　3%纤维素酶和不同浓度果胶酶组合
对人心果嫩叶原生质体分离的影响
果胶酶/ % 产量/ ×106 个·g-1 FW 观察酶解情况 细胞碎片
0.20 0.25 + +
0.30 0.54 ++ ++
0.40 4.60 ++++ ++
表 3　酶解时间对人心果原生质体分离的影响
酶解时间/h 产量/ ×106个·g-1 FW 观察酶解情况 细胞碎片
2 4.60 ++++ +
4 3.80 +++ ++
6 3.80 +++ ++
8 2.50 ++ +++
10 1.60 + ++++
12 1.28 + +++
表 4　不同甘露醇浓度对人心果原生质体分离的影响
甘露醇
/mol·L-1
产量
/ ×106个·g-1 FW 细胞碎片 原生质体形态
0.20 0.88 ++ 膨胀
0.40 1.28 ++ 膨胀
0.60 12.40 + 完好
0.80 9.30 + 完好
1.00 5.30 +++ 收缩
0.6 mol·L-1及 0.8 mol·L-1时 ,解离出的原生质体形态完整 、饱满 、清晰可见 ,在离心洗涤过程中原生质
体稳定完好 ,破损率低 ,12 h后原生质体的体积略有膨胀 ,而后拉长 ,变形 ,开始分裂 。甘露醇浓度为 1.0
mol·L-1时 ,所得原生质体产量高 ,离心洗涤过程中不易破裂 ,但原生质体的体积有所收缩 ,原生质体不能
膨胀变形 ,逐渐褐化死亡 。结果表明 ,当甘露醇浓度为 0.6 mol·L-1时 ,获得的原生质体质量最好 ,浓度过
高或过低对原生质体均有损伤 ,不利于以后的培养 。
2.4　pH 值对叶片原生质体分离的影响
从表 5可以看出 ,pH 值对人心果原生质体分离有明显的影响 , pH值在 4.5 ～ 5.6范围内 ,随着 pH 值
的增加 ,原生质体分离的产量也随之增加 , pH 值到 5.6 时为最高 ,而后随着 pH 值的升高而产量下降 ,呈
抛物线形变化。
表 5　不同 pH 值对人心果原生质体分离的影响
pH 值 4.5 4.7 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0
观察酶解情况 + ++ ++ +++ +++ ++++ +++ ++
原生质体产量/ ×106 个·g -1 FW 4.5 4.7 4.8 4.7 4.8 6.0 5.0 4.85
镜检密度 松散 密 密 紧密 紧密 较紧密 紧密 松散
2.5　温度对叶片原生质体分离的影响
温度影响酶的活性 ,由表 6可以看出 ,静置条件下 25 ～ 35℃温度对原生质体的产量影响不明显 ,没有
明显变化 ,但是在相同温度下 ,与振荡酶解相比 ,静置的酶解方式得到的原生质体产量低。综合原生质体
的产量和原生质体状态可以看出 ,振荡条件下最佳的酶解温度为 28℃。
·129·第 2 期 罗丽华 , 等:人心果原生质体分离初探
表 6　不同温度对人心果原生质体分离的影响
温度℃ 振荡 100 r·min
-1 静置
观察酶解情况 镜检密度 观察酶解情况 镜检密度
25 + 松散 + 松散
28 ++++ 紧密 + 松散
30 +++ 密 + 松散
35 ++ 密 ++ 松散
3　结论与讨论
影响原生质体的产量和活性的因素有多种 ,如植物材料的生理状态 、解离原生质体的酶组合 、酶解时
间 、酶解温度 、酶液中甘露醇的浓度 、酶液 pH 值等 。对分离效果影响最大的则是酶液浓度和酶解时间 。
酶液浓度过大 ,会影响原生质体的活力和分裂能力 ,且原生质体破裂数增多;酶解时间过长 ,同样会导致较
早分离出的原生质体破裂 。
适宜的酶浓度以及酶解时间因植物的种类不同有较大差异 ,如沈前华等[ 5]在分离大花惠兰叶片原生
质体时所用的酶组合是 1.0%纤维素酶+0.3%果胶酶+0.2%半纤维素酶 ,刘欣佳等[ 6]将金线莲叶片在
1%的离析酶和 2%的纤维素酶的组合中连续振荡 5 ～ 6 h能获得大量活力较高的原生质体;黄枝英等[ 7]分
离荔枝转基因胚性愈伤组织在 8 g·L-1纤维素酶和 4 g·L -1离析酶的酶组合中连续振荡 10 ～ 11 h能获得
大量活力较高的原生质体 。
本试验采用人心果幼叶为材料解离原生质体 ,结果表明 ,人心果的幼叶用 3%纤维素酶+0.4%果胶
酶的 CPW酶解液振荡 2 h的条件下获得大量活力较高的原生质体。
实验过程中发现若分离的原生质体未保存在等渗溶液中 ,则原生质体很快会破碎形成原生质体碎片 。
原生质体由于失去了细胞壁的保护而变得非常脆弱 ,极易受渗透压的影响而导致质膜破裂 。因此酶混合
液中必须含有一定浓度的质膜稳定剂与渗透压稳定剂(甘露醇),保持较高的渗透压以使原生质体在分离
前细胞处于质壁分离状态 ,分离之后不致膨胀破裂 ,从而提高原生质体的产量。酶液中适当浓度的稳渗剂
能防止脱壁的原生质体发生破裂 ,起到保护作用。加入甘露醇做渗透稳定剂可以高效分离原生质体。本
实验结果表明 ,适合人心果原生质体分离的甘露醇浓度为 0.6 mol·L -1 。
温度对原生质体制备有双重影响 ,随着温度的提高 ,一方面酶解反应速度加快;另一方面 ,酶蛋白逐渐
变性 ,而且温度过高也会影响原生质体的稳定性。过酸或过碱也影响原生质体的稳定性 ,从而影响原生质
体的制备效率。本实验结果表明 ,适合人心果原生质体分离的最适温度为 28℃,最适 pH 值为 5.6。
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