全 文 ：锡叶藤根中总酚提取工艺及没食子酸含量测定*
笪舫芳，朱华，滕建北，梁惠娴，陈色园
(广西中医药大学药学院，南宁 530001)
摘 要 目的 建立锡叶藤根中总酚的最佳提取工艺及没食子酸的含量测定方法。方法 以总酚和没食子酸含量
为考察指标，通过正交实验优选溶剂浓度、液料比、提取时间及提取次数 4个工艺参数。结果 最佳提取工艺为采用超
声提取法，9倍量 55%丙酮提取 2次，每次 25 min。结论 该方法提取锡叶藤根中总酚和没食子酸，提取效率高，稳定性
良好，可用于锡叶藤根的质量控制及定量分析。
关键词 锡叶藤根;总酚;没食子酸;含量测定
中图分类号 Ｒ282．71; Ｒ927．2 文献标识码 B 文章编号 1004－0781( 2016) 01－0075－04
DOI:10．3870 / j．issn．1004－0781．2016．01．019
Technology for Total Polyphenols Extraction and Determination of Gallic Acid from
Tetracera asiatic
DA Fangfang，ZHU Hua，TENG Jianbei，LIANG Huixian，CHEN Seyuan(College of Pharmacy，Guangxi
University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China)
ABSTＲACT Objective To establish an optimal technology for total polyphenols extraction and a method for
determination of gallic acid from Tetracera asiatic． Methods In regarding to the content of total polyphenols and gallic acid，
orthogonal test was adopted to optimize the four different factors in extraction process，including volume fraction，ratio of solid-
liquid，extraction duration and extraction frequency． Ｒesults The optimal extraction technology was applying ultrasonic
extraction，extracting twice，25 minutes each time with 9 times the amount of 55% acetone． Conclusion This extraction process
produces high yield of total polyphenols and gallic acid，it is stable，and the method established can be used for the quality control
of total polyphenols and gallic acid in Tetracera asiatica．
KEY WOＲDS Tetracera asiatica;Total polyphenols;Gallic acid;Content determination
锡叶藤药材始载于《常用中草药手册》［1］，为五桠
果科植物锡叶藤［Tetracera asiatica(Lour．)Hoogland］
的根、茎或叶，性凉，味苦涩，具有收涩、止泻、固精、消
肿、镇痛的功效［1-4］。锡叶藤为大型木质藤本植物，主
要分布于广西、广东、云南等热带及亚热带地区，生长
在低海拔山地的疏林和灌木丛中［5］，是广西壮族民间
常用的药材［2］，根据民间用药实际调查，其药用部位
多为根［6］。它的主要成分有黄酮类化合物、多酚类、
多糖、有机酸等［7-8］。实验研究表明，多酚类化合物具
有抑菌、抗炎等药理作用，在锡叶藤中含量很高，该类
收稿日期 2014－10－09 修回日期 2014－11－17
基金项目 * 广西中医药管理局项目(GZPT1204);广西自
然科学基金创新团队项目(2011GXNSFF018006);广西壮瑶药
重点实验室(桂科基字［2014］32号);壮瑶药协同创新中心(桂
教科研［2013］20 号);广西重点学科(壮药学)(桂教科研
［2014］14号);“中药创新理论与药效研究”八桂学者项目
作者简介 笪舫芳(1987－)，女，贵州人，助理讲师，硕士，
研究方向:中药及民族药的鉴定与开发。电话:0771－3137535，
E-mail:604178071@ qq．com。
通信作者 朱华(1959－)，男，广西柳州人，教授，博士，研
究方向:中药品种、质量及资源开发研究工作。电话:0771 －
3137535，E-mail:zhuhua@ gxtcmu．edu．cn。
成分可能是其收敛止泻作用的主要生物活性成分。多
酚的经典测量方法有很多，如比色法、质量法、容量法、
folin-酚法等，笔者根据前期预实验的结果，选择使用稳
定、便捷的 folin-酚法对锡叶藤中的总多酚进行测定，以
没食子酸和总酚含量为考察指标，采用正交实验优选最
佳提取工艺，为锡叶藤的开发利用提供理论依据。
1 仪器与试药
1．1 仪器 Agilent8453 紫外-可见分光光度计(美国
安捷伦科技公司)、Millipore Simplicity-185 超纯水仪
(美国 Millipore 公司)、BP2llD 电子分析天平(德国
Sartorius公司，天平感量:0．01 mg)。
1．2 试药 乙醇、丙酮均为分析纯(上海国药集团化学
试剂有限公司)，乙腈为色谱纯(美国 fisher公司)，folin-
酚试剂(北京索莱宝科技有限公司)，无水碳酸钠(上海
实验试剂有限公司)，水为超纯水。没食子酸对照品(中
国食品药品检定研究院，含量≥98%，批号:110831-
200302，供含量检测使用)。样品采自广西武鸣、上思、
东兴等地，经广西中医药大学药学院药用植物教研室韦
松基教授鉴定为五桠果科属植物锡叶藤［Tetracera
asiatica(Lour．)Hoogland］的根。药材处理:洗净→切片
→晒干→打粉→过孔径 0．250 mm(60目)筛。
·57·医药导报 2016年 1月第 35卷第 1期
2 方法与结果
2．1 总酚含量测定
2．1． 1 对照品溶液制备 称取没食子酸对照品
6．71 mg，置于 50 mL棕色量瓶中，加色谱甲醇溶解并稀
释至刻度线，摇匀，即得，每毫升含没食子酸0．134 mg。
2．1．2 供试品溶液制备 精密称取锡叶藤根粉末1 g，
加 50%丙酮溶液 15 mL，称质量，超声提取 2 次，每次
30 min，每次放冷后通过加入 50%丙酮溶液补充损失
质量，滤过，合并各次滤液，摇匀即得。
2．1．3 测定波长的选择 精密量取锡叶藤根提取液
和对照品溶液各 1 mL，置 25 mL 量瓶中，分别加入
folin-酚试剂 1 mL，静置 5 min，再加入 29%碳酸钠
(Na2CO3)溶液 5 mL，用纯化水稀释至刻度，加盖振荡
混匀后静置 30 min 后以显色剂为空白。按照紫外-可
见分光光度法［9］，在波长为 200～800 nm处扫描，结果
在760 nm处有最大吸收，故选 760 nm为测定波长。
2．1．4 标准曲线的绘制 取“2．1．1”项没食子酸对照
品溶液，精密量取 1，2，3，4，5，6 mL分别置于 25 mL量
瓶中，各加 folin-酚试剂 1 mL，静置 5 min，再加入 29%
Na2CO3溶液 5 mL，用纯化水稀释至刻度，摇匀，放置
30 min，以相应显色剂为空白。于波长 760 nm处测定
吸光度，得到标准溶液的校准曲线。用最小二乘法进
行回归，得到吸光度值(Y)与没食子酸标准溶液的浓
度(X)的关系曲线:Y = 76．43X+0．113 8，Ｒ2 = 0．999 1。
结果表明，没食子酸在 0．005 4 ～ 0．032 2 mg ·mL－1浓
度范围内与吸光度线性关系良好。
2．1． 5 精密度实验 取同一对照品溶液 1 mL，依
“2．1．3”项方法显色后，连续测定 6 次吸光度，结果
ＲSD= 0．34%。
2．1．6 稳定性实验 按“2．1．2”项方法制备供试品溶
液，取 1 mL，依“2．1．3”项方法显色后，在室温下放置
0，2，4，6，8，12，24 h后测定吸光度，ＲSD= 2．47%，结果
表明供试品溶液至少在 24 h内是稳定。
2．1．7 重复性实验 取同一批药材粉末各 6 份，每份
1 g，精密称定，依“2．1．2”项方法平行制备，依“2．1．3”
项方法显色后，在紫外下测定吸光度，计算总酚含量，
平均值为 12．09%，计算得 ＲSD= 1．16%。
2．1．8 加样回收率实验 精密称定已知总酚含量的
样品 6份，分别精密加入一定量的没食子酸对照品进
行提取，依“2．1．3”项方法显色后。在紫外下测定吸光
度，计算加样回收率，结果总酚平均加样回收率
99．14%，ＲSD= 1．14%，见表 1。
2．2 正交实验设计 通过单因素实验结果显示，锡叶
藤总酚在超声提取时提取率最高，且比较了提取溶剂
乙醇、甲醇、水、丙酮，其中丙酮提取出的总酚含量较
高，在此单因素实验的基础上，选取了丙酮浓度(A)、
液料比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)，每因素设
3水平，按照 L9(3
4)正交表进行实验，以总酚得率作为
评价指标，对锡叶藤根的总酚提取工艺进行正交实验
优化，见表 2～4。
表 1 总酚加样回收率实验测定结果
Tab． 1 Determination results of recovery of total
polyphenols g
取样量 原有量 加入量 测得量 回收率 /%
0．100 7 0．012 2 0．009 7 0．021 9 100．00
0．101 6 0．012 3 0．009 6 0．021 8 98．96
0．100 3 0．012 1 0．012 1 0．023 9 97．52
0．100 2 0．012 1 0．012 3 0．024 2 98．37
0．101 3 0．012 2 0．014 8 0．027 1 100．68
0．100 4 0．012 1 0．014 5 0．026 5 99．31
表 2 因素水平
Tab．2 Factors and levels
水平
丙酮浓度
(A)/%
液料比
(B)
提取时间
(C)/min
提取次数
(D)
1 45 9∶1 25 2
2 50 10∶1 30 3
3 55 11∶1 35 4
表 3 正交实验结果
Tab．3 Ｒesults of orthogonal test
实验号
因素
A B C D
总酚含量 /%
1 2 3 平均值
1 1 1 1 1 12．36 12．05 12．09 12．17
2 1 2 2 2 11．55 11．24 10．92 11．24
3 1 3 3 3 9．44 0．18 9．29 9．64
4 2 1 2 3 9．73 10．45 9．85 10．01
5 2 2 3 1 8．80 8．77 9．30 8．96
6 2 3 1 2 9．19 9．28 9．49 9．32
7 3 1 3 2 12．01 12．01 12．00 12．01
8 3 2 1 3 13．28 12．26 12．92 12．82
9 3 3 2 1 9．39 9．67 9．88 9．65
K1 33．04 34．18 34．31 30．77
K2 28．29 33．01 30．89 32．56
K3 34．47 28．61 30．60 32．47
k1 11．01 11．39 11．44 10．26
k2 9．43 11．00 10．30 10．85
k3 11．49 9．54 10．20 10．82
Ｒ 2．06 1．86 1．24 0．60
A．丙酮浓度; B．液料比; C．提取时间; D提取次数
A．concentration of acetone; B．ratio of solid-liquid; C．extraction
duration; D．extraction frequency
·67· Herald of Medicine Vol. 35 No. 1 January 2016
表 4 方差分析
Tab．4 Variance analysis
方差来源
离均差
平方和
自由度 均方 F P
A 6．99 2 3．50 10．31 ＜0．05
B 5．77 2 2．89 8．51 ＜0．05
C 2．83 2 1．42 4．17 ＜0．05
D 0．68 2 0．34 1．00 ＜0．05
误差 0．68 2 0．34
F 0．05( 2，2) = 19．00，F0．01( 2，2) = 99．00; A．丙酮浓度; B．液料比;
C．提取时间; D提取次数
F 0．05( 2，2) = 19． 00，F0．01( 2，2) = 99． 00; A． concentration of
acetone; B． ratio of solid-liquid; C． extraction duration; D． extraction
frequency
2．2．1 正交实验结果 从直观表(表 3)中分析可知，
影响锡叶藤总酚黄酮提取率的主次因素为 A＞ B＞C＞
D，即丙酮浓度＞液料比＞提取时间＞提取次数，四因素
中 A3＞A1＞A2，B1 ＞B2 ＞B3，C1 ＞C2 ＞C3，D2 ＞D1 ＞D3;从方
差分析(表 4)结果可知，丙酮浓度、液料比、提取时间
及提取次数均差异有统计学意义(P＜0．05)，所以从节
省时间与试剂的基础上考虑，确定最佳提取工艺为 A3
B1C1D1，即为 55%丙酮，液料比为 9∶1，提取 25 min，
超声提取 2次。
2．2．2 验证实验 取样品粉末平行 5份，按 A3B1C1D1
的条件制备样品，测定总酚含量，结果 5份样品的总酚
平均值为 13．02%，ＲSD 为 1．24%，实验结果表明该提
取方法重复性良好，合理可行。
2．3 没食子酸的含量测定
2．3．1 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱(4．6 mm×
250 mm，5 μm)，流动相:乙腈(A)-0．1%磷酸溶液(B)
(10∶90)，检测波长 273 nm，流速 1 mL·min－1，柱温
30 ℃，进样量 10 μL。对照品及样品色谱图见图 1。
没食子酸峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好，
以没食子酸峰计，理论板数不低于 5 000。
2．3．2 供试品溶液的制备 精密取锡叶藤根“2．2．2”
项提取液 5 mL，水浴蒸干，甲醇溶解，定容到 2 mL 量
瓶中，用孔径 0．45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2．3．3 标准曲线的绘制 精密吸取“2．1．1”项没食子
酸对照品溶液，分别进样 2，4，6，8，10 μL 注入液相色
谱仪进行分析，依法测定，以进样量为横坐标(X，μg)，
峰面积为纵坐标(Y)，得回归方程 Y = 2 448． 9X +
61．807，Ｒ2 = 0．999 6。结果表明，没食子酸在进样量在
0．268～1．342 μg 之间线性关系良好。
2．3．4 精密度实验 精密吸取没食子酸对照品溶液
10 μL，连续进样 6次，计算峰面积 ＲSD= 1．28%。
2．3．5 稳定性实验 取同一产地武鸣供试品，按照供
试品溶液制备方法制备，以上述条件分别在 0，2，4，6，
8，12 h进样 10 μL，测定峰面积 ＲSD= 1．83%。结果表
明供试品溶液至少在 12 h 内稳定，因药材实验时间
短，所以测 12 h内稳定性。
A．对照品; B．供试品; 1．没食子酸
图 1 没食子酸的高效液相色谱图
A．control substance;B．test sample;1．gallic acid
Fig．1 HPLC chromatogram of gallic acid
2．3．6 重复性实验 取同一产地武鸣粉末各 6 份，每
份 1 g，按照供试品溶液制备方法制备，进样 10 μL，结
果没食子酸含量平均值为 2．97 mg·g－1，ＲSD= 1．64%。
表明本法重复性良好。
2．3．7 没食子酸加样回收率实验 取已知含量的供
试品 6份，按照供试品溶液制备方法制备，以上述色谱
条件进样 10 μL，测定没食子酸含量。结果没食子酸
平均加样回收率 99．71%，ＲSD= 1．32%，见表 5。
表 5 没食子酸含量测定加样回收率实验
Tab．5 Determination results of recovery of gallic acid
取样量
原有量 加入量 测得量
mg
回收率 /
%
0．100 7 0．299 1 0．239 3 0．538 2 99．92
0．101 6 0．301 8 0．241 4 0．543 2 100．00
0．100 3 0．297 9 0．298 3 0．593 2 98．99
0．100 1 0．297 3 0．298 3 0．590 9 98．42
0．101 3 0．300 9 0．361 1 0．657 8 98．84
0．100 4 0．298 2 0．360 1 0．665 8 102．08
2．4 不同产地没食子酸含量测定 分别取锡叶藤根
10个不同产地药材粉末，按照供试品溶液制备方法制
·77·医药导报 2016年 1月第 35卷第 1期
备，按“2．3．1”项色谱条件实验，根据标准曲线法计算
含量。结果见表 6。
表 6 广西不同产地锡叶藤药材样品中没食子酸的测定结
果
Tab．6 Determination results of gallic acid content in
Tetracera asiatica from different regions of Guangxi
n= 3
产地 含量 /(mg·g－1) ＲSD /%
广西武鸣 2．98 1．27
广西上思 1．97 0．41
广西东兴 2．73 0．16
广西灵山 2．19 1．18
广西横县 2．42 1．73
广西容县 1．95 0．59
广西浦北 1．99 0．53
广西博白 2．23 0．21
广西防城 1．94 1．07
广西宁明 2．05 0．33
3 讨论
锡叶藤根中没食子酸含量测定采用高效液相色谱
法，总酚含量测定采用紫外分光光度法，经方法学考察
表明，2 种方法的线性都较好，精密度高，重复性及加
样回收率均较好，测得结果准确。
本研究参考谢月等［10］对白花檵木中总酚和没食
子酸含量测定方法，颜小捷等［11］测定裸花紫珠中总酚
含量的方法，通过正交实验优选溶剂浓度、液料比、提
取时间及提取次数 4 个工艺参数，确立了最佳提取工
艺，验证实验结果表明该工艺重复性良好，可作为锡叶
藤根总酚类提取的参考工艺。
通过对广西壮族自治区内 10 个不同产地的锡叶
藤根中没食子酸含量的测定，发现含量范围为 1．94 ～
2．98 mg·g－1，最高值和最低值相差不大，说明广西不
同产地锡叶藤根中的没食子酸含量比较稳定。
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櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆
2016年《医药导报》各期药物专栏要目
第 1期:中药与天然药物专栏; 第 7期:感染科用药专栏;
第 2期:风湿免疫疾病用药专栏; 第 8期:肿瘤科用药专栏;
第 3期:呼吸科用药专栏; 第 9期:神经内科用药专栏;
第 4期:麻醉科用药专栏; 第 10期:精神心理疾病用药专栏;
第 5期:儿科用药专栏; 第 11期:消化内科用药专栏;
第 6期:妇产科计划生育用药专栏; 第 12期:皮肤性病用药专栏。
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