全 文 ：第 27卷第 6期 　　　西　南　农　业　大　学　学　报 (自然科学版 ) Vol.27, No.6
2005年 12月 JournalofSouthwestAgriculturalUniversity(NaturalScience) Dec.2005
文章编号:1000-2642(2005)06-0902-04
斑地锦总黄酮的提取及抑菌作用①
邵　留 1 ,沈盎绿 2 ,郑曙明 1＊
(1.西南大学 水产学院 ,重庆　400716;2.中国水产科学研究院 东海水产研究所 ,上海　200090)
摘要:研究了斑地锦总黄酮的提取工艺。结果表明:连续回流法明显优于浸渍法;正交实验得出总黄酮最佳提取条件
为 A1B3C3D3 ,即 65%的乙醇 12倍量提取 4次 ,每次 2 h条件下提取液中总黄酮含量最高;各因素对试验结果的影响
顺序为 D(提取次数)>B(提取时间)>C(加倍量)>A(乙醇浓度)。斑地锦总黄酮是主要的抑菌成分之一 , 其对温
和气单胞菌的最低抑菌浓度为 1.25mg/mL,最小杀菌浓度为 10 mg/mL。
关　键　词:斑地锦;总黄酮;提取工艺;抑菌作用
中图分类号:Q949.753.5　　　　　　文献标识码:A
EXTRACTIONOFTOTALFLAVONOIDSFROMHERBA
EUPHORBIAEMACULATAEANDTHEIRINHIBITORY
EFFECTFORAEROMONASSOBRIA
SHAOLiu1 , SHENAng-lǜ2 , ZHENGShu-ming1＊
(1.ColegeofAquaculture, SouthwestUniversity, Chongqing400716, China;2.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute, Shanghai
200090, China)
Abstract:Anorthogonalexperiment[ L
9
(34)] wascarriedouttoexploretheoptimumextractivetechnologyforthetotalflavonoidsin
HerbaEuphorbiaeMaculatae.The4 factors, eachwith3levels, werealcoholconcentration, extractivetime, solventvolumeandextraction
time.Theoptimumcombinationoftheconditionsturnedouttobe12-foldvolumeof65% alcohol+refluxextractionfor2h+extrac-
tion4 times.TheresultofbacteriostasiswasMIC1.25 mg/mLamdMBC10mg/mL.
Keywords:HerbaEuphorbiaeMaculatae.HerbaEuphorbiaeMaculatae;totalflavonoids;extractivetechnology;bacteriostasis
　　斑地锦 (HerbaEuphorbiaeMaculatae)又名血筋
草 ,为大戟科大戟属多年生草本植物 。斑地锦茎密被
白色细柔毛 ,叶上面中央有长线状紫红色斑。叶和蒴
果被稀疏白色短柔毛 。种子灰红色。生于原野荒地 、
路旁 、田间 ,分布于全国各地[ 1] 。据文献记载 ,斑地
锦有清热解毒 、活血止血 、抗病原微生物等特性 。斑
地锦化学成分主要为鞣质 、黄酮类 、萜类及淄醇
等 [ 2] 。有资料表明斑地锦对多种致病菌有明显抑制
及杀菌作用 [ 3] 。试验中采用正交试验法选取斑地锦
总黄酮提取的最佳条件 ,并且利用斑地锦提取液对鱼
类细菌性败血症致病菌———温和气单胞菌的抑菌效
果进行了探讨 。
1　材料与方法
1.1　材　料
试验所用斑地锦采于重庆市荣昌县郊区 。采回
后将斑地锦洗净烘干粉碎备用。标准品为芦丁 ,由中
国医药上海化学试剂公司提供 ,其余试剂均为分析
① 收稿日期:2005-08-06
基金项目:重庆市科学技术委员会《防治鱼类细菌性败血病特效中草药及疫苗的研究 》资助项目(6849)
作者简介:邵　留(1980-),女 ,浙江温岭人 ,西南大学硕士研究生 ,从事水产动物病理学研究。
＊为通讯作者
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2005.06.038
纯 。试验用菌分离自患病草鱼 ,并经专业老师鉴定为
温和气单胞菌(Aeromonassobvia)。
1.2　提取方法
1.2.1　浸渍法　称取 2.0g斑地锦粗粉置于纱布包
中 ,先用 50 mL稀 HCl在 70℃条件下浸提 1 h,然后
分别用乙醚及 85%的乙醇 24 mL作为浸提剂 ,在索
氏提取仪中恒温 33℃(乙醇为 76℃)浸提 1 h,共 3
次 。合并浸提液 ,水浴加热回收浸提剂 ,加水定容至
50 mL,低温保存备用。
1.2.2　连续回流法　称取 2.0 g斑地锦粗粉置于纱
布包中 ,加 50 mL稀 HCl作为浸提剂 70℃条件下浸
提 1 h,然后在索氏提取仪中分别用乙醚和乙醇 24
mL恒温 76℃加热回流提取 1 h,共 3次。水浴加热
回收提取剂 ,加水定容至 50 mL,低温保存备用。
1.3　总黄酮最佳提取条件优选
1.3.1　标准曲线的制备　精密吸取干燥至恒重的芦
丁对照品 10.0 mg,加甲醇溶解 ,转入 50 mL容量瓶
中 ,用甲醇稀释至刻度 ,摇匀即得 0.2mg/mL的对照
品液。精密吸取该液 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0,
6.0mL分别置 25 mL比色管中 ,加水至 6mL,加 5%
亚硝酸钠试液 1.0 mL,放置 6 min,加 10%硝酸铝试
液 1.0 mL,放置 6 min,再加 10%氢氧化钠试液 10
mL,加水至刻度 ,摇匀 ,放置 15 min,以第 1管溶液为
空白 ,采用 S53 /54紫外可见分光光度计于 500 nm
处测定吸光度 [ 4] 。以浓度(C)与吸光度 (A)进行直
线回归 ,得回归方程为 Y=0.066 1 X+0.000 6 R2 =
0.999 3,在 0.008 ～ 0.048 mg/mL范围内线性关系良
好 。
1.3.2　正交实验设计　采用乙醇连续回流法进行正
交实验设计 ,选用乙醇浓度 、提取时间 、提取溶剂加倍
量及提取次数 4个因素 ,每个因素选择 3个水平 ,用
L9(34)正交表进行实验条件优选 ,见表 1。
表 1　因素水平表
Table1　Factorsandlevels
水　平 A乙醇浓度/%
B提取时间
/h
C溶剂
加倍量
D提取
次　数
1 65 1 6 2
2 75 1.5 9 3
3 85 2 12 4
1.3.3　提取液总黄铜含量的测定　精密吸取样品液
1 mL,置于 25 mL比色管中 ,按标准曲线制备法测定
吸光度并计算总黄酮含量 。
1.4　抑菌试验
将鉴定后的菌种接种于液体培养基中 ,在振荡培
养箱中恒温 32℃培养 24h。在无菌条件下采用菌基
混合加药法 ,待培养基冷却到 45℃左右把培养好的
菌液到入其中混匀 ,到入培养皿中 ,打孔 ,用微量注射
器加提取液 ,满而不溢 ,约为 25 μL/孔 。同时做无菌
培养基和有菌培养基(不加药液)各做一对照。 37℃
恒温培养 24 h,观察。按不同提取条件 、直径 、最佳提
取条件提取不同月份的斑地锦做抑菌试验 。
1.5　最低抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定
选用经最佳工艺提取的药液按二倍稀释法与液
体培养基混匀成各种浓度。取 6支试管分别加入 2
mL液体培养基 ,加 2 mL药液于第 1支试管中 ,混匀
后取出 2mL加入第 2管中 ,然后依次取出 2mL移入
下一管 ,到第 6管时弃去 2mL,再在这 6管中分别加
入 0.1 mL培养好的菌液。另取 7支试管不加菌作为
空白对照。 37℃恒温培养 24h,观察记录澄清不长细
菌的最高稀释度就是最低抑菌浓度;培养 48 h,观察
记录澄清不长细菌的最高稀释度就是最小杀菌浓
度 [ 8] 。
2　结　果
2.1　提取方法的比较
试验比较了 2种溶液 、2种提取方法对提取液总
黄酮含量的影响 ,具体结果见表 2。可以看出连续回
流法要优于浸渍法 ,并且乙醇提取的效果明显比乙醚
好 。
表 2　地锦草不同提取方法与总黄铜含量的关系
Table2　Comparisonofcontentsoftotalflavonoidsfromdifferentex-
tractiveways
提取方法 总黄酮含量 /mg· g-1
乙醇浸渍 4.785
乙醚浸渍 3.639
乙醇连续回流 10.455
乙醚连续回流 5.828
2.2　最佳提取条件的优选
利用正交实验法优选斑地锦最佳提取条件的结
果见表 3和表 4。各因素对试验结果的影响顺序为 D
>B>C>A。方差分析表明 A(乙醇浓度)、C(溶剂
加倍量)2因素对斑地锦总黄酮含量影响显著 , B(提
取时间)、D(提取次数)2因素对斑地锦总黄酮含量
影响极显著。乙醇连续回流提取对斑地锦总黄酮含
量的主要影响因素为提取次数 ,其次是提取时间 。优
选出的最佳提取条件为 A1B3C3D3 ,即 65%的乙醇 12
倍量提取 4次 ,每次 2h条件下提取液总黄酮含量最
高 。
903第 27卷第 6期　　　　　　　　　邵　留等　斑地锦总黄酮的提取及抑菌作用
表 3　正交实验设计及结果
Table3　Arrangementandresultsoftheorthogonaltest
表头设计 A B C D 实验结果
列　号 1 2 3 4 总黄酮含量Ⅰ /mg· g-1 总黄酮含量Ⅱ /mg· g-1 Tt
1 1 1 1 1 8.472 7.398 15.870
2 1 2 2 2 12.521 14.049 26.570
3 1 3 3 3 18.057 19.172 37.229
4 2 1 2 3 13.678 12.273 25.951
5 2 2 3 1 13.182 12.810 25.992
6 2 3 1 2 15.826 11.860 27.686
7 3 1 3 2 10.662 10.249 20.911
8 3 2 1 3 13.058 13.347 26.405
9 3 3 2 1 10.951 10.703 21.654
T1 79.670 62.732 69.961 63.516
T2 79.628 78.967 74.175 75.167
T3 68.970 86.569 84.131 89.585
R 10.700 23.837 14.170 26.069
表 4　方差分析
Table4　Analysisofvariance
来　源 平方和 自由度 均　方 F F0.05 F0.01
A 12.672 2 6.336 4.923＊ 4.459 8.649
B 49.422 2 24.711 19.200＊＊
C 17.649 2 8.825 6.857＊
D 56.844 2 28.422 22.084＊＊
误　差 10.298 8 1.287
　　注:＊＊表示此因素对斑地锦总黄酮含量影响极显著;＊表示此因素对斑地锦总黄酮含量影响显著。
Note:＊＊ MeansthefactoraverysignificantefectonthecontentoftotalflavonoidsofflebraEuphorbiaemaculatae;＊meanstheefectissignificant.
表 5　不同月份斑地锦提取液总黄酮含量与抑菌圈大小的关系
Table5　Totalflavonoidscontentandthesideofbacteriostasis
材料来源 总黄酮含量 /mg· g-1 抑菌圈大小 /cm
7月重庆 19.461 8 1.633
9月重庆 18.263 3 1.550
10月重庆 17.643 6 1.500
11月重庆 13.264 5 1.300
2.3　斑地锦提取液总黄酮的抑菌活性
不同月份斑地锦提取液总黄酮含量与抑菌圈大
小的关系见表 5。根据表 5的数据 ,以抑菌圈大小及
总黄酮含量进行直线回归 ,得回归方程为 Y=18.968
X-11.214, r=0.993。由此可看出抑菌圈大小与总
黄酮含量线性关系良好 ,即可初步断定黄酮类是斑地
锦主要的抑菌成分之一 。
2.4　最低抑菌浓度与最小杀菌浓度
斑地锦提取物最低抑菌浓度 MIC与最小杀菌浓
度 MBC的结果见表 6。由表 6可以得出斑地锦提取
物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为 1.25 mg/mL,
最小杀菌浓度为 10 mg/mL。
表 6　斑地锦总黄酮最低抑菌浓度与最小杀菌浓度
Table6　MICandMBC
管　号 1 2 3 4 5 6 7
浓　度 /mg· mL-1 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.312 5
细菌生长情况　 24h — — — — — + +
　　　　　　　 48h — — + + + + +
　　注:+表示有菌生长;―表示无菌生长。
Note:+meanshavingbacteria;-meansnobacteria.
904 西　南　农　业　大　学　学　报　(自然科学版)　　　　　　　　2005年 12月
3　讨　论
3.1　提取剂对斑地锦总黄酮含量的影响
许多文章在提取中草药时均采用水煎煮的方式 ,
而其他一些作者通过试验得出采用有机溶剂提取中
草药其效果要明显优于水提法 [ 5 ～ 6] ,其原因是斑地锦
有效物质在水中的溶解度不大 ,用水提法不容易提取
完全。从表 1可以看出 ,选用乙醇作为提取剂效果明
显优于乙醚 ,其原因是乙醇的溶解性能比乙醚好 ,对
中草药细胞的穿透能力也比乙醚强 ,此外相比较而言
乙醇还具有来源方便 、价格便宜 、对人危害少 、操作安
全 、提取效率高等优点 ,因此从斑地锦中提取总有效
成分应采用乙醇为提取剂 , 这与叶文峰所述相符
合 [ 7] 。
有关生药总黄酮提取工艺的报道较多 ,其中乙醇
浓度影响较大 。一般认为乙醇浓度增高有利于总黄
酮的提取 ,但试验得出提取斑地锦总黄酮时采用 65%
乙醇效果最佳 ,这可能是由于斑地锦黄酮甙含量较高
所致。李苑等就曾报道高浓度的乙醇(90% ～ 95%)
适宜于提取黄酮甙元 , 60%左右浓度的乙醇适宜于提
取黄酮甙类 [ 9] 。邸铁锁等(1991)报道低浓度乙醇提
取液效果优于高浓度乙醇提取液 [ 10] ,这与试验结果
是一致的。
3.2　提取方法对斑地锦总黄酮含量的影响
从试验结果可知连续回流法结果要优于浸渍法 ,
这与许勇报道的一致 [ 8] 。这可能是由于浸渍法溶剂
加倍量不足引起的 ,但若增加溶剂加倍量又会造成溶
剂的不必要浪费 ,提高成本;此外也可能是由于连续
回流法纱布包内外浓度差大更有利于总黄酮的提取
而浸渍法内外浓度差很快达到平衡造成的。另一方
面 ,连续提取法具有减少溶剂消耗 ,提高浸出效率 ,提
取较为安全等优点 。故采用连续提取法优选最佳提
取条件较好 。
3.3　预处理对提取液总黄铜含量的影响
在试验预试过程中发现 HCl预处理对提取液总
黄酮含量有影响 ,即先用稀 HCl浸提处理对斑地锦总
黄酮的提取有促进作用 ,这可从以下 2方面来解释:
其一 , HCl可能起到了浸泡药物的作用 ,从而有利于
有机溶剂对总黄酮的提取 。其二 ,先用 HCl酸化可以
使一些本来不溶于有机溶剂的物质转化为了可溶的
物质 ,从而对提取起到促进作用[ 4] 。
3.4　斑地锦总黄酮的抑菌活性
通过分析斑地锦提取物中总黄酮含量与抑菌圈
大小的线性关系可得 ,总黄酮是起主要作用的抑菌成
分之一 ,其含量的大小直接影响到抑菌效果的好坏 。
这与许多资料中提及的黄酮类是主要的抑菌成分的
说法是一致的。
致谢:论文完成过程中得到了西南大学荣昌校区
药学系曾中良 ,罗音久老师及水产学院田海军等同学
的大力帮助 ,在此一并表示感谢。
参考文献:
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