全 文 ：网络出版时间:2012 －5 －11 14:04 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20120511． 1404． 201206． 807_017． html
木果楝内酯化合物抑制人肺肿瘤细胞增殖活性
及作用机制的研究
常和平1，王思明2，霍长虹3，李 勇2，郭书瀚3，王 溪3，董 玫3，史清文3
( 河北医科大学1．第三医院高压氧科、2．第四医院胸外科、3．法医学系，河北 石家庄 050011)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2012． 06． 017
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2012)06 － 0807 － 04
中国图书分类号:R284． 1;R329． 24;R734． 202． 2;R979． 1
摘要:目的 检测 3 种木果楝内酯化合物(Xylocarpin H，Xy-
logranatin C和 Xylomexicanin A ) 对人肺肿瘤细胞增殖的抑
制作用，并进一步探讨其可能的作用机制。方法 MTT 比
色法检测细胞增殖抑制率; 采用Western blot 分析与凋亡相
关的蛋白表达变化。结果 Xylogranatin C 对人非小细胞肺
癌细胞(A549、RERF-LC-jk 和 QG-56) 以及人小细胞肺癌细
胞(PC-6 和 QG-90)5 种实验用细胞的增殖均显示较强的抑
制活性;Western blot结果显示由 Xylogranatin C处理的 A549
细胞中的 p53、Bax和 caspase-3 的表达与对照组相比有明显
的增加(P ＜ 0. 05)。结论 Xylogranatin C 具有较强的抑制
人肺肿瘤细胞增殖作用，其作用机制可能与其诱导肿瘤细胞
凋亡有关。
关键词:木果楝;木果楝内酯;Xylogranatin C;肺肿瘤细胞;增
殖;细胞凋亡
收稿日期:2012 － 02 － 13，修回日期:2012 － 03 － 28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81072551) ; 河北省科技
支撑项目(No 11276103D-89) ; 河北省自然科学基金资助
项目(No C2010000489)
作者简介: 常和平(1981 －) ，女，硕士生，研究方向: 病理生理学，E-
mail:sychangheping@ 163． com;
董 玫(1963 －) ，女，博士，教授，研究方向: 天然药物研
究及法医毒物分析，通讯作者，Tel:0311-86265602，E-
mail:meimeidong11@ 126． com;
李 勇(1976 －) ，男，副教授，研究方向: 肺癌的基础与临
床，通讯作者，E-mail:liyongdoctor@ 126． com
化学治疗在肺癌尤其是小细胞肺癌和晚期肺癌
患者中占据重要地位，而目前临床上肺癌化疗仍以
铂类、紫杉烷类、长春新碱类为主，但是因其毒副作
用较大，限制了其广泛应用，所以寻找高效低毒的新
的抗癌成分一直是药物学家和肿瘤专家不懈的努
力［1］。楝科植物木果楝(Xylocarpus granatum) 为一
种生长在热带沿海地带的红树林植物，海南民间用
其种皮治疗赤痢，种仁用作滋补品，在东南亚国家民
间用其治疗腹泻、霍乱和由疟疾引起的发烧，还可用
作昆虫拒食剂［2］。本研究首次检测了 3 种木果楝内
酯化合物抑制人肺肿瘤细胞增殖的效应，并进一步
选取与细胞凋亡相关的蛋白 p53 和 Bax 为研究对
象，探讨木果楝内酯化合物抑制肿瘤细胞增殖的作
用机制。
1 材料与方法
1． 1 药品和试剂 木果楝种子中纯化的 3 种木果
楝内酯化合物 Xylocarpin H［3］、Xylogranatin C［4］和
Xylomexicanin A［5］由河北医科大学药学院天然药物
化学教研室提供，经1H-NMR检查，纯度在 99%以上
(Fig 1)。MTT 和顺铂购于 Sigma 公司;Annexin V-
FITC试剂盒购自 Invitrogen 公司;β-actin、p53、Bax
和 caspases-3 多克隆抗体均购自 Santa Cruz Biotech-
nology公司;caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 购自 Pro-
mega公司。
Fig 1 Chemical structures of Xylocarpin H (1) ，
Xylogranatin C (2)and Xylomexicanin A (3)
1． 2 细胞系 人非小细胞肺癌细胞 (A549、RERF-
LC-jk和 QG-56) 以及人小细胞肺癌细胞(PC-6 和
QG-90) 由日本千叶大学医学部第二生物化学教室
提供。各细胞培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640
培养基中，常规传代培养。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 MTT 法［6］ 各药物处理肿瘤细胞 48 h，于
培养结束前 4 h，各培养孔加入 5 g·L －1的 MTT 10
μl，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD 值) ，
并计算细胞生存率，细胞生存率 /% = 实验组 OD
值 /对照组 OD值 × 100%。
1． 3． 2 流式细胞术测定细胞凋亡 细胞处理同上。
除去细胞培养液，胰酶消化，收集细胞，用 PBS 洗细
·708·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Jun;28(6) :807 ～ 10
胞 3 次，用 PBS重悬细胞并调节细胞浓度为 5 × 105
～ 5 × 106·L －1，按 Annexin V-FITC 试剂盒操作，然
后上流式细胞仪上检测，分析凋亡细胞比例。
1． 3． 3 Western blot 检测［7］ 取对数生长期细胞，
按 2 × 106 个细胞 /培养皿接种 A549 细胞。加入终
浓度为 10 μmol·L －1的阳性对照顺铂和 Xylograna-
tin C的培养基培养细胞 24 h，离心收集细胞，用
PBS洗涤细胞后，加入上样缓冲液 100 μl，剧烈震荡
后冰浴下超声波处理 1 min。100℃加热 3 min 使蛋
白质变性，15 000 r·min －1离心 15 min，取上清液测
定蛋白浓度。取 50 μg蛋白在 SDS-PAGE 电泳下分
离，分离胶为 12%，浓缩胶为 5%。根据预染的蛋白
Marker指示，小心割取 GR所在的区带，电转移至硝
酸纤维膜，用 5%脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜 1
h。膜在 caspase-3(1 ∶ 800)、Bax (1 ∶ 1 000)、p53
(1 ∶ 1 000) 和β-actin (1 ∶ 1000) 稀释液中室温过
夜，1 × TBS-T洗膜 15 min，共 3 次后，在二抗稀释液
( 抗鼠1 ∶ 20 000) 中孵育20 min。再次洗膜后加入
ECL试剂，反应 5 min，用 X线曝光 1 ～ 10 min后，显
影。
1． 4 统计学处理 数据用 珋x ± s表示。两组间数据
用 t 检验。应用 The SAS system 6. 12 统计软件计
算。
2 结果
2． 1 3 种木果楝内酯化合物对人肺肿瘤细胞增殖
的影响 本实验采用 MTT 法探讨了 3 种木果楝内
酯化合物对人肺肿瘤细胞增殖活性的影响。实验结
果如 Tab 1 所示，阳性对照顺铂对 A549、PC-6 和
QG-90 细胞的增殖显示较强的抑制活性，IC50分别为
18. 48、4. 53 和 0. 32 μmol·L －1;Xylogranatin C 对人
非小细胞肺癌细胞 (A549、RERF-LC-jk 和 QG-56)
以及人小细胞肺癌细胞(PC-6 和 QG-90)5 种实验用
细胞的增殖均显示强于阳性对照顺铂的抑制活性，
IC50分别为 2. 09、1. 26、5. 28、8. 96 和 2. 19 μmol·
L －1;Xylocarpin H和 Xylomexicanin A对各种人肺肿
瘤细胞的增殖显示较弱或不显示抑制活性(Tab 1)。
2． 2 Xylogranatin C对 A549 细胞凋亡的影响 实
验结果如 Fig 2A所示，10 μmol·L －1的 Xylogranatin
C处理 A549 细胞 48 h后，A549 细胞早期凋亡率为
(31. 7 ± 2. 6)%，与空白对照组 (5. 4 ± 0. 4)% 比
较，差异具有统计学意义 (P ＜ 0. 05) ，提示Xy-
logranatin C促进了 A549 细胞的凋亡。
2． 3 Xylogranatin C 对 A549 细胞内 p53 蛋白、
Bax蛋白和 caspaes-3 的上调作用 10 μmol·L －1
的顺铂和 Xylogranatin C 作用 A549 细胞后，均可明
显上调细胞内的 p53、Bax 和 caspaes-3 表达(Fig
2B)。
Tab 1 Antiproliferation activities of three compounds from
Xylocarpus granatum on human lung cell lines
Compounds
IC50 /μmol·L －1
A549 RERF-LC-jk QG-56 PC-6 QG-90
Cisplatin 18． 48 ＞ 100 ＞ 100 4． 53 0． 32
Xylocarpin H 73． 72 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100 73． 82
Xylogranatin C 2． 09 1． 26 5． 28 8． 96 2． 09
Xylomexicanin A 95． 31 ＞ 100 ＞ 100 62． 55 95． 31
Fig 2 Molecular mechanism of Xylogranatin C in A549 cells
＊＊P ＜ 0. 01 vs control
2． 4 半胱天冬酶抑制剂对 Xylogranatin C 抑制
A549 细胞增殖的翻转作用 使用 1、10 和 100 μmol
·L －1的顺铂和 Xylogranatin C处理 A549 细胞，其细
胞生存率分别为 83. 66%、56. 27%、28. 98% 和
59. 87%、24. 31%、2. 76%(Fig 3A) ;使用20 μmol·
L －1的半胱天冬酶抑制剂与顺铂和 Xylogranatin C 共
同孵育 A549 细胞后，其细胞生存率分别上升为
97. 77%、74. 90%、56. 34% 和 82. 78%、46. 27%、
10. 98%(Fig 3B)。
3 讨论
肺癌在我国已经代替肝癌成为男性首位恶性肿
瘤死因，并且发病年龄明显趋于年轻化。药物治疗
是肺癌的主要治疗手段之一，但毒副作用严重，且尚
无治疗肺癌的特效药，因此寻找疗效确切，作用机制
·808· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Jun;28(6)
Fig 3 Comparison of cell viability of A549 cells cultured in the
presence or absence of Z-VAD-FMK during
Cisplatin and Xylogranatin C treatment
A:inhibitor (－) ;B:inhibitor (+) ;* P ＜ 0. 05 vs inhibitor(－)
清楚，治愈率高，毒副作用小的抗肿瘤药物，进而攻
克癌症是全世界医药工作者亟待解决的一大课
题［8］。
本实验首次观察了 3 种木果楝内酯化合物对人
肺肿瘤细胞增殖的抑制活性。实验结果显示，Xy-
logranatin C对人非小细胞肺癌细胞(A549、RERF-
LC-jk和 QG-56) 以及人小细胞肺癌细胞(PC-6 和
QG-90) 的增殖抑制活性均强于阳性对照顺铂。
传统药用植物通过很多途径发挥作用，如提高
机体免疫功能、诱导细胞凋亡、调节肿瘤细胞信号通
路［9 － 10］。本实验采用流式细胞术检测结果显示 Xy-
logranatin C可明显诱导 A549 细胞凋亡; 进一步的
实验研究发现，Xylogranatin C 可明显诱导 A549 细
胞内的 p53、Bax和 caspase-3 蛋白表达上调，而且实
验也证明了半胱天冬酶抑制剂能够翻转由 Xy-
logranatin C对 A549 细胞增殖的抑制作用。文献报
道 p53 基因缺失率与肺腺癌的恶性程度呈正相
关［11］，本实验结果显示，Xylogranatin C 可明显诱导
A549 细胞内的 p53 的表达上调; 另外，已知胞内高
浓度的钙和促凋亡蛋白 Bax均可导致线粒体膜的转
移渗透孔通透性改变，使细胞色素 C 从线粒体释
出，活化 caspase-9，进而激活 caspase-3，导致细胞凋
亡的发生; 因此，推测Xylogranatin C 对肿瘤细胞增
殖的抑制作用很可能是通过上述途径引发细胞凋亡
所致。但是由于促使肿瘤细胞发生凋亡是多途径共
同作用的结果，因此 Xylogranatin C诱导人肺肿瘤细
胞凋亡的分子机制还需要进一步研究。
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·908·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Jun;28(6)
Anti-growth activity and its mechanism
in human lung cells by compounds from Xylocarpus granatum
CHANG He-ping1，WANG Si-ming2，HUO Chang-hong3，
LI Yong2，GUO Shu-han3，WANG Xi3，DONG Mei3，SHI Qing-wen3
(1． Dept of Hyperbaric Oxygen，the Third Affiliated Hospital of Hebei Medical Uninversity，2． Chest Surgery of the Fourth Hospital
of Heibei Medical University，3． Dept of Forensic Medicine，Hebei Medical University，
Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China)
Abstract:Aim To study the anti-proliferative activity
to human lung tumor cells of three compounds from Xy-
locarpus granatum and to explore its mechanism．
Methods The cell viabilities were examined by MTT
assay． The protein expression of apoptosis in A549
cells was analyzed by Western blot assay． Results
Xylogranatin C exhibited significant anti-growth activi-
ties to cell of human nonsmall-cell lung cancer (A549、
RERF -LC-jk and QG-56)and cell of human small
cell lung cancer (PC-6 and QG-90)． It also significant-
ly up-regulated the p53，Bax and caspase-3 protein ex-
pression compared with control group in A549 cells．
Conclusions Xylogranatin C has significant anti-
growth activities in human lung cancer cells． The pos-
sible mechanism of the anti-proliferative growth activi-
ties to human lung cancers of Xylogranatin C is related
to inducing human lung cancer cell apoptosis．
Key words:Xylocarpus granatum;Xylolactone;Xy-
logranatin C;lung cells;proliferation;apoptosis
网络出版时间:2012 －5 －11 14:04 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20120511． 1404． 201206． 810_018． html
牛磺酸增强渐增再灌注心肌保护作用的实验研究
鞠浩爽1，尚跃丰2，罗 鹏3，汪月光3，张 森1，郭媛丽1，吴艳娜1，康 毅1，刘艳霞1
(1．天津医科大学药理学教研室，天津 300070;2．天津市天和医院，天津 300050;3．天津市东丽区东丽医院，天津 300300)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2012． 06． 018
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2012)06 － 0810 － 05
中国图书分类号:R-332;R322． 11;R329． 24;R542． 201;
R916． 4
摘要:目的 研究牛磺酸对渐增再灌注处理的离体大鼠缺
血 /再灌注损伤心肌的保护作用。方法 采用 Langendorff离
体心脏灌流法制备离体大鼠心肌缺血 /再灌注模型。SD 大
鼠随机分为 7 组:正常对照组(Nor)、缺血 /再灌注组(I /R)、
渐增再灌注组(GR)、牛磺酸低浓度组(T20)、牛磺酸高浓度
组(T40)、渐增再灌注联合牛磺酸低浓度组(GT20)、渐增再
灌注联合牛磺酸高浓度组(GT40)。记录平衡末及再灌注 90
min心功能，TTC 染色法测定心肌梗死面积，检测冠脉流出
收稿日期:2012 － 01 － 13，修回日期:2012 － 03 － 26
基金 项 目: 天 津 市 应 用 基 础 及 前 沿 技 术 研 究 计 划 (No
11JCZDJC18300) ;高校博士学科点专项科研基金 (No
20101202110005)
作者简介:鞠浩爽(1985 －) ，女，硕士生，研究方向: 心血管药理学，
Tel:022-23542523，E-mail:juhaoshuang1001@ 163． com;
刘艳霞(1963 －) ，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:
心血管药理学与分子药理学，通讯作者，Tel:022-
23542070，E-mail:liuyanxia@ tmu． edu． cn
液中乳酸脱氢酶(LDH) 活性及心肌组织中Caspase-3 活性，
TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果 与缺血 /再灌注组比
较，GR、牛磺酸能够改善心功能，减少心肌梗死面积，减少
LDH漏出，降低心肌 Caspase-3 活性并减少心肌细胞凋亡;相
比单纯应用 GR及牛磺酸，渐增再灌注联合牛磺酸的保护作
用更强，且 GT40 组保护作用最强。结论 GR 和牛磺酸均
能减轻大鼠离体缺血 /再灌注心肌的损伤，牛磺酸，特别是高
浓度牛磺酸能够增强渐增再灌注对心肌的保护作用，抗凋亡
可能是二者发挥心肌保护作用的机制之一。
关键词:缺血 /再灌注损伤; 渐增再灌注; 牛磺酸; 心肌保护;
凋亡;Caspase-3
渐增再灌注(gradual reperfusion，GR) 又称温和
再灌注(gentle reperfusion) 或阶段性再灌注(staged
reperfusion) ，是指再灌注时从零开始逐渐增加冠脉
血流量至正常血流量［1］。目前，虽然再灌注仍是挽
救缺血心肌最为确定、有效的治疗手段，但非控制性
的再灌注本身又会引起新的损伤，即再灌注损
伤［2］。而 GR 作为改进的再灌注方法能够减轻心
·018· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Jun;28(6) :810 ～ 4