全 文 ：张 虹，白红丽，张江梅，等． 青叶胆不同部位总黄酮提取及其抑菌作用［J］． 江苏农业科学，2013，41(9) :224 － 226．
青叶胆不同部位总黄酮提取及其抑菌作用
张 虹1，白红丽2，张江梅1，计红旭1，王宝森3，郭俊明2
(1．红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661100;2．云南民族大学 /民族药资源化学国家民委 －教育部重点实验室，云南昆明 6505002;
3．红河学院理学院，云南蒙自 661100)
摘要:以青叶胆为材料，采用乙醇溶剂冷浸法对青叶胆茎叶、根中的总黄酮进行提取，并研究了其抑菌作用。结果
表明:对于青叶胆茎叶，采用 80%乙醇溶液浸提 3 d，总黄酮得率最高，为 5． 71%;对于青叶胆根，采用 80%乙醇溶液浸
提 2 d，总黄酮得率最高，为 5． 09%;茎叶的总黄酮得率高于根。青叶胆总黄酮提取液对金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢
杆菌、大肠杆菌都有一定抑菌作用，抑菌效果大小依次为:金黄色葡萄糖球菌 ＞枯草芽孢杆菌 ＞大肠杆菌。
关键词:青叶胆;总黄酮;提取;抑菌作用
中图分类号:Ｒ282． 71 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)09 － 0224 － 02
收稿日期:2013 － 03 － 03
基金项目:国家自然科学基金(编号:51262031) ;民族药资源化学国
家民委 －教育部重点实验室开放基金(编号:MZY1105) ;红河学院
植物保护硕士点建设项目。
作者简介:张 虹(1962—) ，女，云南昆明人，教授，从事生物技术研
究。E － mail:zh_biology2@ 126． com。
通信作者:郭俊明，硕士，教授，从事无机非金属材料及生物无机化学
研究。E － mail:guojunming@ tsinghua． org． cn。
青叶胆(Swertia mileensis T． N． Ho et W． L． Shih)为龙胆
科獐牙菜属一年生直立小草本，别名肝炎草、苦胆草、弥勒獐
牙菜、肝尖草等，主要分布于云南省红河州弥勒市、开远市等
地［1］。青叶胆含有黄酮类、环烯醚萜苷类、内酯、齐墩果酸等
化合物［2 － 3］，其性寒，味苦、甘;归肝、胆、膀胱经;能清肝利胆，
清热利湿，是治疗肝炎的特效药［4 － 7］。本研究采用不同浓度
乙醇对青叶胆中的总黄酮进行提取，并研究了其抑菌作用，旨
在为青叶胆的进一步研究提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
新鲜青叶胆全草购于红河州蒙自草药市场。
供试菌种包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌
(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ，由
红河学院生命科学与技术学院实验室提供。
1． 2 仪器及主要试剂
仪器:UV －4802S 型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯
仪器有限公司)。
试剂:芸香苷标准品，乙醇、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧
化钠、牛肉膏、蛋白胨、琼脂等试剂均为分析纯。
1． 3 方法
1． 3． 1 青叶胆总黄酮液的提取方法 将新鲜全株青叶胆洗
净，将茎叶、根分别剪成小段，置于电热恒温鼓风干燥箱中
80 ℃ 干燥 6 h，用高速粉碎机粉碎，备用。
1． 3． 1． 1 波长选择 选取标准溶液和样品提取液进行波长
扫描，结果表明标准溶液和样品提取液在 510 nm有最大吸收
峰，故选择 510 nm作为测定波长。
1． 3． 1． 2 标准工作曲线制备［8］ 称取于 120 ℃恒温干燥至
恒重的芸香苷标准品 25． 0 mg，置 100 mL 容量瓶中，加入适
量 60 ℃的 50%乙醇使其溶解。加 50%乙醇定容至刻度，摇
匀。此时标准品溶液浓度为 0． 25 mg /mL。
分别吸取标准品溶液 0、0． 5、1、2、3、4、5 mL，置于 25 mL
容量瓶中。在每个容量瓶中加入 50%乙醇约 5 mL，摇匀。分
别加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。再加 10%硝
酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。加 4% NaOH 溶液 10 mL，
加 50%乙醇或甲醇定容至刻度，摇匀，放置 15 min。同时以
试剂空白作参比。在 510 nm波长处测定溶液的吸光度。
以吸光度值 D为纵坐标，浓度 C(μg /mL)为横坐标，绘制
标准曲线，得到线性回归方程为 D = 0． 009C － 0． 0011，r2 =
0. 999 6。
1． 3． 1． 3 样品提取液的制备 分别称取青叶胆茎叶、根干粉
2 g置于 100 mL 三角瓶中，再分别加入浓度为 30%、50%、
70%、80%、90%的乙醇 50 mL，分别浸提 1、2、3、4 d，过滤，用
相应浓度乙醇溶液将滤液定容至 100 mL，为样品提取液。
1． 3． 1． 4 青叶胆总黄酮含量的测定 分别吸取根、茎叶样品
提取液 1 mL，置于 25mL 容量瓶中，按“1． 3． 1． 2”方法操作，
在 510 nm波长处平行测定 3 次，同时以样品空白作参比。根
据回归方程计算总黄酮含量［8］。
总黄酮得率 =［提取液浓度(mg /mL)×稀释倍数 ×体积
(mL)÷样品干重(g)÷ 1 000］× 100%
1． 3． 2 青叶胆总黄酮提取液抑菌方法
1． 3． 2． 1 供试菌株的活化 无菌条件下将供试菌种接入细
菌培养基上，置于(37 ± 1)℃恒温培养箱内培养 18 ～ 24 h，进
行菌种活化，取第 3 代备用。
1． 3． 2． 2 菌悬液的制备 在相应的试管斜面培养基上取活
化培养好的菌株，分别用接种环挑取少许菌体置于装有 9 mL
无菌水的试管内，摇匀，使菌悬液菌数为 l × 108 个 /mL。
1． 3． 2． 3 抑菌圈测定［9 － 10］ 用 0． 2 mL 菌悬液涂布于细菌
培养基上，用已灭菌的滤纸片(直径 6 mm)分别浸在总黄酮
提取率最高的提取液(80%乙醇浓度的青叶胆茎叶总黄酮提
取液)、对照液(0． 9%的生理盐水)、80%乙醇中 12 h后，用无
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DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.09.034
菌镊子夹取浸有提取液和对照液的滤纸片于平板培养基表
面，置于 37 ℃培养 24 h，测定抑菌圈直径。
1． 3． 2． 4 青叶胆黄酮粗提取液最小抑菌浓度(MIC)［9］ 无
菌条件下，将青叶胆总黄酮提取液分别稀释成 10． 00%、
5. 00%、2． 50%、1． 25%、0． 63%、0． 59%、0． 30%的系列溶液，
分别放入 7 个灭过菌的试管中。向各平皿中分别加入不同浓
度的青叶胆总黄酮提取液各 2 mL，倒入已灭菌且温度为 40 ～
50 ℃ 的培养基，充分混匀，待培养基凝固后，分别移取各菌
悬液 0． 1 mL，均匀涂抹在培养基上，于 37 ℃恒温培养箱内培
养 24 h。以不长菌的最低浓度为提取液的最小抑菌浓度，每
种细菌、每个浓度设 3 次重复。
2 结果与分析
2． 1 乙醇浓度和浸提时间对青叶胆总黄酮提取的影响
由图 1、图 2 可知，在相同浸提时间内，乙醇浓度为 30%
～80%时，青叶胆茎叶、根的总黄酮得率均随乙醇浓度的增加
而增加;乙醇浓度 90%下的总黄酮得率略低于乙醇 80%下的
总黄酮得率，乙醇浓度为 80%时总黄酮得率为最高，其次是
乙醇浓度为 90%的总黄酮得率，乙醇浓度为 30%时总黄酮得
率最低。
在相同乙醇浓度、不同浸提时间下青叶胆根、茎叶的总黄
酮得率有差别，浸提时间为 1 d下的总黄酮得率最低。
乙醇浓度为 30%、50%时，青叶胆茎叶在浸提 2 d时总黄
酮得率最高;乙醇浓度为 70%、80%时，青叶胆茎叶在浸提
3 d 时总酮得率最高;乙醇浓度为 90%时，青叶胆茎叶在浸提
4 d时总黄酮得率最高。
乙醇浓度为 30%、50%、70%时，青叶胆根浸提 4 d 时总
黄酮得率最高;乙醇浓度为 80%、90%时，青叶胆根浸提 2 d
时总黄酮得率最高。
2． 2 青叶胆总黄酮提取液对 3 种细菌的抑制效果
由表 1、表 2 可见，随着青叶胆总黄酮粗提取液浓度的增
加，其抑菌作用也随之增强。金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆
菌、大肠杆菌的 MIC值分别为 0． 63%、2． 50%、5． 00%。抑菌
圈测定结果表明，金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，其次是枯草
芽孢杆菌，大肠杆菌的抑菌作用最弱，表明随着总黄酮含量的
增加，抑菌作用也在增加。
表 1 青叶胆黄酮粗提取液抑菌效果
菌类
抑菌圈直径(mm)
总黄酮提取液 80%乙醇溶液 0． 9%生理盐水
金黄色葡萄球菌 10． 97 7． 17 －
枯草芽孢杆菌 9． 99 7． 17 －
大肠杆菌 7． 97 7． 17 －
注:“ －”表示无抑制作用。
表 2 青叶胆黄酮粗提取液对试验菌的最低抑制浓度
试验菌
青叶胆提取液浓度
10． 00% 5． 00% 2． 50% 1． 25% 0． 63% 0． 59% 0． 30%
金黄色葡萄球菌 － － － － － + +++
枯草芽孢杆菌 － － － + +++ +++ ++++
大肠杆菌 － － + ++ +++ +++ +++
注:“ －”表示无菌生长;“ +”表示有少量菌体生长;“ ++”表示有不超过 1 /3 平皿面积的菌体生长;“ +++”表示有不超过 1 /2 平皿面积
的菌体生长;“ ++++”表示有超过 1 /2 平皿面积的菌体生长［9］。
3 结论与讨论
本研究表明，乙醇浓度为 80%时青叶胆根和茎叶的总黄
酮得率最高，茎叶浸提时间以 3 d 为宜，根浸提时间以 2 d 为
宜。青叶胆茎叶、根的总黄酮得率最高值分别为 5． 17%、
5. 07%。乙醇浓度为 30%、浸提 1 d的总黄酮得率最低，青叶
胆茎叶、根的总黄酮得率最低值分别为 4． 07%、2． 47%，茎叶
的总黄酮提取率高于根。
青叶胆总黄酮提取液对金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆
菌、大肠杆菌都有一定抑制作用，以对金黄色葡萄糖球菌的抑
制效果最强，其次是对枯草芽孢杆菌，对大肠杆菌的抑制效果
最弱。这可能与革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞壁结构组
分不同有关，革兰氏阳性菌细胞壁化学成分主要是由肽聚糖
和磷壁酸构成，结构简单;而革兰氏阴性菌细胞壁除含有少量
肽聚糖外，还含有蛋白质、类脂质、脂多糖，因此一般阳性菌对
理化因子的敏感性比阴性菌更强，从而受总黄酮抑制的作用
更明显［10］。
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櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
参考文献:
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祝海娟，赵晨霞，张翌楠，等． 酶法提取大麦虫蛋白质的研究［J］． 江苏农业科学，2013，41(9) :226 － 229．
酶法提取大麦虫蛋白质的研究
祝海娟1，赵晨霞2，张翌楠2，刘沐阳2，彭旭嗣2，霍卫东2
(1．新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 843001;2．北京农业职业学院园艺系，北京 102442)
摘要:为研究大麦虫蛋白质提取的最佳生产工艺，采用酶法从大麦虫蛹中提取大麦虫蛋白。根据碱性蛋白酶、中
性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶 5 种酶制剂对大麦虫蛋白提取率的影响，确定碱性蛋白酶为最佳酶制剂。
通过单因素试验和正交试验，得到碱性蛋白酶提取大麦虫蛋白的最佳条件为加酶量(E /S)5%、pH 值 12、料液比
1 g ∶ 20 mL、提取温度 50 ℃、提取时间 2． 5 h，在此条件下得到大麦虫蛋白的提取率为 86． 96%，大麦虫蛋白含量 75．
01%。该工艺合理，重复性好，可为大麦虫蛋白质提取工艺的确定提供试验依据。
关键词:酶法;大麦虫;蛹;蛋白质;提取率
中图分类号:TS201． 2 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)09 － 0226 － 04
收稿日期:2013 － 02 － 15
基金项目:国家公益性行业科研专项(编号:200904025) ;北京市教育
委员会科技发展计划(编号:KM200900005002) ;北京市农业科技
项目(编号:20110115) ;北京市自然科学基金(编号:6122024)。
作者简介:祝海娟(1987—) ，女，江苏如皋人，硕士研究生，研究方向
为昆虫蛋白。E － mail:119333909@ qq． com。
通信作者:赵晨霞，硕士，教授，研究方向为果蔬贮藏与加工。
E － mail:chenxiazhao@ sina． com。
我国昆虫资源十分丰富，资源昆虫大麦虫别称麦片虫、麦
谷虫或超级面包虫，它不仅是生理、遗传学的试验材料，而且
是营养丰富的高蛋白质资源。据 Finke 报道，与家蝇、黄粉虫
幼虫、蟋蟀、蚕蛹幼虫等比较，大麦虫的蛋白质及蛋氨酸的含
量均居首位，是一种不可多得的蛋白源昆虫［1］。大麦虫的各
虫态都含有较丰富的营养，其中大麦虫幼虫含蛋白质 51%，
含脂肪 29%，并含有多种糖类、氨基酸、维生素、激素、酶及矿
物质磷、铁、钾、钠、钙等。目前，越来越多的人选购大麦虫作
为名贵观赏鱼、捕食性动物和两栖爬行类宠物的专用饵
料［2］，而在食品、医药保健品及生物活性肽方面的开发利用
还处于初始阶段。
蛋白质由于其特定的功能性质广泛用于食品领域［3］。
近年来科学研究发现，人类摄取蛋白质后的消化产物更容易
被人体吸收利用，而且具有各类生物活性，这些就是肽［4］。
酶法提取蛋白质是利用蛋白酶对蛋白质的降解和修饰，使其
变成可溶肽而被抽提出来［5］。用酶提取蛋白质，反应条件温
和［6 － 8］，副反应少，不破坏氨基酸，保证了蛋白质的质量，且不
污染环境，对蛋白质有改性作用，蛋白质经酶水解有助于拓宽
蛋白质的应用范围［9 － 10］。
大麦虫为节肢昆虫，甲壳质含量较高［11］，为了促进机体
对其蛋白质的吸收及利用，并使消费者在心理上易于接受大
麦虫制品，本试验采用酶法从大麦虫蛹中提取蛋白质，确定蛋
白酶提取大麦虫蛋白的最佳工艺参数，以期为大麦虫蛋白质
的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
1． 1． 1 材料 大麦虫蛹，由北京农业职业学院生物防治研究
所资源昆虫研究室提供，在常规条件下饲养并适时取样。
1． 1． 2 试剂 中性蛋白酶:活力≥60 000 U /g，生化试剂级，
北京德诺奥生物技术有限责任公司分装;碱性蛋白酶:活力≥
100 000 U /g，生化试剂级，北京德诺奥生物技术有限责任公
司分装;木瓜蛋白酶:活力≥0． 5 ～ 2 U /mg，生化试剂级，美国
AMＲESCO公司生产;胰蛋白酶:活力≥250 NF /mg，生化试剂
级，美国 AMＲESCO公司生产;胃蛋白酶:活力≥1 200 U /g，生
化试剂级，北京德诺奥生物技术有限责任公司分装;氢氧化
钠、浓盐酸、36%浓硫酸、五水合硫酸铜、硫酸钾、甲基红、溴甲
酚绿、95%乙醇等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限
公司。
—622— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 9 期