全 文 ： JTCVM
2007年第 4期
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调查研究
地锦草总黄酮的体外抑菌试验
谭 红 1 ,刘 伟2
(1.湖南省湘潭市原种场 ,湖南湘潭 411134;2.湘潭市合力公司)
摘 要: 采用醇提法从地锦草中提取其主要有效成分黄酮类化合物 , 通过滤纸片法对 3种浓度(0. 4、0.8、
1. 6 m g /m l)的地锦草黄酮提取液进行抑菌实验。结果表明 ,地锦草黄酮提取液对巴氏杆菌 、沙门氏菌的体外抑菌
作用较强, 1. 6 mg /m l的黄酮提取液对巴氏杆菌 、沙门氏菌的抑菌直径分别达到(22. 0±1. 0)mm、(26. 0±2. 0)mm ,
随着黄酮浓度的增加 , 其抑菌作用也增强。地锦草黄酮对巴氏杆菌 、沙门氏菌的 M IC分别为 0. 625 m g /m l、
1. 25 m g /m l,地锦草黄酮提取液对金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、链球菌也有一定的抑菌作用。
关键词: 地锦草黄酮;体外;抑菌作用
中图分类号:S853.74 文献标识码:A 文章编号:1000 -6354(2007)04 - 0005 -02
地锦草属大戟科一年生匍匐小草本 , 别名有血见愁 、红
茎草 、铺地锦 、奶汁草等 , 生于原野荒地 、田间路旁 , 分布较
广。地锦草属清热解毒类中药 ,具有清热解毒 、活血止血 、利
湿通乳之功效 , 常用于治疗泻痢 、痈肿疔疮 、出血 、湿热黄疸
和乳汁不通等 , 在兽医临床也有应用。其成分主要有黄酮
类 、没石子酸 , 叶含鞣质 12. 89%, 近有报道地锦草含槲皮甙
类和山柰素甙类 ,甙元分别为槲皮素和山柰素。鞣质中含量
最多的是焦性没石子酸类(46%)和焦性儿茶酚(39. 4%)。
黄酮类化合物是地锦草的主要有效成分之一 , 其化学结
构系色原烷和色原酮的衍生物 , 主要是指以 2 -苯基色原酮
为母核的化合物 ,现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中
央三碳原子相互连接而成的一系列化合物 , 早期研究表明 ,
黄酮类化合物具有雌激素样作用 , 还有防治心血管疾病 、抗
肿瘤 、抗氧化 、增强免疫等多种药理活性。有关研究已证实
某些黄酮类化合物对多种微生物有抑制作用 , 潘玲等用琼脂
扩散法测定绿茶黄酮 (GTF)对大肠杆菌 、沙门氏菌 、金黄色
葡萄球菌 、炭疽杆菌等的抑菌作用 ,结果表明 , 2%GTF对这
六种指示菌均有明显的抑菌作用 , 平均抑菌圈 23. 00 mm。
目前对于地锦草黄酮的抑菌作用还未见比较详细的报道 , 笔
者等采用滤纸片法对地锦草黄酮提取物的抑菌效果进行了
初步的研究和探讨 ,以便为地锦草在兽医临床上的应用提供
实验依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 主要仪器 分析天平(METTLER - TOLEDO美国);
微量可调移液器 (Eppendo rf德国 );无菌操作台 (A IR TECH
苏净集团泰安公司);恒温培养箱(DNP - 9162型上海精密实
验设备有限公司)。
1. 1. 2 菌株 大肠杆菌 C44103;金黄色葡萄球菌 26112;巴
氏杆菌 C44 - 1;链球菌 01026;沙门氏菌。 以上菌种均购自
湖南省畜牧兽医研究所。
收稿日期:2007 -01 - 12
作者简介:谭 红 (1972 - ), 女 , 畜牧师。 E - m ail:LW P2008168@
126. com
1. 1. 3 试剂和培养基 普通肉汤培养基 , 普通琼脂培养基。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 黄酮的提取 准确称取干燥地锦草 500 g, 粉碎 , 过
100目筛。乙醇回流提取:85 ℃无水乙醇 240 m l, 3 h /次 , 提
取 3次。提取完毕 ,滤液用 16层洁净无菌纱布过滤 , 然后再
用滤纸过滤。旋转蒸发:35 ℃将滤液浓缩 , 冷冻干燥称重 ,
备用。
1. 2. 2 培养基的配置
1. 2. 2. 1 牛肉膏汤 牛肉膏 3 - 5 g,蛋白胨 10 g,氯化钠 5 g,
蒸馏水 1 000 m l。将上述成分置三角烧瓶内, 加入水 1 000 m l,
混合加热溶解 ,调 pH值至 7. 4 - 7. 6, 煮沸 3 - 5 m in, 冷却后
用滤纸过滤 ,分装于烧瓶或试管内 , 高压灭菌后置阴凉处备
用。
1. 2. 2. 2 琼脂培养基 牛肉膏 3 - 5 g, 蛋白胨 10 g, 氯化钠
5 g, 琼脂 20 -25 g, 蒸馏水 1 000 m l。将水煮沸 , 加入上述成
分 ,加热促其溶解 , 并补足由于蒸发而失掉的水分 ,调 pH 值
至 7. 4 - 7. 6, 以绒布过滤 ,分装于烧瓶或试管内 ,经高压灭菌
后备用。
1. 2. 3 菌液制备 所有菌株先接种于平板,在 37℃培养 24 h
后 ,挑选典型菌落接种于肉汤中 , 再经 37 ℃培养 18 h后 , 将
制备菌液用生理盐水稀释至 105 -106个菌 /m l,备用。
1. 2. 4 含菌平板制备 将上述培养基灭菌后倒入平皿内 ,
每个平皿约 20 m l。待培养基凝固后 , 用灭菌吸管吸取上述
各种菌悬液 0. 1 m l注入平皿内 ,再用灭菌涂棒迅速将菌液涂
抹均匀 ,制成含菌平板。以上操作均在无菌室内进行 , 严格
无菌操作。
1. 2. 5 抑菌活性的测定 用无水乙醇将地锦草黄酮提取物
分别配制成 0. 4、0. 8、1. 6 mg /m l的溶液。分别将直径为 10 mm
的灭菌滤纸片(4片为 1组), 浸入上述 3种不同浓度的地锦
草黄酮溶液中浸泡 2 h。 待其自然干燥后 , 用紫外线照射灭
菌 10 -15 m in。用无菌镊子将浸透 3种浓度地锦草黄酮溶
液的滤纸片放在含菌平板上。然后把每个处理过的培养皿
放到细菌最适温度下(37 ℃)培养 24 h, 后用游标卡尺测定
抑菌圈直径的大小 ,并以此判断不同浓度的地锦草黄酮溶液
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对供试菌的抑菌效果。
1. 2. 6 抑菌效果的判定标准 抑菌效果的判断标准为:D<
8 mm为不敏感 , 8 mm
1. 2. 7 供试菌种最低抑菌浓度的测定 取 6支试管分别
加入 2 m l液体培养基 , 加 2 m l药液于第 1支试管中 , 混匀
后取 2 m l加入第 2支试管中 , 然后依次取出 2 m l移入下一
管 , 到第 6管时弃去 2 m l, 再分别在这 6管中加入 0. 1 m l培
养好的菌液。 另取 7支试管不加菌作为空白对照 。 37 ℃
恒温培养 24 h,观察记录试管中澄清不长细菌的最高稀释
度就是最低抑菌浓度 。
2 试验结果
2. 1 地锦草总黄酮的抑菌效果见表 1。
2. 2 地锦草总黄酮对供试菌的最低抑菌浓度见表 2。
表 1 不同浓度地锦草总黄酮的抑菌效果 /mm
菌株 空白对照
地锦草总黄酮浓度
0. 4 mg /m l 0. 8m g /m l 1. 6 m g /m l
大肠杆菌 - 5. 0±1. 34 7. 3±0. 37 10. 2±0. 54
巴氏杆菌 - 16. 9±0. 99 20. 6±0. 85 22. 0±1. 0
链球菌 - 6. 1±0. 31 7. 8±1. 39 9. 6±0. 15
沙门氏菌 - 18. 0±0. 64 21. 6±1. 11 26. 0±2. 0
金葡球菌 - 8. 5±0. 82 8. 9±0. 55 12. 5±0. 66
表 2 地锦草总黄酮对供试菌的最低抑菌浓度
供试菌种
地锦草总黄酮浓度
1∶2
2. 5 mg /m l
1∶4
1. 25m g /m l
1∶8
0. 625 m g /m l
1∶16
0. 312 mg /m l
巴氏杆菌 - - + +
沙门氏菌 - - - +
注:+为长菌 , -为不长菌。
3 分析与讨论
3. 1 实验结果表明 , 巴氏杆菌 、沙门氏菌对地锦草总黄酮
提取物有较强的敏感性 ,抑菌圈大于 19 mm , 金黄色葡萄球
菌对其中度敏感 , 大肠杆菌 、链球菌不敏感。地锦草总黄酮
对沙门氏菌 、巴氏杆菌最低抑菌浓度分别为 0. 625 m g /m l、
1.25 mg /m l。
3. 2 关于黄酮类化合物的抑菌机理。 Gould(1999)指出 , 酚
类物质可通过破坏细胞壁及细胞膜的完整性 , 导致微生物细
胞释放胞内成分引起膜的电子传递 、营养吸收 、核苷酸合成
及 ATP活性等功能障碍 , 从而抑制微生物的生长。殷彩霞等
(1999)指出 ,酚类化合物及其衍生物一般呈弱酸性(pH值为
6), 能使蛋白质凝固或变性 , 具有杀菌和抑菌的作用。黄酮
类化合物的化学结构都属于酚类衍生物 , 因而也具有以上的
特性 ,表现一定的抑菌功能。该实验证实了地锦草总黄酮的
抑菌作用。
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Bacter iostasis test on the flavonoid compounds from Euphorbia hum ifusaW illd. in vitro
TAN H ong
(Xiang tan M unic ipa l Founda tion Stock S ta tion in Hunan P rov ince, Xiang tan H unan 411134, China)
Abstract:B acteriostasis te st w as carried ou t on three diffe rent concen tra tions (0. 4, 0. 8 and 1. 6 mg /m l)of flavonoid com-
pounds, wh ich we re ex trac ted from Euphorbia hum ifusa W illd. w ith a lcohol, by the filter pape rm e thod. The re su lts ind ica ted tha t
the extract a t 1. 6 m g /m l had a strong antim icrob ial e ffec ts in vitro on Pasteurella and Sa lm onella w ith antim ic robia l diam ete rs o f
(22. 0±1. 0)mm and (26. 0±2. 0)mm , respec tively. The antim icrob ia l effects w as enhanced as the flavonoid density increased.
M IC o f the ex tract on Pasteurella and Sa lm onella we re 0. 625 mg /m l and 1. 25m g /m l, respec tively. M oreove r, the extract cou ld in-
hib it the grow th of S taphy lococcusaureus, Escherich ia coli and Streptococcus.
Keyw ords:Euphorbia hum ifusaW illd. ;flavono id;in vitro;bacte rio stasis