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牛耳枫生物碱F21对HepG-2细胞的抑制作用及机制



全 文 :牛耳枫生物碱 F21 对 HepG-2 细胞的抑制作用及机制
曹志然,王永丽,戎瑞雪,王 蓓,王 海
(河北大学基础医学院免疫学系,河北 保定 071000)
摘要:目的 探讨牛耳枫生物碱 F21 对 HepG-2 增殖的影响及抗肿瘤作用机制。方法 F21 6. 25 ~
100 mg·L -1作用 24,48 和 72 h,MTT法检测细胞抑制率并计算 IC50。F21 10 ~ 100 mg·L
-1作用 48 h,瑞姬
氏染色光学显微镜下观察细胞形态,琼脂糖凝胶电泳观察 DNA的梯形条带,流式细胞仪检测细胞凋亡。F21
10,30 mg·L -1 + Z-VAD-FMK(胱天蛋白酶抑制剂)20 μmol·L -1作用 48 h,MTT 法检测抑制率。结果 F21
可明显抑制HepG-2细胞增殖,其于24,48 和72 h的 IC50值分别为 5. 3 ±0. 1,1. 3 ±0. 1和(0. 13 ±0. 1)mg·L
-1,
且具有量效(F = 232. 39,P < 0. 05)和时效(F = 65. 59,P < 0. 05)关系。F21 10 ~ 30 mg·L -1可使 HepG-2 细
胞体积增大、胞质内细胞核周围出现大量空泡、细胞膜完整、细胞核破碎甚至细胞形态消失。琼脂糖凝胶电
泳未观察到典型的凋亡细胞 DNA 梯形条带。流式细胞术分析显示,与正常对照组比较,F21 10,30 和
100 mg·L -1处理 HepG-2 细胞 48 h后,晚期凋亡率分别(17. 34 ± 0. 01)%,(25. 45 ± 0. 01)%和(43. 67 ±
0. 03)%(P < 0. 05)。Z-VAD-FMK可明显抑制星形孢菌素诱导的细胞死亡。F21 10 和 30 mg·L -1组的增殖
抑制率分别为(18. 42 ± 0. 09)%和(42. 77 ± 0. 01)%,而 F21 10,30 mg·L -1 + Z-VAD-FMK组的增殖抑制率
分别为(16. 46 ± 0. 01)%和(44. 01 ± 0. 01)%,与相应的 F21 组相比无统计学差异。结论 F21 在体外对
HepG-2 细胞具有显著的抑制作用,其作用机制并非通过激活胱天蛋白酶途径而诱导肿瘤细胞的凋亡。
关键词:牛耳枫,F21;HepG-2 细胞;胱天蛋白酶
中图分类号:R285 文献标志码:A 文章编号:1000-3002(2012)01-0063-05
DOI:10. 3867 / j. issn. 1000-3002. 2012. 01. 013
牛耳枫(Daphniphyllum calycinum Benth)是交让
木科(Daphniphyllaceae)交让木属(Daphniphyllum)
植物,以根、叶入药,其味苦涩,其功效为清热解毒,
活血舒筋。牛耳枫的叶和种子中均含有生物碱,且
结构复杂、形式多变,目前有关牛耳枫生物碱药理作
用的研究主要集中在抗胆碱酯酶活性及杀虫作用方
面,而对于其在抗肿瘤方面的研究报道甚少[1 - 2]。
本课题组采用各种色谱方法从牛耳枫茎叶乙醇浸提
物中分离提取到 12 种生物碱,采用 MTT 体外抗肿
瘤活性的筛选发现生物碱 F21 在体外对人肝癌细胞
株(HepG-2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人肺腺癌细胞
(A549)、人神经胶质瘤细胞(U-251)和人乳腺癌细
胞株(MCF-7)等均具有一定的抑制作用,其中对
HepG-2 的抑制作用最强。通过波谱技术及理化性
质鉴定 F21 化学结构与 deoxycalyciphylline B 相
似[3]。本研究选择最敏感的 HepG-2 作为研究对
象,通过肿瘤细胞的形态学变化、琼脂糖凝胶DNA
作者简介:曹志然(1963 -) ,女,教授,硕士,主要从事
中药药理学研究。
通讯作者:曹志然,E-mail:caozhiran@ 163. com,Tel:
13933220632
电泳分析、膜联蛋白(Annexin)Ⅴ/碘化丙啶(propidium
iodide,PI)双染流式细胞术以及胱天蛋白酶抑制剂
阻断实验等手段研究 F21 抗 HepG-2 的作用及作用
机制,为该化合物的开发利用提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 细胞株、试剂及仪器
F21 是从牛耳枫的茎叶乙醇浸提物中采用正相
硅胶,反相材料(C18,MCI)以及凝胶(Sephadex
LH-20,Toyopearl HW-40C)分离得到,获取率为
1. 6 mg·kg -1,并运用薄层色谱及层析法纯化,其纯
度为 99%;HepG-2 细胞株购自中国科学院药物研
究所;RPMI 1640 培养基购自美国 Gibco 公司;胎牛
血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;1∶ 250
胰蛋白酶购自北京 Solarbio公司;磷酸盐缓冲液 PBS
购自北京金杉金桥生物技术有限公司;噻唑蓝
(MTT)购自Amresco公司;二甲亚砜(DMSO)购自北
京 Solarbio 公司;瑞姬氏染料购自美国 Amresco 公
司;细胞凋亡-DNA Ladder 抽提试剂盒、DNA标志物
(BeyoRed)、胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK和星形
孢菌素(staurosporine,STS)均购自碧云天生物技术
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研究所;PI购自美国 Sigma公司。
洁净工作台(SW-CJ-2FD) ,苏州安泰空气技术
有限公司;二氧化碳培养箱(HF90) ,上海力申科学
仪器有限公司;倒置显微镜(CKX41SF) ,日本 Olym-
pus Corporation;ELX-800 全自动酶标仪 (ELISA
Reader) ,美国宝特有限公司;台式高速离心机,美国
Sigma公司;DYY-11B 电泳仪,北京市六一仪器厂;
流式细胞仪,美国 BD FACScalibur;HH-4 数显恒温
水浴锅,国华电器有限公司。
1. 2 细胞培养
RPMI 1640 完全培养液(含 10%热灭活胎牛血
清、0. 2% NaHCO3、青霉素 100 kU·L
-1、链霉素
100 mg·L -1) ,在 37℃、饱和湿度、5% CO2 的环境下
培养 HepG-2 细胞,当细胞融合达到 70% ~ 80%时,
用胰酶 2. 5 g·L -1消化成单个细胞接种传代。取对
数生长期的细胞用于实验。
1. 3 MTT法检测 HepG-2 细胞存活率
取对数生长期的 HepG-2 细胞,制备 2 × 107 L -1
单细胞悬液,以每孔 90 μl 接种于 96 孔培养板,置
于 37℃、5%CO2 培养箱内培养 24 h,细胞贴壁后按
照分组分别加入 10 μl待测样品,F21 终浓度分别为
100,50,25,12. 5 和 6. 25 mg·L -1;溶剂对照组每孔
加 10 μl 与待测样品相应浓度 DMSO 的培养液,各
组均设 3 个复孔,每块板均设 3 个空白对照孔(仅加
培养液,无细胞)。置培养箱中继续培养,分别于
20,44 和 68 h 取出培养板,每孔加 10 μl MTT
10 g·L -1,4 h后终止培养,弃上清,加 DMSO 100 μl
振荡 5 min待结晶物充分溶解后,在 490 nm 波长下
测定各孔吸光度值(absorbance,A) ,计算肿瘤细胞
增殖抑制率(IR) ,IR(%)=(1 - A药物 /A溶剂对照) ×
100 %。改良寇氏法计算半数抑制浓度[4]。
另按每孔 8 × 103 个 HepG-2 细胞接种于 96 孔
板,37℃培养 24 h 细胞贴壁后进行实验。设正常对
照组、STS 50 mol·L -1组、STS + Z-VAD-FMK 组、F21
10 mg·L -1组、F21 10 mg·L -1 + Z-VAD-FMK 20
μmol·L -1组、F21 30 mg·L -1组及 F21 30 mg·L -1 +
Z-VAD-FMK 20 μmol·L -1组,作用 48 h。每个组均
设 3 个复孔,MTT法测定细胞增殖能力并计算各组
细胞的增殖抑制率。实验重复 3 次。
1. 4 瑞姬氏染色观察细胞形态
取对数生长期的 HepG-2 细胞,调整细胞密度
为 1 × 108 L -1,接种于盖玻片上;37℃恒温恒湿、5%
CO2 的培养箱中孵育 24 h 后,F21 组换以含终浓度
为 10,30 和 100 mg·L -1的 RPMI 1640 培养液,正常
对照组加入等体积 RPMI 1640 完全培养液,分别继
续培养 48 h;瑞姬氏染色并于光镜下观察。
1. 5 DNA琼脂糖凝胶电泳
分别取 l ×106 个对数生长期的 HepG-2细胞接种
于 100 ml培养瓶中,置于 37℃恒温恒湿、5%CO2 的培
养箱孵育24 h;弃上清液,按照分组分别加入含F21 10,
30和 100 mg·L -1的 RPMI 1640培养液,正常对照组加
等体积 RPMI 1640培养液,继续培养 48 h;细胞收集后
按试剂盒说明进行 DNA抽提和电泳。
1. 6 流式细胞仪检测 HepG-2 细胞凋亡率
取对数生长期的 HepG-2 细胞,调整细胞密度
为 2 × 108 L -1,置于 37℃恒温恒湿、5% CO2 的培养
箱孵育 24 h;按照分组分别加入含 F21 10,30 和
100 mg·L -1的 RPMI 1640 培养液,正常对照组只加
入 RPMI 1640 培养液,继续培养 48 h,收集细胞、
PBS 缓冲液洗涤后,FITC-Annexin-Ⅴ /PI 双染流式
细胞仪检测。
1. 7 统计学分析
实验结果数据用 珋x ± s 表示,采用 SPSS16. 0 软
件单因素方差分析和 t检验,检验水准 α = 0. 05。
2 结果
2. 1 F21 对 HepG-2 细胞存活的影响
表 1 结果显示,F21 对人肿瘤细胞 HepG-2 有显
著的抑制作用,且其抑制作用具有较好的时效(F =
65. 59,P < 0. 05)和量效(F = 232. 39,P < 0. 05)关
系,在 24,48 和 72 h 的 IC50值分别为 5. 3 ± 0. 1,
1. 3 ± 0. 1和(0. 13 ± 0. 1)mg·L -1。
Tab. 1 Effect of F21 on HepG-2 cell porliferation
F21 /
mg·L -1
Inhibitory rate /%
24 48 72(h)
6. 25 8. 80 ± 0. 07 11. 02 ± 0. 01 14. 76 ± 0. 01
12. 5 12. 35 ± 0. 01 18. 99 ± 0. 01 28. 55 ± 0. 02
25 24. 04 ± 0. 01 26. 00 ± 0. 02 38. 25 ± 0. 01
50 39. 71 ± 0. 05 49. 52 ± 0. 01 65. 23 ± 0. 01
100 49. 67 ± 0. 05 62. 45 ± 0. 01 75. 00 ± 0. 01
珋x ± s,n = 3. F = 232. 39,P < 0. 05,compared with different concentra-
tions;F = 65. 59,P < 0. 05,compared with different times.
2. 2 F21 对 HepG-2 细胞形态的影响
正常对照组细胞膜完整,胞浆呈蓝色,胞质均
匀,细胞核完整,染成紫红色,核仁明显(图 1A)。
F21 10 mg·L -1处理 48 h 后,表现为细胞体积增大,
胞质内细胞核周围出现大量空泡,且密度降低,但细
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胞膜及细胞核保持完整(图 1B)。F21 30 mg·L -1处
理后,细胞膜完整性破坏,胞浆内有空泡形成,细胞
核破碎,且密度降低(图 1C)。F21 100 mg·L -1处理
后细胞破坏严重,细胞形态消失(图 1D)。
Fig. 1 Effect of F21 on HepG-2 cell morphology (Wright-
Giemsa × 20). A:normal control group;B:F21 10 mg·L -1 group;
C:F21 30 mg·L -1 group;D:F21 100 mg·L -1 group. Arrow shows
typical morphological changes.
2. 3 F21 对 HepG-2 细胞凋亡的影响
2. 3. 1 DNA琼脂糖凝胶电泳
如图 2 所见,正常对照组未见明显的 DNA降解
片段,F21 10,30 和 100 mg·L -1处理 HepG-2 细胞
48 h后,均未见特征性的 DNA梯状条带。
Fig. 2 Effect of F21 on HepG-2 cell apoptosis by agarose
gel electrophoresis. Lane 1:DNA ladder marker;lane 2:normal
control group;lane 3:F21 10 mg·L -1 group;lane 4:F21 30 mg·L -1
group;lane 5:F21 100 mg·L -1 group.
2. 3. 2 流式细胞术
图 3结果显示,F21 10,30和 100 mg·L -1处理细
胞 48 h后,HepG-2细胞晚期凋亡率分别为(17. 34 ±
0. 01)%,(25. 45 ± 0. 01)%和(43. 67 ± 0. 03)%,与
正常对照组比较,均有显著差异(P < 0. 05) ,且随浓
度增加,其凋亡率也增加(P <0. 05)。
Fig. 3 Effect of F21 on HepG-2 cell apoptosis by flow cy-
tometry. A:normal control group;B:F21 10 mg·L -1 group;C:F21
30 mg·L -1 group;D:F21 100 mg·L -1 group.
2. 4 Z-VAD-MFK对 F21 抑瘤活性的影响
表 2 结果显示,与正常对照相比,单独 F21 10
和 30 mg·L -1及 STS 50 mol·L -1处理 12 h 后,细胞
活力明显降低(P < 0. 05) ,F21 + Z-VAD-FMK 联用
组细胞存活率也明显降低(P < 0. 05) ;与单用 F21
细胞相比,F21 + Z-VAD-FMK组细胞存活率无显著差
异;与单用 STS 组相比,F21 + Z-VAD-FMK 组细胞存
活率增加(P <0. 05)。此结果表明 F21 对 HepG-2 细
胞杀伤不被胱天蛋白酶抑制剂阻断,即其杀伤肿瘤
细胞的作用机制并非与胱天蛋白酶激活通路有关。
Tab. 2 Effect of Z-VAD-FMK on proliferation of HepG-2 cells
Group Cell viability(A) Inhibitory rate /%
Normal control 0. 332 ± 0. 088 0
F21 10 mg·L -1 0. 271 ± 0. 025* 18. 42 ± 0. 09*
F21 10 mg·L -1 + Z-VAD-FMK 20 μmol·L -1 0. 269 ± 0. 008* 16. 46 ± 0. 01*
F21 30 mg·L -1 0. 190 ± 0. 005* 42. 77 ± 0. 01*
F21 30 mg·L -1 + Z-VAD-FMK 20 μmol·L -1 0. 192 ± 0. 032* 44. 01 ± 0. 01*
Staurosporine 50 mol·L -1 0. 129 ± 0. 011* 61. 16 ± 0. 01*
Staurosporine 50 mol·L -1 + Z-VAD-FMK 20 μmol·L -1 0. 345 ± 0. 020# - 3. 02 ± 0. 02* #
Cells treated with drugs for 48 h. 珋x ± s,n = 3. * P < 0. 05,compared with normal control group;#P < 0. 05,compared with staurosporine 50 mol·L -1
group.
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3 讨论
自第一个植物来源的生物碱类抗肿瘤药长春碱
1960 年 8 月在美国上市以来,生物碱类抗肿瘤药的
发展十分迅速。特别是紫杉醇和喜树碱的出现,成
为抗肿瘤药具有划时代意义的药物。研究表明生物
碱抗肿瘤作用主要通过:① 作用于细胞微管,抑制
其解聚或聚合;② 抑制拓扑异构酶Ⅰ活性;③ 诱导
细胞凋亡;④ 诱导肿瘤细胞分化和抑制肿瘤细胞增
殖;⑤ 作用于细胞膜等[5 - 6]。
本研究结果表明牛耳枫生物碱 F21 可明显抑制
HepG-2 细胞的增殖,且有明显的时效和量效关系,
形态学实验结果表明,F21 可使细胞出现明显的形
态学变化,随着剂量的增加细胞膜完整性开始遭到
破坏,最终致细胞核破碎,且伴随着整个细胞的密度
大幅降低,表明 F21 可通过引起细胞死亡而发挥抗
肿瘤作用。
一般认为细胞死亡的方式主要有细胞坏死和细
胞凋亡[7],最新研究发现一种新的非凋亡性程序性
死亡称为 paraptosis[8]。Paraptosis 在形态学上与凋
亡不同,不具有凋亡的典型特征,即缺少染色质的
新月形凝集和凋亡小体。它是以胞浆空泡的形成为
特征,在整个过程中胞浆和胞核密度增加,线粒体
肿胀,但细胞膜和细胞器仍保持完整;无阶梯状
DNA梯带;paraptosis 过程为胱天蛋白酶非依赖性
的,而细胞凋亡典型的形态学变化为核固缩,有凋亡
小体形成,DNA 出现阶梯带变化,细胞凋亡过程为
胱天蛋白酶依赖性[10 - 12]。本研究结果显示小剂量
的 F21(10 mg·L -1)引起的细胞死亡从形态上看既
不同于细胞坏死又不同于细胞凋亡,而类似于 pa-
raptosis。
本研究的琼脂糖凝胶电泳中没有出现典型的凋
亡梯带。3 次重复试验结果发现不同剂量 F21 作用
后出现了不同的 DNA梯带,关于造成此实验结果的
机制有待于进一步研究。流式细胞仪检测显示 F21
可诱导 HepG-2 细胞死亡,且随浓度增加,其死亡率
也增加。实验结果未出现明显的早期凋亡,表明
F21 诱导 HepG-2 细胞死亡方式不同于典型的细胞
凋亡。此外,凋亡抑制试验表明 F21 诱导的细胞死
亡不被胱天蛋白酶抑制剂 Z-VAD-FMK 所抑制,即
F21 诱导的细胞死亡没有发生胱天蛋白酶的活化。
综上所述,根据形态学观察以及各种凋亡检测
方法的进一步分析表明,F21 可能通过类似于
paraptosis的方式引起 HepG-2 细胞的死亡并发挥抗
肿瘤作用,有可能发展成一种新的抗肿瘤药物,其确
切作用机制尚待进一步研究。
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·66· 中国药理学与毒理学杂志 2012 年 2 月第 26 卷第 1 期 Chin J Pharmacol Toxicol,Vol 26,No 1,Feb 2012
Inhibitory effect of F21 from Daphniphyllum calycinum
on HepG-2 cells and its mechanism
CAO Zhi-ran,WANG Yong-li,RONG Rui-xue,WANG Pei,WANG Hai
(Department of Immunology,Basic Medical College of Hebei University,Baoding 071000,China)
Abstract:OBJECTIVE To explore the inhibitory effect of F21 from Daphniphyllum calyci-
num on HepG-2 cells and its possible mechanism. METHODS The proliferation inhibition rate
and IC50 of F21 were measured by MTT assay in vitro after HepG-2 cells were treated with F21
6. 25 - 100 mg·L -1 for 24,48 and 72 h,respectively. Cell morphologic changes with Wright-Giem-
sa staining were observed by optical microscopy after HepG-2 cells were treated by F21 10 - 100
mg·L -1 for 48 h. DNA ladders were measured by agarose gel electrophoresis under the same condi-
tion. Apoptosis rates in HepG-2 cells were assessed by flow cytometry after HepG-2 cells were trea-
ted with F21 for 48 h. The inhibition pathway of F21 was analyzed by adding apoptosis inhibitor
Z-VAD-FMK 20 μmol·L -1 by MTT. RESULTS MTT assay results revealed that F21 could obvi-
ously inhibit proliferation of HepG-2 cells and inhibitory rates significantly increased in a concentra-
tion-and time-dependent manner. The IC50 was 5. 3 ± 0. 1,1. 3 ± 0. 1 and (0. 13 ± 0. 1)mg·L
-1
after HepG-2 cells were treated with F21 for 24,48,and 72 h,respectively. The cell morphologic
changes were significant as shown by the increase of the cell volume and many vacuoles in cyto-
plasm. The cell nucleus and membrane were complete after HepG-2 cells were treated with F21 10
mg·L -1 . Typical DNA ladders were not observed. Compared with control group,the late apoptotic
rate was (17. 34 ± 0. 01)%,(25. 45 ± 0. 01)% and (43. 67 ± 0. 03)% when HepG-2 cells were
cultured with F21 10,30 and 100 mg·L -1 for 48 h respectively. The inhibitory rate was (18. 42 ±
0. 09)% in F21 10 mg·L -1 group and (16. 46 ± 0. 01)% in F21 10 mg·L -1 + Z-VAD-FMK group.
The inhibitory rate in F21 30 mg·L -1 group was (42. 77 ± 0. 01)% and(44. 01 ± 0. 01)% in F21
10,30 mg·L -1 + Z-VAD-FMK groups. There was no statistical significant difference between the
groups. CONCLUSION F21 can inhibit proliferation of HepG-2 cells and the mechanism is not
by activating caspase3.
Key words:Daphniphyllum calycinum;F21;HepG-2 cell;caspase
Corresponding author:CAO Zhi-ran,E-mail:caozhiran@ 163. com,Tel:13933220632
(收稿日期:2011-07-01 接受日期:2012-01-12)
(本文编辑:乔 虹)
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