全 文 ：实验研究／论著
狼毒大戟对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞凋亡影响
及其机制的初步探讨
杨柯１，　王义善１，　赵腾达２
１．解放军第一〇七医院肿瘤治疗中心，山东 烟台２６４００２
２．滨州医学院研究生学院，山东 烟台２４６００３
【摘要】　目的：观察中药狼毒大戟提取液对体外培养的Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞凋亡及Ｃａｓｐａｓｅ－９基因表达的影响。方法：Ｌｅｗｉｓ
细胞培养后以不同药物浓度（０．２、０．４和０．８ｍｇ／ｍＬ）干预２４ｈ。Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ ＦＩＴＣ／ＰＩ双染法检测细胞凋亡率的变化，
流式细胞术检测细胞周期的变化；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测基因Ｃａｓｐａｓｅ－９表达的变化。结果：阴性对照组与狼毒大戟低、中、
高剂量组（０．２、０．４和０．８ｍｇ／ｍＬ）细胞凋亡率分别为（０．３３１±０．０１２）％、（８．２７±０．０６７）％、（２８．１９±０．２７０）％和（３２．９６±
０．１４）％；阴性对照组与狼毒大戟低中高剂量组Ｓ期所占比例分别为（５０．３±０．７７）％、（４４．２±１．８２）％、（３４．１±１．５６）％和
（２５±０．７２）％；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ结果显示，阴性对照组与狼毒大戟组Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ的相对表达量分别为１．００和１．６４。结
论：狼毒大戟可以明显促进Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞的凋亡，将细胞周期阻滞在Ｇ０／Ｇ１ 期；并且可以明显提高Ｃａｓｐａｓｅ－９的表达。狼
毒大戟可能是通过将细胞周期阻滞于Ｇ０／Ｇ１ 期并且促进Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ的表达而诱导Ｌｅｗｉｓ细胞的凋亡。
中华肿瘤防治杂志，２０１２，１９（９）：６５２－６５４
【关键词】　狼毒大戟；肺肿瘤；凋亡；细胞周期；荧光定量
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｌｅｗｉｓ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎａ　ｓｔｅｕｄ
ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ＹＡＮＧ　Ｋｅ１，ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｓｈａｎ１，ＺＨＡＯ　Ｔｅｎｇ－ｄａ２
１．Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ，Ｎｏ．１０７　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ＰＬＡ，Ｙａｎｔａｉ　２６４００２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
２．Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｉｎｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ　２６４００３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］　ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎａ　ｓｔｅｕｄ（ＬＤＥ）ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ　ｉｎ　Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＬＤＥ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（０．２，０．４ａｎｄ　０．８ｍｇ／ｍＬ）ｆｏｒ　２４ｈｏｕｒｓ．Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ／ＰＩ　ｄｏｕｂｌｅ　ｌａｂｅｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏ－
ｓｉｓ　ｒａｔｅ．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ．Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｒｅ－
ａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｂｙ　Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ／ＰＩ　ｄｏｕｂｌｅ　ｌａｂｅｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｌｏｗ，ｍｉｄｄｌｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ
ＬＤＥ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ（０．２，０．４ａｎｄ　０．８ｍｇ／ｍＬ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｗａｓ（０．３３１±０．０１２）％，（８．２７±０．０６７）％，
（２８．１９±０．２７０）％，（３２．９６±０．１４）％．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｌｏｗ，ｍｉｄｄｌｅ
ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ＬＤＥ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ（５０．３±０．７７）％，（４４．２±１．８２）％，（３４．１±１．５６）％，（２５±０．７２）％．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ＬＤＥ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　１．００ａｎｄ　１．６４．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：ＬＤＥ
ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｔ　Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ．
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｅｖ　Ｔｒｅａｔ，２０１２，１９（９）：６５２－６５４
［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］　Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　Ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎａ；ｌｕｎｇ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ
【中图分类号】　Ｒ７３４．２　　　【文献标识码】　Ａ　　　【文章编号】　１６７３－５２６９（２０１２）０９－０６５２－０３
【基金项目】　全军科技攻关项目（０６Ｇ０３４）
【第一作者简介】　杨柯，女，硕士，住院医师，主要从事肿瘤中
西医结合治疗的研究工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｋｅ０９２３０９２３＠１２６．ｃｏｍ
【通讯作者简介】　王义善，男，山东烟台人，主任医师，教授，博
士生导师，主要从事肿瘤中西医结合治疗的研究工作。
Ｔｅｌ：８６－５３５－２９３３５５９　Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｙｓ＠１０７ｚｌｚｘ．ｃｏｍ
　　狼毒大戟为大戟科植物狼毒大戟和月腺大戟的
根，始载于《神农本草经》，具有散结、逐水、止痛和杀虫
的疗效。长期的临床研究发现，狼毒具有光谱抗肿瘤
的作用［１－３］。狼毒大戟提取液对体外多种肿瘤的增殖
具有较强的抑制作用。但目前关于狼毒在肺癌抗肿瘤
分子机制方面的研究鲜见。本实验旨在探讨狼毒大戟
水提液对体外培养的Ｌｅｗｉｓ细胞诱导凋亡作用，并检
·２５６· 杨柯，等　狼毒大戟对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞凋亡影响及其机制的初步探讨
DOI:10.16073/j.cnki.cjcpt.2012.09.010
测肿瘤凋亡因子Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ的表达以探讨其作
用机制，以期为指导临床治疗非小细胞肺癌（ｎｏｎ－
ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）提供科学依据。
１　材料与方法
１．１　材料
中药狼毒水提液由解放军第一○七医院肿瘤实验
中心 配 置，取 得 济 南 军 区 制 剂 允 许 （济 联 制 字
２０００ＢＭ０８０４６），１ｍＬ狼毒大戟提取液相当于生药
２ｍｇ；ＮＳＣＬＣ　Ｌｅｗｉｓ细胞购自中科院上海细胞库；
ＤＭＥＭ 高糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自
Ｇｉｂｃｏ公司；Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ ＦＩＴＣ／ＰＩ双染试剂盒、细胞
周期检测试剂盒均购自ＢＤ公司；Ｃａｓｐａｓｅ－９、β－ａｃｔｉｎ
引物及Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ试剂盒均购于大连宝生物工程有限
公司。
１．２　细胞培养
用含１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 高糖培养基，于
３７℃、５％ ＣＯ２ 的饱和湿度恒温培养箱中常规培养，
２～３ｄ传代，取对数生长期的细胞用于实验。
１．３　细胞凋亡的Ａｎｎｅｘｉｎ－ⅤＦＩＴＣ／ＰＩ双染法检测
离心收集用药组和对照组培养２４ｈ的Ｌｅｗｉｓ细
胞，２　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ（ｒ＝１３．５ｃｍ），弃培养基。
用冷ＰＢＳ洗涤细胞２次，每次２　０００ｒ／ｍｉｎ。用４００μＬ
１×Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ 结合液悬浮细胞，浓度大约为１×
１０６个／ｍＬ。在细胞悬浮液中加入５μＬ　Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ
ＦＩＴＣ染色液，轻轻混匀后于２～８℃避光条件下孵育
１５ｍｉｎ。加入１０μＬ　ＰＩ染色液后轻轻混匀于２～８℃
避光条件下孵育５ｍｉｎ，流式细胞仪检测细胞凋亡。
１．４　细胞周期分布的流式细胞仪检测
离心收集用药组与对照组培养２４ｈ后的Ｌｅｗｉｓ
细胞，冷ＰＢＳ洗细胞２次，后加入预冷７０％乙醇并均
匀震荡，制备成单细胞悬液，４℃固定过夜，冷ＰＢＳ洗
涤细胞２次。０．４ｍＬ　ＰＢＳ重悬细胞，后加入ＲＮＡ酶
至终浓度５０μｇ／ｍＬ，３７℃孵育３０ｍｉｎ，加入ＰＩ染液
至终浓度６５μｇ／ｍＬ，４℃避光条件下孵育３０ｍｉｎ。流
式细胞仪检测细胞周期相分布。
１．５　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法检测
每组３个复孔，收集对照组细胞和０．４ｍｇ／ｍＬ的
狼毒大戟提取液干预２４ｈ后的细胞，ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ提
取总ＲＮＡ，核酸分析仪检测ＲＮＡ纯度，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
在１．８～２．２，证明 ＲＮＡ纯度好。取１μｇ反转录成
ｃＤＮＡ。引物由大连宝生物工程公司合成。上游引物
序列为ＣＣＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣ，下游引物
序列为ＡＴＣＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＣＧ。按下列
组份配制２０μＬ反应体系：ＳＹＢＲ○
Ｒ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ
（２×）１０．０μＬ，上下游引物各０．４μＬ，ＤＮＡ 模板
２．０μＬ，灭菌水７．２μＬ。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ反应程序：预
变性９５℃３０ｓ；ＰＣＲ反应９５℃５ｓ；６０℃２０ｓ，４０
个循环；溶解曲线分析。
１．６　统计学方法
采用ＳＰＳＳ　１０．０软件进行方差分析，数据用ｘ－±ｓ
表示。检验水准α＝０．０５．
２　结果
２．１　Ａｎｎｅｘｉｎ－ⅤＦＩＴＣ／ＰＩ检测
不同浓度狼毒大戟提取液干预治疗后，阴性对照
组凋亡率为（０．３３１±０．０１２）％，狼毒低、中和高剂量组
凋亡率分别为（８．２７±０．０６７）％、（２８．１９±０．２７０）％和
（３２．９６±０．１４）％，狼毒低、中、高剂量组与正常对照组
相比凋亡率明显升高，并且随着浓度的升高凋亡率升
高，Ｆ＝１８　６８４．７６４，Ｐ＝０．０００（图１）。
图１　不同浓度狼毒大戟提取液作用Ｌｅｗｉｓ细胞２４ｈ后
细胞凋亡率的变化
Ａ：阴性对照组；Ｂ：狼毒低剂量组；Ｃ：狼毒中剂量组；Ｄ：狼毒高剂量组
２．２　细胞周期
不同药物浓度干预后，阴性对照组与狼毒低、中、
高剂量组Ｓ期细胞所占比例分别为（５０．３±０．７７）％、
（４４．２±１．８２）％、（３４．１±１．５６）％和（２５±０．７２）％，差
异有统计学意义，Ｆ＝４　９８２．６０５，Ｐ＝０．０００（图２）。
２．３　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达的变化
经荧光定量ＰＣＲ检测后得到空白对照组及狼毒
组Ｃａｓｐａｓｅ－９和β－ａｃｔｉｎ的Ｃｔ值，各组曲线融合较好，
说明本次实验数据可信。根据各组Ｃｔ值算出２－ΔΔＣｔ
值，统计结果显示，狼毒组与空白对 照 组 相 比，
Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达升高，差异有统计学意义，Ｆ＝
２９．４２７，Ｐ＝０．００２。
·３５６·中华肿瘤防治杂志２０１２年５月第１９卷第９期　　ＣＨＩＮ　Ｊ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＲＥＶ　ＴＲＥＡＴ，Ｍａｙ　２０１２，Ｖｏｌ．１９　Ｎｏ．９
图２　不同浓度狼毒作用Ｌｅｗｉｓ细胞２４ｈ后细胞周期的变化
Ａ：阴性对照组；Ｂ：狼毒低剂量组；Ｃ：狼毒中剂量组；Ｄ：狼毒高剂量组
３　讨论
原发性肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中在欧
美国家ＮＳＣＬＣ占肺癌发病率的７０％ ～８０％，在我国
则高达８０％～９０％，并且呈明显上升的趋势［４－７］。放
化疗是ＮＳＣＬＣ的有效治疗手段，但其毒副反应不容
忽视，往往伴随着患者免疫功能低下从而加快肿瘤转
移，使病情难以控制。随着中国传统医学与现代医学
的发展，中西医结合治疗肿瘤已经逐渐被人接受并广
泛应用于临床，医学界也提出了以补充替代医疗目的
的治疗研究［８］。本课题实验组 Ｗａｎｇ等［９］研究发现，
０．０５ｍｇ／ｍＬ浓度的狼毒大戟提取液（１ｍＬ的狼毒大
戟提取液相当于２ｍｇ的生药）就能够通过上调Ｂａｘ，
及抑制Ｂｃｌ－２而明显促进Ｂ１６黑色素小鼠移植瘤的增
殖与凋亡，且随着浓度的增大作用增强。
　　肿瘤的发生和发展是一个多因素影响的复杂过
程［１０］。细胞凋亡是机体维持稳定的重要保护机制之
一，当细胞凋亡机能降低时，肿瘤发生率就会增
加［１１－１３］。增殖是指细胞通过分裂而生成与自身相同的
细胞群体的过程［１４］。近年研究结果表明，肿瘤细胞的
增殖加速及不能进入静止或终末分化是由于细胞增殖
周期失控，与细胞周期不同时相存在的调控点密切相
关［１５－１６］。Ｇ１ 期不但决定细胞周期的长短，且静止或进
入终末分化的细胞也停留在此期，因此 Ｇ１／Ｓ是重要
调控点。本实验结果表明，狼毒大戟可以明显促进
Ｌｅｗｉｓ细胞凋亡，并且具有细胞周期阻滞作用，将细胞
阻滞在Ｇ０ 和Ｇ１ 期，阻滞细胞进入Ｓ期及Ｇ２／Ｍ 期，
进而抑制肿瘤细胞 ＤＮＡ 的合成，抑制细胞增殖。
Ｃａｓｐａｓｅ－９是细胞凋亡的启动者，所有Ｃａｓｐａｓｅ家族成
员的激活均需要Ｃａｓｐａｓｅ－９的调节。Ｃａｓｐａｓｅ－９一旦
被激活，就能切割细胞内多种蛋白，进而引起肿瘤细胞
凋亡［１７－１８］。本实验结果显示，狼毒大戟可以通过促进
Ｃａｓｐａｓｅ－９的表达诱导细胞凋亡。
因此，推测狼毒可以通过多种途径在诱导细胞凋
亡的同时提供机体体抗力，是一种很有前景的抗癌药
物，值得进一步研究。
【参考文献】
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胞性白血病Ｋ５６２细胞周期的作用及机制［Ｊ］．华北国防医药，
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［１７］　Ｂｒａｔｔｏｎ　Ｓ　Ｂ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ　Ｇ　Ｓ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｐａｆ－１－ｃａｓｐａｓｅ－９
ａｐｏｐｔｏｓｏｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌ　Ｓｃｉ，２０１０，１２３（１９）：３２０９－３２１４．
［１８］　袁青领，阎钧，郑起．细胞凋亡的研究新进展［Ｊ］．国际外科学杂
志，２０１０，３７（９）：６１５－６１８．
收稿日期：２０１２－０１－１２　修回日期：２０１２－０２－２０
（编辑：杨靖）
·４５６· 杨柯，等　狼毒大戟对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞凋亡影响及其机制的初步探讨