全 文 ：＊基金项目:广东省科技计划项目(2005B33001004)
　作者单位:1.韶关学院英东生物工程学院 ,广东 韶关 512005;
2.湘南学院基础医学系
　作者简介:黄晓敏(1955-), 女 ,湖南郴州人 ,教授 ,本科 ,研究方
向:细菌的药敏和耐药性机制。
文章编号:1001-0580(2007)11-1350-03　　中图分类号:R 378.1+1 , R 285.5　　文献标志码:A 【论　　著】
溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜影响＊
黄晓敏1 ,柯野1 ,林良佳1 ,陈春营1 ,王晓2 ,李洁2 ,黄卓星1
　　摘　要:目的　研究溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜的影响。方法　采用试管二倍稀释法测定药物的最低
抑菌浓度(MIC),用 Brown 平板改良法体外复制金黄色葡萄球菌生物膜模型 , 并检测溪黄草复方的不同 MIC 浓度对
金黄色葡萄球菌生物膜的影响 ,扫描电镜确认。采用人绒毛膜单层细胞体外培养检测受试药物的毒性作用。结果　
溪黄草复方对金黄色葡萄球菌的 MIC 值为 128 mg/ ml ,当 MIC 值增加至 192 和 256 mg/ml作用于金黄色葡萄球菌生
物膜时 ,其活菌数明显减少。受试药物无体外活细胞毒性作用。结论　溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜有清除
效应 ,无细胞毒性作用 , 具备开发应用的潜力 ,但还需进行药物配方和临床用药研究。
关键词:溪黄草复方;金黄色葡萄球菌;生物膜;清除效应
Ef fects of rabdosiae serrae compound preparation on staphylococcus aureus biofilm　HUANG Xiao-min , KE Ye , LIN
Liang-jia , et al.Y ingdong College of Bicengineering , Shaoguan University(S haoguan 512005 , China)
Abstract:Objective　To study the effects of rabdosiae serrae compound preparation on staphy lococcus aureus biofilm.
Methods　Minimal inhibitory coh centration(MIC)were tested by doubling dilution , and simulate S.aureus biofilm in v it-
ro be improved Brow n pla te method.The effects of R.serrae compound preparation in different M IC on S.aureus biofilm
were determined and confirmed by scanning electronic microscope(SEM).Single layer cells of human floss film were used to
test the toxic effects of the compoud preparation.Results　The MIC of S .serrae compound to S .aureus was 128 mg/ml ,
and the MIC reached 192 mg/ ml or 256 mg/ml , the viable count of S .aureus on S .aureus biorilm reduced clearly.The test-
ed preparation had no toxic effects against single layer cells of human floss film.Conclusion　R.serrae compound preparation
had eliminating effects on the biofilm fo rmed by S .aureus , no toxic effects against human cells in vitro , and a good value to
be exploited.The further research of the prescription and the using in clinic w as still required.
Key words:Rabdosiae serrae compound prepar ation;staphy lococcus aureus;biofilm;elimina ting effects
　　溪黄草复方系广东省粤北 、粤东等地区人们饮用的凉茶
原料成分 , 能有效抑制金黄色葡萄球菌浮游菌的生长〔1 , 2〕。
金黄色葡萄球菌是细菌生物膜(Bacterial Biofilm , BF)的主要
形成菌 ,亦是静脉导管或其他医疗装置相关感染的主要致病
菌 ,由于金黄色葡萄球菌生物膜的形成是由细菌分泌的多糖
黏质的黏附作用而实现 , 所以 BF 一旦形成即产生较强的耐
受理化因子的能力 ,能保护细菌不受抗菌药物的作用 , 并降低
机体的免疫功能和巨噬细胞的吞噬作用 , 致使感染难以治
愈〔3〕。此外细菌可通过密度感应系统彼此协同 , 调整菌体数
量共同应对外界环境的异常变化 , 由此导致临床上常规的抗
生素治疗对 BF 引起的感染疗效欠佳 , 再加上细菌耐药因子
的传播 , 使得传统抗生素治疗更加棘手。因此 , 研究防治 BF
相关感染的有效药物更显重要。本次试验主要探讨溪黄草复
方在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的影响。
1　材料与方法
1.1　样品来源　(1)试验样品:溪黄草复方由溪黄草 、田基
黄 、大蓟 、岗梅根 、梅花冰片 、虎杖 、枸骨叶 、九节茶组成 , 采集
于粤北地区乳源县 、始兴县山区。(2)样品配制:按戴自英提
供的方法制备生药浓度为 1 g/ml的水煎液〔4〕。
1.2　菌株来源及其培养　(1)金黄色葡萄球菌临床分离株 ,
来源于广东省粤北人民医院内科住院患者静脉插管黏附菌 ,
经本学院微生物学实验室 TDR-200B 全自动型微生物分析
仪检测鉴定证实。按文献〔5〕进行生物膜定性 , 以确定能产生
生物膜的金黄色葡萄球菌。(2)质控菌株:金黄色葡萄球菌
(S.aufeus)ATCC25923(中国药品生物制品检定所)。(3)菌株
培养:受试菌培养采用大豆胰酶肉汤(LB), LB 琼脂平板。 pH
7.4 磷酸盐缓冲液(PBS)等均为本实验室配制。
1.3　仪器　TDR-200B 全自动型微生物分析仪(长沙天地
人生物科技有限公司);旋涡混合器(北京同正技术发展公
司);721 分光光度计(上海第三分析仪器厂);麦氏比浊仪(法
国 bio-Merieux 公司);Olympus 光学显微镜 , 倒置显微镜(日
本 Olympus公司)。日立 CO2 临界点干燥仪 , 日立 HCP-2 离
子溅射仪 , 日立 E-1010 扫描电子显微镜(日本日立公司)。
1.4　体外抑菌试验　采用试管二倍稀释法测定溪黄草复方
对金黄色葡萄球菌的 MIC 同时 ,平行测定其对 s.aureus
ATCC25923 的 MIC , 作质量控制。测定技术依据美国临床实
验标准化委员会(NCCLS)2004 标准〔6〕 ,溪黄草复方对金黄色
葡萄球菌的 MIC 为 128 mg/ml。
1.5　体外 BF 模型的制备与显微鉴定　(1)BF 模型制备:采
用 Brown 平板法〔7〕并进行改良 ,将复苏后传代培养 16 h 的金
黄色葡萄球菌接种于 LB 肉汤中 37℃培养过夜 , 用无菌生理
盐水离心洗 2 次 , 再用生理盐水重新悬浮。 用分光光度计
560 nm 测定其吸光度(A)值 , 使菌悬液的 A 值达 0.029(相当
细菌数约为 1.5×106 CFU/ml)。将此菌悬液用生理盐水稀
释 10 倍 ,注入 1.5cm×15 cm 无菌试管内 5 ml , 同时加入已灭
菌的制备成 1.0 cm ×1.0 cm 的一次性输液管片(已压平),
37℃培养 , 连续培养 7 d ,即可形成成熟的 BF。(2)BF 模型制
备的显微鉴定:从菌悬液中取出已培养 7 d 的 BF 载体 ,经无
菌生理盐水数次漂洗去除浮游细菌 ,单染色 , 光学显微镜油镜
观察可见排列紧密的葡萄球菌细菌层 , 弃去。取同时培养的
其他 BF载体膜 , 用 pH 7.2 的 0.1 mol/ L PBS(4℃预冷)漂洗 ,
在 4℃环境中 , 以 2.5%的戊二醛(为本实验室配制)固定 4 h;
1350 中国公共卫生 2007年 11月第 23卷第 11期　　Chin J Publ ic Heal th Nov 2007 Vol.23 No.11
用 PBS 漂洗 3 次 , 每次 15 min;按 50%, 70%, 90%, 100%体
积分数系数的乙醇梯度脱水 , 每梯度 15 min ,其中 100%乙醇
脱水 3 次;用醋酸异戊酯置换乙醇 0.5 h;CO2 临界点干燥;粘
台 ,喷金 , 扫描电镜(SEM)观察确认(所用试剂均为南方医科
大学电镜室配制)。
1.6　溪黄草复方对金黄色葡萄球菌 BF的影响　(1)SEM 观
察溪黄草复方对细菌 BF 的影响:根据受试菌株的 MIC 值
(128 mg/ml)以及细菌 BF 对抗菌药物的耐受性大于浮游菌
的原理〔3〕 ,用无菌生理盐水将溪黄草复方制剂分别稀释成对
受试菌 MIC 值的 2 倍(256 mg/ ml), 1.5 倍(192 mg/ ml), 1 倍
(128 mg/ ml), 1/ 2 倍(64 mg/ ml)系列浓度 , 并设置不含药物
的空白对照 ,各浓度药液 2 ml分别加入至 1.5×10 cm 无菌试
管内 ,把已形成细菌生物膜的载体从生理盐水管中取出 ,用无
菌生理盐水漂洗后 , 将其放入各药液浓度试管内 , 37℃培养
24 h。取出生物膜载体 , 用无菌生理盐水冲洗 , 除去未黏附
菌 ,经固定 、脱水后 ,用 SEM 观察确认。(2)溪黄草复方对金
黄色葡萄球菌 BF 的清除效应:取连续培养 7 d 的细菌生物膜
的载体 ,用 PBS 冲洗未附着细菌 , 将其放入无菌试管中 , 用无
菌生理盐水将溪黄草复方分别稀释成对受试菌的 256 , 192 ,
128 , 64 mg/ ml系列浓度 , 并设置不含药物的空白对照 , 37℃
培养 , 分别于 0 , 4 , 8 , 24 h 将试管置旋涡混合器上以 2 200
r/min震荡混合 10 min , 使载体表面的BF及 BF 内的细菌脱落
到试管内形成菌悬液 ,再用连续稀释法进行活菌计数 , 每次测
定均重复 3 次计算平均值 ,每个时间段计数 4 份标本 , 结果用
x±s表示。
1.7　活细胞来源及溪黄草复方毒理试验　(1)活细胞来源:
试验用细胞为人绒毛膜单层细胞(湖南省郴州市妇幼儿童医
院妇产科)。(2)活细胞培养:采用 5%水解乳蛋白细胞培养
液(本实验室配制)。具体方法:取停经 50 d人工流产绒毛组
织常规消化 ,置 5%水解乳蛋白细胞培养液(含 10%～ 20%小
牛血清), 5%～ 10%CO 2培养箱培养 3 ～ 5 d , 每天观察 , 待形
成单层细胞时 ,分别取用无菌生理盐水将溪黄草复方制剂分
别稀释成对受试菌的 256 , 192 , 128 , 64 mg/ml系列浓度 , 分别
注入已形成单层人绒毛细胞的培养管内 ,比例为 1:1 , 并设置
不含药物的空白对照 ,置 5%～ 10%CO2 培养箱 , 37℃培养观
察 3～ 5 d , 从培养后的第 2 d 开始用倒置显微镜观察并记录。
1.8　统计分析　采用 SPSS 10.0 软件进行 t 检验。各药物
组内不同作用时间的细菌存活数比较用单因素方差分析。
2　结　果
2.1　扫描电镜鉴定 BF形成并观察溪黄草复方对 BF 影响　
在载体表面形成的金黄色葡萄球菌生物被膜细菌呈球状 , 隐
约可见细菌之间的黏液丝借助其使细菌相互连接形成生物
膜。由于在载体样品处理过程中经脱水 、干燥等步骤 , 因此可
以推测生物膜中细菌之间在未经处理前充满了黏液。溪黄草
复方在 128 mg/ ml浓度时对金黄色葡萄球菌生物膜无明显抑
制作用 , 但载体上的 BF 细菌数量有所减少。 当受试药物浓
度达 192和 256 mg/ ml时对生物膜上的金黄色葡萄球菌有较
明显的清除效应 ,随药物浓度的加大 , 载体上细菌数目减少。
2.2　药物对金黄色葡萄球菌生物膜存活细菌数影响(表 1)
　当用溪黄草复方 64 , 128 mg/ ml浓度作用生物膜细菌 , 在
4 , 8 , 24 h时 BF 的活菌数与生理盐水对照组比较差异无统计
学意义(P>0.05)。当继续增加药物浓度至 192 , 256 mg/ ml ,
在 4 , 8 , 24 h 对 BF 的活菌数明显减少 , 与生理盐水对照组比
较差异有统计学意义(P<0.05), 但24 h 内 BF 中的细菌不能
被完全清除。各时间段之间活菌数差异无统计学意义(P >
0.05)。结果表明 , 192 , 256 mg/ml浓度的溪黄草复方对 BF
有清除效应。
表 1　培养 7 d的生物膜载体经不同药物浓度溪黄草复
方作用后活菌计数(×103CFU/ml)
受试物
(mg/ml)
活菌计数
0h 4h 8h 24h
对照组 242±37.44 296±24.63 363±26.11 449±35.12
溪黄草复方　64 271±22.16 297±25.21 286±31.24
　　　　　 128 196±19.63 183±17.33 188±23.45
　　　　　 192 59±4.32＊ 50±3.25＊ 43±1.21＊
　　　　　 256 45±3.47＊ 29±2.41＊ 23±0.84＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05。
2.3　溪黄草复方药物毒理试验检测结果　从细胞培养后的
第 2 d 开始用倒置显微镜观察至第 8 d , 人绒毛膜单层细胞未
出现变圆 、肿胀 、皱缩 、融合等病变现象 , 基本与正常细胞一
致 , 确认溪黄草复方对细胞无明显毒性。
3　讨　论
本次试验研究显示 , 金黄色葡萄球菌生物膜在溪黄草复
方 192 , 256 mg/ml浓度中作用 24 h 时 ,电镜下可见载体上 BF
的细菌数目随着药物的浓度加大而减少 , 但 BF 细菌不能完
全清除。将培养 7 d 的 BF 载体 ,经溪黄草复方 64 , 128 mg/ ml
药物浓度作用后的活菌计数显示:该药物剂量对 BF 基本无
效 ,与文献〔8〕报道相符。 当溪黄草复方药物浓度增加至
192 , 256 mg/ml作用 4 , 8 , 24 h 时 , 经活菌计数显示 , 3 个时间
段均出现活菌数减少的趋势 , 与对照组比较差异有统计学意
义(P<0.05), 表明溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜细
菌有清除效应 , 但 BF 细菌不能完全被清除。
中草药抗菌作用一直不被重视 , 原因是抗菌效果远不及
抗生素 , 而本次试验结果显示 ,溪黄草复方对金黄色葡萄球菌
生物膜有较好的清除效应 , 其中有中草药复方的抗菌效果 , 也
有因为中草药的药物成分多而杂 , 特别是其中可能有化痰祛
湿药成分 , 而化痰祛湿的药物成分正是可以降低 BF 渗透限
制性 ,使有效抗菌成分渗透入 BF 内而起到对细菌的清除效
应〔9〕 ,从而有效提高了溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜
的药理作用。
本次试验环境与人体内环境有一定差异 , 研究结果还有
待于进行临床用药试验 ,以确定疗效。尽管溪黄草复方对 BF
的有效清除效应浓度偏高 , 但药物毒理试验结果显示受试药
物无明显毒性作用 , 提示溪黄草复方具有开发应用的潜力。
(致谢:韶关学院英东生物工程学院植物学教研室叶添谋博士对
中草药样品的鉴定;南方医科大学电子显微镜室安连兵老师提供的电
镜技术支持。)
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收稿日期:2007-05-05 (宋艳萍编辑　张亚莲校对)
＊基金项目:中美艾滋病防治合作项目
　作者单位:1.北京市疾病预防控制中心性病艾滋病防治所 , 北京
100013;2.University of California , San Francisco , CA ,
USA;3.美国疾病预防控制中心中国办事处;4.北京
纪安德健康教育所
　作者简介:马小燕(1961-),女 ,吉林长春人 ,副主任医师 ,硕士 ,主
要从事传染流行病学 、艾滋病监测及防制研究。
文章编号:1001-0580(2007)11-1352-03　　中图分类号:R 167　　文献标志码:A 【论　　著】
男男性接触人群 HIV感染趋势分析＊
马小燕1 ,Mc Farland Willi2 ,张启云1 ,赵金扣3 ,贺雄1 ,李洋1 ,徐敏1 ,孙卫东1 ,黑发新1 ,张琴1 ,杜辉4
　　摘　要:目的　为探索北京男男性接触(MSM)人群人类免疫缺陷病毒(HIV)感染率趋势 , 2004 ～ 2006 年 , 在北
京 MSM 人群中进行了连续 3 年的监测调查。方法　使用同伴推动抽样法(Respondent Driven Samlpling , RDS)进行抽
样调查及血清学检测 , 用 RDSAT 软件进行人群估计。结果　2004～ 2006 年分别调查 325 , 427 和 540 名 MSM , HIV
感染率分别为 0.4%(95%CI=0.1 ～ 0.8), 4.6%(95%CI=2.2 ～ 7.6), 5.9%(95%CI=3.5 ～ 8.7)。 伴随 HIV 感染
率上升的还有多性伴 、既往性病史和梅毒抗体阳性率及梅毒快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)阳性率。结论　男
男性接触人群 HIV 感染率正在上升 ,应采取切实可行的预防措施。
关键词:男男性接触(MSM);同种推动抽样法(RDS);行为学;HIV 感染率
Analysis on trend of HIV prevalence amongmen having sex wtih men　MA X iao-yan , Mc Farland Willi , ZHANG Qi-yun
et al.Bejing Center for Disease Control and Prevention(Beijing 10013 , China)
Abstract:Objective　To explore the trend of HIV prevalence among men who have sex w ith men(MSM)in Beijing , we
conduct three consecutiv e, cro ss-sectional surveys of HIV prevalence and related risk behavior among MSM in Beijing from
2004 to 2006.Methods　We applied respondent-driven-samlping(RDS)to recruit MSM fo r demog raphic characteristics
and HIV-risk rela ted behavior.Blood specimens were drawn for HIV , syphilis , and Hepatitis B and C tesing.Results　A to-
tal of 325 MSM participated in 2004 , 427 in 2005 , and 540 in 2006.HIV prevalence increased from 0.4%(95%CI=0.1 ～
0.8)in 2004 to 4.6%(95%CI 2.2 ～ 7.6)in 2005 to 5.8%(95% CI3.5～ 8.6)in 2006.This rise was accompanied by an
increase in having multiple sex partners , self-repo rted histo ry of STD , and serolog ical evidences of syphilis infection.Conclu-
sion　The application of RDS efficienty ly recruited samples of MSM in Beijing in three consecutive years and detected a rising
prevalence of HIV and related risk behavior.Practical measures to stop the further spread of HIV in this population are ur-
gently needed.
Key words:MSM;RDS;behavior;HIV positve rate
　　当前 ,我国艾滋病经性传播比例己经上升 , 现存的人类免
疫缺陷病毒(HIV)感染者和艾滋病(AIDS)病人中经性传播
占 43.6%,在新感染的 HIV 感染者和 AIDS 病例中性传播己
占 49.8%〔1〕。男男性接触(Men w ho have w tih men ,MSM)人
群由于无保护肛交和多性伴而处于感染艾滋病的高危险之
中 ,是艾滋病防治工作的重点。为控制 MSM 人群 HIV 感染
率趋势 , 2004 年起我们使用同伴推动抽样法(Respondent
Driven Sampling , RDS)连续 3 年对北京市 MSM 人群进行监
测调查。
1　对象与方法
1.1　对象　调查期间在北京市居住的 MSM 人群。男男性
行为定义为曾经与另一位男性发生过口交或肛交的 16 岁及
以上的男性。
1.2　材料与方法　艾滋病毒抗体 、梅毒抗体 、乙型肝炎表面
抗原和丙型肝炎抗体用酶免疫法进行初筛和结果测定全自动
酶联免疫分析系统(DSX system ,美国 Thermo公司)。艾滋病
毒抗体试剂盒(美国雅培 、荷兰阿克苏和法国梅里埃生物制品
公司);2 种初筛试剂之一为阳性的血样用蛋白印迹法进行确
认 ,自动免疫印迹确证仪(Auto Blot System 36)(新加坡
Genelabs公司);试剂盒(新加坡 Genelabs 公司)。 梅毒螺旋体
抗体试剂盒(北京金豪生物制品公司);阳性者判断为梅毒抗
体阳性;梅抗体阳性血清进一步采用梅毒快速血浆反应素试
验(RPR)检测 ,试剂盒(北京万泰生物药业和乌鲁木齐新地公
司);阳性者判断为梅毒 RPR 阳性。乙型肝炎表面抗原试剂
盒(北京万泰生物药业和厦门英科新创公司);丙型肝炎抗体
试剂盒(美国雅培生物制品公司)。
1.3　方法　使用同伴推动抽样法(RDS)进行目标人群的征
募〔2 , 3〕。种子选择 2004 年来自于非政府组织的推荐 , 2005 和
2006年则从前一年调查所认识的及前来自愿咨询与检验
(VCT)门诊检测 MSM 中选择 , 3 年分别有 1 , 10 和 8 名种子
作为征募的基础。挑选种子时考虑年龄 、教育水平因素。持
征募卡前来者经调查人员判断符合标准 , 本人同意参加并愿
意征募同伴参加调查者 , 予以登记 ,口头知情同意后 , 填写一
份调查问卷 , 调查采取自填与面对面相结合的方式。调查对
象抽取静脉血 3 ～ 5 ml进行 HIV 、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒
1352 中国公共卫生 2007年 11月第 23卷第 11期　　Chin J Publ ic Heal th Nov 2007 Vol.23 No.11