全 文 ：２０１３年
第３３卷　第４期
河北大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
２０１３
Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．４
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－１５６５．２０１３．０４．０１２
牛耳枫生物碱２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ体外
抗肿瘤活性及作用机制
王蓓１，戎瑞雪１，郑聪毅１，曹志然１，罗都强２
（１．河北大学 基础医学院，河北 保定　０７１０００；２．河北大学 生命科学学院，河北 保定　０７１００２）
　　摘　要：为了研究牛耳枫生物碱２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ体外抗肿瘤活性及作用机制，用 ＭＴＴ法
检测６．２５～１００ｍｇ／Ｌ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ分别作用于人肝癌细胞（ＨｅｐＧ－２）、人乳腺癌细胞
（ＭＣＦ－７）及人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ）后不同时间点的细胞存活并计算细胞增殖抑制率和ＩＣ５０；ＦＤＡ／ＰＩ双染色
荧光显微镜观察细胞死亡情况；分光光度法检测Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性变化；ＭＴＴ法检测凋亡抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－
ＦＭＫ对２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ抑瘤活性的影响．结果显示：２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对３种瘤株
均有明显的抑制作用，且具有明显的时效量效关系，其４８ｈ的ＩＣ５０值分别为（１．３０±０．０９），（７．３２±０．１０）和
（８．４１±０．１１）ｍｇ／Ｌ．ＦＤＡ／ＰＩ双染色荧光显微镜观察显示２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ组中死亡细胞数较
正常对照组细胞死亡数量增加，且随着剂量的加大细胞死亡数量增加．ＭＴＴ法显示凋亡抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－
ＦＭＫ不能阻断２个浓度的２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对 ＨｅｐＧ－２细胞的增殖抑制作用．Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活
性测定显示ｌ０，３０ｍｇ／Ｌ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ作用后肿瘤细胞的Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活力单位与正常对照
组比较无统计学意义．结果表明：牛耳枫生物碱２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ在体外具有明显的抑制肿瘤细
胞增殖的作用，其作用机制并非通过激活Ｃａｓｐａｓｅ－３途径．
关键词：牛耳枫；２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ；ＭＴＴ；Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ；Ｃａｓｐａｓｅ－３
中图分类号：Ｒ９６　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１０００－１５６５（２０１３）０４－０４０１－０７
Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｆｒｏｍＤａｐｈｎｉｐｈｙｌｌｕｍ　ｃａｌｙｃｉｎｕｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ＷＡＮＧ　Ｂｅｉ　１，ＲＯＮＧ　Ｒｕｉｘｕｅ１，ＺＨＥＮＧ　Ｃｏｎｇｙｉ　１，ＣＡＯ　Ｚｈｉｒａｎ１，ＬＵＯ　Ｄｕｑｉａｎｇ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１０００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１００２，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｆｒｏｍ
Ｄａｐｈｎｉｐｈｙｌｌｕｍ　ｃａｌｙｃｉｎｕｍ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ＩＣ５０ｏｆ　ＨｅｐＧ－２，ＭＣＦ－７ａｎｄ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｓ
ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ（６．２５　 １００ｍｇ／Ｌ）ａｆｔｅｒ
２４，４８ａｎｄ　７２ｈ．Ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ
２－ｈｙｄｒｏｘｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ　ｂｙ　ＭＴＴ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ
　收稿日期：２０１２－０９－２１
　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０６７１３８５）
　第一作者：王蓓（１９７８－），女，河北献县人，河北大学讲师，硕士，主要从事肿瘤免疫及抗感染免疫研究．
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｐ７８０２０３＠１６３．ｃｏｍ
　通信作者：曹志然（１９６３－），女，河北景县人，河北大学教授，主要从事中药药理抗肿瘤研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａｏｚｈｉｒａｎ＠１６３．ｃｏｍ
罗都强（１９６８－），男，陕西扶风人，河北大学教授，博士，主要从事天然药物性成分分析．
Ｅ－ｍａｉｌ：Ｄｕｑｉａｎｇｌｕｏ＠１６３．ｃｏｍ
河北大学学报（自然科学版） 第３３卷
Ｃａｓｐａｓｅ－３ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　２－
ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｔｈｅ　ＩＣ５０ ｗｅｒｅ
（１．３０±０．０９），（７．３２±０．１０）ａｎｄ（８．４１±０．１１）ｍｇ／Ｌ　ａｆｔｅｒ　４８ｈｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｄｅａｔｈ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｇｒｏｕｐｓ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ
ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｋｉｌｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＨｅｐＧ－２ｃｅｌｓ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｉｍｐａｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｚ－ＶＡＤ－
ＦＭＫ．Ｔｈｅ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＨｅｐＧ－２ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｎｏ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｃｈａｎｇｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｈａｄ　ｎｏｔ　ｂｅｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　２－
ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏ－
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｃａｓｐａｓｅ－３．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄａｐｈｎｉｐｈｙｌｌｕｍ　ｃａｌｙｃｉｎｕｍ；２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ；ＭＴＴ；Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ；Ｃａｓｐａｓｅ－３
　　牛耳枫（Ｄａｐｈｎｉｐｈｙｌｌｕｍ　ｃａｌｙｃｉｎｕｍＢｅｎｔｈ）为虎皮楠科（Ｄａｐｈｎｉｐｈｙｌａｃｅａｅ）虎皮楠属（Ｄａｐｈｎｉｐｈｙｌｌｕｍ）
植物，原产于我国华南地区，以根、叶入药，清热解毒，活血舒筋．该科植物的主要特征是含有次生代谢物质
生物碱类，其多变的骨架和复杂的多环结构吸引了许多学者对其深入的研究［１－２］．生物碱大多数存在于植物
当中，又称植物碱．大量研究表明，天然植物中的生物碱具有明显的抗肿瘤功效，如长春碱是从夹竹桃科植物
长春花中提取出的生物碱，具有抑制微管蛋白组装的活性，并且毒性低，目前已成为一类作用于 Ｍ 期的特异
性肿瘤化疗药物［３］；瑞香狼毒总生物碱对肝癌ＢＥＬ－７４０２细胞和胃癌ＳＧＣ－７９０１细胞表现出较强的杀伤作
用［４］．前期研究发现虎皮楠生物碱对某些肿瘤细胞有抑制作用［５］．本课题组采用色谱方法从牛耳枫茎叶中提
取分离到了１０种生物碱［６］，其中２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ是从该植物中首次分离到的一种新的生物
碱［７］，有关其抗肿瘤活性的研究还未见报道．本文采用 ＭＴＴ法观察了２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ在体外
对人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ－２）、人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）、人乳腺癌细胞株（ＭＣＦ－７）的抑制增殖作用，并选择最敏
感的 ＨｅｐＧ－２作为研究对象，通过ＦＤＡ／ＰＩ双染色荧光显微镜观察法、凋亡抑制剂阻断实验、Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活
性检测等手段初步探讨了２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ抗肿瘤作用机制，从而为该化合物的合理开发及利
用提供了实验依据．
１　材料与方法
１．１　细胞系、主要试剂及仪器
ＨｅｐＧ－２，ＭＣＦ－７，Ｈｅｌａ细胞系（中国科学院药物研究所）；二甲基亚砜ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ公司）；ＲＰＭＩ１６４０
培养基（ＧＩＢＣＯ公司）；２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ（河北大学生命科学学院）；凋亡抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ 、
ＰＫＣ抑制剂Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｃａｓｐａｓｅ－３活性检测试剂盒、Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研
究所）．
荧光显微镜（ＯｌｙｍＰｕｓ公司）；ＣＯ２ 培养箱 ＨＦ９０（上海力申科学仪器有限公司）；洁净工作台ＳＷ－ＣＪ－
２ＦＤ（苏州安泰空气技术有限公司）；ＥＬＸ－８００全自动酶标仪（ＥＬＩＳＡ　Ｒｅａｄｅｒ美国宝特有限公司）．
１．２　细胞培养
常规复苏细胞，用 ＲＰＭＩ１６４０完全培养液（含体积分数为１０％的胎牛血清、１００万 Ｕ／ｍＬ青霉素、
１００μｇ／ｍＬ链霉素）培养肿瘤细胞，置于含体积分数５％的ＣＯ２ 培养箱中３７℃培养，胰酶消化传代，取对数
生长期的细胞调整所需密度，进行实验．
１．３　样品的配制
用ＤＭＳＯ溶解２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ，使其质量浓度为１０ｍｇ／ｍＬ，然后用无血清的培养液进行
稀释，使其成为１ｍｇ／ｍＬ的储备液，过滤除菌，分装后在－８０℃储存，使用时再稀释成所需质量浓度．
·２０４·
第４期 王　蓓等：牛耳枫生物碱２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ体外抗肿瘤活性及作用机制
１．４　ＭＴＴ法检测２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对肿瘤细胞增殖的影响
分别取对数生长期的 ＨｅｐＧ－２细胞、Ｈｅｌａ细胞和 ＭＣＦ－７细胞，调整细胞密度为２×１０７　Ｌ－１，接种于
９６孔板中，９０μＬ／孔，培养２４ｈ贴壁后，每孔加入不同质量浓度的２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　１０μＬ，使其
终质量浓度分别为１００，５０，２５，１２．５和６．２５ｍｇ／Ｌ，阳性对照组每孔加１０μＬ的顺铂（ＤＤＰ），终质量浓度分
别为１００，５０，２５，１２．５和６．２５ｍｇ／Ｌ，阴性对照组每孔加１０μＬ含相应浓度ＤＭＳＯ（体积分数分别为１％，
０．５％，０．２５％，０．１２５％和０．０６２　５％）的培养液；每组设３个复孔，空白对照孔只加培养液不加细胞．于
３７℃、含体积分数５％ＣＯ２ 培养箱分别继续培养２０，４４，６８ｈ后取出，每孔加 ＭＴＴ（１０ｇ／Ｌ）１０μＬ，４ｈ后弃
去上清液，加入１００μＬ　ＤＭＳＯ振荡器振荡５ｍｉｎ，在４９０ｎｍ波长下检测其吸光度值（Ａ），并计算肿瘤细胞
增殖抑制率（ＩＲ），ＩＲ＝（１－药物Ａ／阴性对照Ａ）×１００％．并根据改良寇氏法计算半数抑制浓度［８］ｌｇＩＣ５０＝
Ｘｍ－Ｉ×（Ｐ－（３－Ｐｍ－Ｐｎ）／４）［Ｘｍ：１ｇ最大剂量；Ｉ：１ｇ（最大剂量／相临剂量）；Ｐ：阳性反应率之和；Ｐｍ：
最大抑制率；Ｐｎ：最小抑制率］．
１．５　ＦＤＡ／ＰＩ双染色荧光显微镜观察
取对数期的 ＨｅｐＧ－２细胞，使细胞密度为１×１０７　Ｌ－１，置于３７℃恒温恒湿、含体积分数为５％ＣＯ２ 的培
养箱培养２４ｈ；按照分组分别加入含２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ的ＲＰＭＩ　１６４０培养液（终质量浓度分别
为１０和３０ｍｇ／Ｌ），对照组只加入ＲＰＭＩ　１６４０培养液，继续培养２４ｈ后收集细胞、并用ＰＢＳ缓冲液洗涤，各
组分别加入２μＬ　ＦＤＡ染液（２００ｍｇ／Ｌ）及７０μＬ　ＰＩ染液（１００ｍｇ／Ｌ），室温闭光１０ｍｉｎ，于荧光显微镜观察
并拍照．
１．６　凋亡抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ对２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ抑瘤活性的影响
将ＨｅｐＧ－２细胞按每孔８×１０３ 个接种于９６孔板，３７℃、含体积分数５％ＣＯ２ 培养箱培养２４ｈ，细胞贴
壁后进行以下实验．实验设正常对照组、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）５０ｍｏｌ／Ｌ组、ＳＴＳ　５０ｍｏｌ／Ｌ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ
２０μｍｏｌ／Ｌ组、２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　１０ｍｇ／Ｌ组、２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　１０ｍｇ／Ｌ＋Ｚ－ＶＡＤ－
ＦＭＫ　２０μｍｏｌ／Ｌ组、２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　３０ｍｇ／Ｌ组及２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　３０ｍｇ／Ｌ＋
Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ　２０μｍｏｌ／Ｌ组，每组设３个复孔，分别作用１２ｈ后，采用ＭＴＴ法测定细胞存活，同时计算各组
细胞的增殖抑制率，实验重复３次．
１．７　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对ＨｅｐＧ－２细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性的影响
取对数生长期的ＨｅｐＧ－２细胞，接种于４个１００ｍＬ培养瓶（每瓶１×１０６ 个细胞 ），３７℃恒温恒湿、含体
积分数为５％ 的ＣＯ２ 条件孵育２４ｈ；实验设１０和３０ｍｇ／Ｌ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ组、正常对照组及
ＳＴＳ组；收集细胞后分别按试剂盒进行蛋白的提取并按试剂盒进行Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性的检测．
１．８　统计学分析
采用单因素方差分析和ｔ检验，所有数据的统计均在计算机ＳＰＳＳ１６．０软件包内进行．检验水准α＝
０．０５，Ｐ＜０．０５表示有显著性差异．
２　结果
２．１　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对几种肿瘤细胞增殖的影响
ＭＴＴ实验结果显示，２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ－２）、人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）、
人乳腺癌细胞株（ＭＣＦ－７）３种瘤株均有明显的抑制作用，其４８ｈ的ＩＣ５０值分别为（１．３０±０．０９），（７．３２±０．１０）
和（８．４１±０．１１）ｍｇ／Ｌ，且其抑制作用具有较好的时效和量效关系，顺铂对照组４８ｈ的ＩＣ５０值分别为
（３．２３±０．１２），（１．２８±０．１１），（０．３８±０．０８）ｍｇ／Ｌ（图１～３）．
·３０４·
河北大学学报（自然科学版） 第３３卷
　　图１　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对ＨｅｐＧ－２
　　　　　细胞增殖的影响
　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｏｎ
　　　　ＨｅｐＧ－２ｃｅｌｓ　ｐｏｒｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
　
　　图２　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对Ｈｅｌａ
　　　　　　细胞增殖的影响
　　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ
　　　　　ｏｎ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｓ　ｐｏｒｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
图３　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对 ＭＣＦ－７细胞增殖的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｏｎ　ＭＣＦ－７ｃｅｌｓ　ｐｏｒｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
２．２　荧光显微镜观察２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ作用后细胞死亡情况
结果表明：正常对照组中细胞绝大部分发绿色荧光，细胞为活细胞，个别细胞发红色荧光，可能为自然死
亡细胞；１０ｍｇ／Ｌ组中发红色荧光的细胞稍增加，细胞死亡数量增加；３０ｍｇ／Ｌ组红色荧光数量较小剂量组
增多，表明细胞死亡增多（图４）．
　　ａ．正常对照组；ｂ．２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ组（１０ｍｇ／Ｌ）；ｃ．２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ组（３０ｍｇ／Ｌ）．
图４　ＨｅｐＧ－２细胞ＦＤＡ／ＰＩ染色图片（×１００）
Ｆｉｇ．４　ＨｅｐＧ－２ｃｅｌｓ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＦＤＡ／ＰＩ（×１００）
·４０４·
第４期 王　蓓等：牛耳枫生物碱２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ体外抗肿瘤活性及作用机制
２．３　Ｚ－ＶＡＤ－ＭＦＫ对２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ抑瘤活性的影响
表１结果显示，经ＳＴＳ作用１２ｈ后，与正常对照组比较Ａ值显著降低（Ｐ＜０．０５），细胞增殖抑制率为
（６０．１３±０．０１）％，表明ＳＴＳ成功诱导细胞凋亡；ＳＴＳ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＭＦＫ组与ＳＴＳ组比较，Ａ值增大明显（Ｐ＜
０．０５），其抑制率为（４．０５±０．０１）％，而与正常对照组比较，Ａ值则无明显变化，表明Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ成功抑制
了ＳＴＳ 诱 导 的 细 胞 凋 亡；１０，３０ ｍｇ／Ｌ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ 组 的 增 殖 抑 制 率 分 别 为
（１６．２０±０．０９）％和（４０．０２±０．０１）％，而１０，３０ｍｇ／Ｌ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ组的细
胞增 殖 抑 制 率 分 别 为 （１８．０７±０．００）％ 和 （４１．１２±０．０１）％，２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ 组 与 ２－
ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ组之间均无显著差异（Ｐ＞０．０５）．这表明２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈ－
ｎｉｎｅ　Ｄ杀伤肿瘤细胞的作用没有被Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ抑制，即其杀伤肿瘤细胞的机制与胱天蛋白酶Ｃａｓｐａｓｅ－３
激活通路无关．
表１　凋亡抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ对２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ抑瘤活性的影响
Ｔａｂ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ　ｏｎ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｕｔｙ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ
组别 Ａ　 ＩＲ／％
正常对照组 ０．３２±０．０１
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　１０ｍｇ／Ｌ ０．２７±０．０１＊ １６．２０±０．０１
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　１０ｍｇ／Ｌ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ　２０μｍｏｌ／Ｌ　 ０．２６±０．０２＊ １８．０７±０．００
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　３０ｍｇ／Ｌ ０．１９±０．０１＊ ４０．０２±０．０１
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　３０ｍｇ／Ｌ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ　２０μｍｏｌ／Ｌ　 ０．１９±０．０１＊ ４１．１２±０．０１
Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ　５０ｍｏｌ／Ｌ ０．１３±０．０２＊ ６０．１３±０．０１
Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ　５０ｍｏｌ／Ｌ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ　２０μｍｏｌ／Ｌ ０．３３±０．０２＃ ４．０５±０．０１＃
　　＊与正常对照组比较Ｐ＜０．０５；＃与ＳＴＳ组比较Ｐ＜０．０５．
２．４　Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性的测定
由表２可知，１０，３０ｍｇ／Ｌ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ组Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活力单位分别与正常对照组比
较均无统计学意义（Ｐ＞０．０５），表明２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ 未激活 Ｃａｓｐａｓｅ－３酶，即未通过激活
Ｃａｓｐａｓｅ－３途径引起肿瘤细胞凋亡；而凋亡阳性对照组（ＳＴＳ组）中催化的酶活力单位量与正常对照组比较
具有统计学差异（Ｐ＜０．０５），表明ＳＴＳ组成功激活Ｃａｓｐａｓｅ－３酶发生细胞凋亡（表２）．
表２　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ对ＨｅｐＧ－２细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性的影响
Ｔａｂ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　ｏｎ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｏｆ　ＨｅｐＧ－２ｃｅｌｓ
组别 Ａ　 ｎ　 ｃ（ＰＮＡ）／（ｎｍｏｌ·μＬ
－１） 酶活力单位／Ｕ
正常对照组 ０．０２±０．０１　 ３　 １．０７±０．０１　 １０．５２±０．０１
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　１０ｍｇ／Ｌ组 ０．０３±０．０１　 ３　 １．３９±０．０１　 １１．２３±０．０１
２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ　３０ｍｇ／Ｌ组 ０．０２±０．０２　 ３　 １．４０±０．０１　 ９．６５±０．００
ＳＴＳ组 ０．１３±０．０１　 ３　 ４．８２±０．００▲ ３６．５２±０．０１▲
　　　与正常对照组比较，▲Ｐ＜０．０５．
３　讨论
自第１个植物来源生物碱类的抗肿瘤药物长春新碱应用于临床以来，生物碱类抗肿瘤药物发展得十分
迅速．其中天然生物碱成分是很有前途的一类活性物质，并已成功开发了几种药物，如紫杉醇、喜树碱等，成
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河北大学学报（自然科学版） 第３３卷
为具有划时代意义的抗肿瘤药．２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ是本课题组采用现代的分离鉴定技术从牛耳
枫中获得的新生物碱，本研究结果表明，２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ在体外对 ＨｅｐＧ－２细胞、ＭＣＦ－７细胞
和 Ｈｅｌａ细胞３种肿瘤细胞株均具有抑制细胞增殖的作用，尤其是对其中的 ＨｅｐＧ－２细胞抑制作用最强，且
抑制作用具有较好的时效和量效关系．
国内外研究表明生物碱可以通过多种机制作用于肿瘤细胞，例如可以诱导肿瘤细胞的凋亡；诱导肿瘤细
胞的分化；抑制肿瘤细胞增殖；抑制拓扑异构酶Ⅰ活性；还可作用于肿瘤细胞的微管，抑制其聚合或解聚
等［９］．本实验以最敏感的 ＨｅｐＧ－２细胞作为研究对象，通过ＦＤＡ／ＰＩ双染色荧光显微镜观察，结果表明２－
ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ可引起肿瘤细胞的死亡．目前研究表明细胞死亡的方式有多种，一般可分为程序
性细胞死亡和非程序性细胞死亡，程序性细胞死亡一般是指细胞凋亡，非程序性细胞死亡是指细胞坏死［１０］，
如果按其发生机制的不同还可分为Ｃａｓｐａｓｅ依赖型和Ｃａｓｐａｓｅ非依赖型，典型的细胞凋亡是Ｃａｓｐａｓｅ依赖型
的，然而有些细胞死亡的形态用坏死或凋亡并不能解释．最近有文献报道还存在着一种非凋亡性程序性细胞
死亡．它是一种新的细胞死亡方式，命名为亚凋亡（Ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ），而亚凋亡属于Ｃａｓｐａｓｅ非依赖型的程序性
细胞死亡［１１－１４］．星形孢菌素ＳＴＳ是一种广谱的细胞凋亡诱导剂，可以通过抑制蛋白激酶Ｃ，诱导细胞凋
亡［１５］．为了研究２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ诱导肿瘤细胞死亡的机制，本文以凋亡诱导剂ＳＴＳ作为阳性
对照，观察了凋亡阻断剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ对２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ抑瘤活性的影响，结果表明Ｚ－ＶＡＤ－
ＦＭＫ可成功阻断ＳＴＳ诱导的肿瘤细胞凋亡但不能阻断２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ诱导的细胞死亡；
Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性检测也表明２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ作用后肿瘤细胞内的Ｃａｓｐａｓｅ－３酶活性没有明显
变化；光学显微镜下观察死亡细胞的形态既不同于坏死又不同于典型的凋亡，上述的实验结果提示２－
ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ可能通过类似于Ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ的方式作用于ＨｅｐＧ－２细胞来发挥抗肿瘤作用［１６－１８］，
其确切作用机制尚待进一步研究．
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第４期 王　蓓等：牛耳枫生物碱２－ｈｙｄｒｏｘｙｙｕｎｎａｎｄａｐｈｎｉｎｅ　Ｄ体外抗肿瘤活性及作用机制
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ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，４８（５）：７１３－７２６．
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ａ　ｎｏｎ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ（ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ）ｉｎ　Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，
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［１８］　解树涛．康宁霉素（Ｔｒｉｃｈｏｋｏｎｉｎｓ）抗菌、抗肿瘤活性及作用机制［Ｄ］．济南：山东大学，２００７．
ＸＩＥ　Ｓｈｕｔａｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｉｂｉａｌ　ａｎｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｒｉｃｈｏｋｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉ　ＳＭＦ２［Ｄ］．Ｊｉｎａｎ：Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００７．
（责任编辑：赵藏赏）
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