全 文 ：中南药学 2014 年 8 月 第 12 卷 第 8 期　Central South Pharmacy. August 2014, Vol. 12 No. 8
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1101-1107.
[5] Xu SX，Li YC，Liu X，et al. In vitro and in vivo antifun-
gal activity of a water-dilutable cassia oil microemulsion
against geotrichum citri-aurantii [J]. J Sci Food Agric，
2012，92（13）：2668-2671.
[6] Chidamabara Murthy KN，Jayaprakasha GK，Patil BS. Citrus
limonoids and curcumin additively inhibit human colon cancer
cells [J]. Food Funct，2013，4（5）：803-810.
[7] Langeswaran K，Gowthamkumar S，Vijayaprakash S，et al.
Infl uence of limonin on Wnt signalling molecule in HepG2 cell
lines [J]. J Nat Sci Biol Med，2013，4（1）：126-133.
[8] Kim J，Jayaprakasha GK，Patil BS. Limonin and their anti-
proliferative and anti-aromatase properties in human breast can-
cer cells [J]. Food Funct，2013，4（2）：258-265.
[9] Roy A，Saraf S. Limonoids：overview of signifi cant bioactve
triterpenes distributed in plants kingdom [J]. Biol Pharm Bull，
2006，29（2）：191-201.
[10] Hamdan D，EI-Readi MZ，Tahrani A，et al. Secondary me-
tabolites of ponderosa lemon（Citrus pyriformis）and their
antioxidant，anti-infl ammatory，and cytotoxic activities [J]. Z
Naturforsch C，2011，66（7-8）：385-393.
[11] Balestrieri E，Pizzimenti F，Ferlazzo A，et al. Antiviral acti-
vity of seed extract from Citrus bergamia towards human retro-
viruses [J]. Bio org Med Chem，2011，19（6）：2084-2089.
（收稿日期：2013-12-04；修回日期：2014-02-20）
高效液相色谱法测定龙脷叶中山柰酚 -3-O-
龙胆二糖苷的含量
何鹏 1，王国才 2，李药兰 2，金建平 1，金阳 1 （1. 芜湖市食品药品检验所，安徽 芜湖 241006；2. 暨南大学药学院，
广州 510632）
摘要：目的　建立高效液相色谱法测定龙脷叶中山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷的含量。方法　色谱柱为 Inersil
ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇 -0.4%磷酸溶液（48∶ 52），检测波长为 349
nm，柱温为 35℃，流速为 1.0 mL·min－ 1。结果　山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷在 0.110 8～ 1.108 0 μg与峰面积
线性关系良好（r＝ 1.000）。平均加样回收率为 103.3%，RSD为 1.2%（n＝ 6）。结论　所建立方法操作简
便，准确可靠，可用于龙脷叶的质量控制。
关键词：龙脷叶；山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1, R917　　　　文献标识码：A　　　文章编号：1672-2981(2014)08-0811-03
doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2014.08.026
Content determination of kaempferol-3-O-gentiobioside in
Sauropi Folium by HPLC
HE Peng 1, WANG Guo-cai 2, LI Yao-lan 2, JIN Jian-ping 1, JIN Yang 1 (1. Wuhu Institute for Food and Drug Control,
Wuhu Anhui 241006; 2. College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510562)
Abstract: Objective To establish a method for the determination of kaempferol-3-O-gentiobioside in Sauropi Folium
by HPLC. Methods The sample was separated on the Inersil ODS-3 C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), by using
methanol-0.4% phosphoric acid (48 ∶ 52) as the mobile phase at 1.0 mL·min － 1 . The column temperature was
at 35 ℃ . The detection wavelength was 349 nm. Results The linear range of kaempferol-3-O-gentiobioside was at
0.110 8－ 1.108 0 μg (r＝ 1.000). The average recovery was 103.3% and RSD was 1.2% (n＝ 6). Conclusion This
method is simple and reliable, which can be used to control the quality of Sauropi Folium.
Key words：Sauropi Folium; kaempferol-3-O-gentiobioside; HPLC
作者简介：何鹏，男，主要从事药品检验工作，Tel：（0553）5853053，E-mail：frankwade@126.com
　　龙脷叶为大戟科植物龙脷叶 Sauropus spatulifolius
Beille的干燥叶 [1]，具有润肺止咳、通便、生津健胃等功
效 [2]，用于痰火咳嗽、喉痛、急性支气管炎等 [3]，主要产
于我国云南、四川、广东和广西等地。龙脷叶是中国药典
2010年版一部收载品种，正文中暂无含量测定项。目前
关于龙脷叶的薄层鉴别研究 [4]和挥发油的测定研究 [2]已
有报道，但是尚未见到关于其指标成分含量测定的文献报
道。本文建立了龙脷叶中黄酮苷成分山柰酚 -3-O-龙胆二
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糖苷的含量测定方法，简便快捷，准确可靠，为龙脷叶的
质量控制提供了依据，本次研究也将为新版药典品种龙脷
叶的标准修订奠定基础。
　　前期我们对龙脷叶进行了基础研究，包括成分提取、
分离、纯化和药理筛查，发现龙脷叶中主要含有单萜、倍
半萜、香豆素、黄酮苷等多种生物活性成分，其中黄酮苷
成分山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷具有抗炎、止咳、解痉、抗
溃疡等功效，是龙脷叶的主要有效成分，特征性较强，专
属性较好，能够体现与代表龙脷叶药材的功能与主治，而
且含量较其他成分高，性质相对稳定，故最终选择山柰
酚 -3-O-龙胆二糖苷作为含量测定的指标成分。
1　仪器与试药
　　Waters e2695 高效液相色谱仪（美国沃特世公司），
Waters 2489紫外检测器（美国沃特世公司），JU-2106
超声波清洗器（上海杰恩普公司），Mettler Toledo
XP205电子分析天平（精度：0.01 mg，瑞士梅特勒托利
多公司），KEDA UV-VIS 8500紫外 -可见分光光度计（无
锡科达公司）。山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品由暨南大
学药学院标定并提供（用 HPLC法制备，液质联用法测
定含量为 100%，批号：20130301）；甲醇为色谱纯，水
为超纯水，其余试剂均为分析纯；15批龙脷叶（产自广
东、广西，由芜湖市食品药品检验所中药室金阳教授鉴定，
见表 3）。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
　　色谱柱为 Inersil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，
5 μm）；流动相为甲醇 -0.4%磷酸溶液（48∶ 52）；检
测波长为 349 nm；柱温为 35℃；流速为 1.0 mL·min－ 1；
进样量为 10～ 20 μL。理论板数按山柰酚 -3-O-龙胆二
糖苷峰计算应≥ 3 000。在此条件下山柰酚 -3-O-龙胆二
糖苷峰与其他相邻色谱峰均达到有效分离，分离度均＞
1.5，见图 1。
摇匀，即得山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品储备液（0.110 8
mg·mL－ 1）；精密量取上述储备液 5 mL，置 10 mL量
瓶中，加 50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得山柰酚 -3-O-
龙胆二糖苷对照品溶液（浓度为 0.055 4 mg·mL－ 1）。
2.3　供试品溶液的制备
　　取本品粉末（过二号筛）约 1 g，精密称定，置具塞
锥形瓶中，精密加入 50%甲醇 25 mL，密塞，称定重量，
超声处理（功率 250 W，频率 33 kHz）40 min，放冷，
再称定重量，用 50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，
取续滤液，即得。
2.4　线性关系考察
　　分别精密吸取山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品溶液 2、
5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下
色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以山柰
酚 -3-O-龙胆二糖苷的进样量为横坐标（X），绘制标准
曲线，得回归方程：Y＝ 1.572×106X－ 3.239×104（r
＝ 1.000）。山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷在 0.110 8～ 1.108
μg与峰面积呈现良好的线性关系。
2.5　精密度试验
　　精密吸取山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品溶液 10
μL，按“2.1”项下色谱条件，连续进样 6次，记录峰面积。
结果 RSD为 0.11%，表明仪器精密度良好。
2.6　稳定性试验
　　取样品（批号：20121116）1份，按“2.3”项下方
法制备供试品溶液，室温放置，分别于 0、2、4、6、8 h
时进样测定，记录峰面积。结果 RSD为 0.59%，表明室
温下供试品溶液至少在 8 h内稳定。
2.7　重复性试验
　　取同一批号样品（批号：20121116）6份，分别按“2.3”
项下方法制备供试品溶液，进样测定含量。结果 RSD为
0.24%，表明方法重复性良好。
2.8　加样回收试验
　　取已知含量的样品（批号：20121116）6份，每份 0.5 g
（含水 11.1%），精密称定，分别精密加入山柰酚 -3-O-
龙胆二糖苷对照品储备液（0.110 8 mg·mL－ 1）3 mL，
按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回
收率，结果见表 1。
2.9　耐用性试验
　　取同一批号样品（批号：20121116）2份，按“2.3”
项下方法制备供试品溶液，分别在不同厂家、型号的色
谱柱、液相色谱仪、检测器上按“2.1”项下色谱条件进
行测定，结果见表 2，表明耐用性良好。
2.10　样品含量测定
　　取 15批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，
进样测定含量（均按干燥品计算），算得平均含量为 0.044
6%，考虑到药材产地、加工、储藏等因素及有关规定，
暂定本品山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷含量应不低于平均含量
的 80%，即按干燥品计算，含山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷应
≥ 0.036%（见表 3）。
3　讨论
3.1　检测波长的选择
　　取山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品溶液，在 200～
400 nm波长内扫描，山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品在
2.2　对照品溶液的制备
　　精密称取山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品 11.08 mg，
置 100 mL量瓶中，加入 50%甲醇溶解并稀释至刻度，
图 1 龙脷叶的高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatogram of Sauropi Folium
A.山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷对照品（kaempferol-3-O-gentiobioside）；
B.龙脷叶样品（Sauropi Folium sample）
0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 t/min
0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 t/min
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268、349 nm处有最大吸收，再取供试品溶液注入液相色
谱仪进行预试验，发现在 268 nm下供试品中山柰酚 -3-O-
龙胆二糖苷峰存在明显的杂质干扰，难以达到基线分离，
而在 349 nm下目标成分峰与相邻峰达到了有效分离，而
且峰形较好，故选择 349 nm作为检测波长。
3.2　流动相的选择
　　参考文献资料 [5-7]，分别考察了不同比例的甲醇 -
水、甲醇 -0.4%磷酸溶液、乙腈 -0.4%磷酸溶液、甲
醇 -1%冰醋酸溶液等多种系统作为流动相。结果发现以
甲醇 -0.4%磷酸溶液（48∶ 52）作为流动相时山柰酚 -3-O-
龙胆二糖苷峰保留时间适中，拖尾因子和不对称度均较
理想，供试品中目标物质峰与相邻杂质峰分离效果好。
3.3　提取条件的选择
　　曾比较了 50%甲醇、乙醇、甲醇的提取效果，结果
以 50%甲醇的提取效果最好。考察超声提取和加热回流
提取的差别，发现两者提取效果相差无几，而超声提取
法简便易行，故确定提取方法为超声处理法。比较不同
溶剂用量（10、25、50、100 mL）的提取率，发现加入
溶剂 10 mL时提取效果差，后 3个用量的提取效果几乎
没有变化，考虑环保及节约试剂的因素，选择加入溶剂
量为 25 mL。最后提取时间比较了 10、20、40、60 min
的效果，发现含量随着提取时间略有增大，当超声处理
表 3 样品中山柰酚 -3-O-龙胆二糖苷含量测定结果
Tab 3 Sample determination
批号
（No.）
含量
（content）/%
批号
（No.）
含量
（content）/%
20121116 0.075 6 20130512 0.087 4
20130222 0.051 8 20130517 0.036 2
20130301 0.057 2 20130523 0.018 7
20130321 0.027 1 20130527 0.031 5
20130406 0.051 6 20130605 0.041 5
20130413 0.036 1 20130402 0.037 6
20130418 0.050 4 130811 0.018 6
20130426 0.047 4
表 2 耐用性试验结果
Tab 2 Robustness tests
色谱柱
（column）
液相色谱仪（liquid
chormatograph）
检测器
（detection）
结果
（result）
Inersil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm） Agilent 1260 Agilent 1260 VWD 峰形良好，拖尾因子适中，分离度良好
Inersil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm） Shimadzu LC-20AT Shimadzu SPD-M20A DAD 峰形良好，拖尾因子适中，分离度良好
Waters SunFire C18（250 mm×4.6mm，5 μm） Waters e2695 Waters 2489 峰形良好，拖尾因子适中，分离度良好
Phenomenex Luna 5u（250 mm×4.6 mm，5 μm） Waters e2695 Waters 2489 峰形良好，拖尾因子适中，分离度良好
Inersil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm） Waters e2695 Waters 2489 峰形良好，拖尾因子适中，分离度良好
表 1 加样回收试验结果 (n＝ 6)
Tab 1 Recovery (n＝ 6)
取样量
（sample weight）/g
样品中含量（sample
content）/mg
加入量（added
amount）/mg
测得量（detected
amount）/mg
回收率
（recovery）/%
平均回收率
（average recovery）/%
RSD
/%
0.505 8 0.339 9 0.332 4 0.675 5 101.0 103.3 1.2
0.504 0 0.338 7 0.332 4 0.681 4 103.1
0.507 7 0.341 2 0.332 4 0.687 7 104.2
0.508 5 0.341 8 0.332 4 0.685 8 103.5
0.509 4 0.342 4 0.332 4 0.689 3 104.4
0.515 4 0.346 4 0.332 4 0.690 1 103.4
40 min时已近最大值，故选择超声提取时间为 40 min。
3.4　含量的差异
　　本次研究选择了 15批样品进行含量测定，由结果可
知个别批次含量偏差较大。由于药材样品来源于广西、
广东、四川等多个产地，产地不同可能导致含量有所差
异；药典规定采收季节为夏、秋二季，两季时间长达数
月，且不同产地气候不同，不同的时间点叶子的生长状
况和成熟度也不相同，故采收时间可能与含量也有着一
定的关系；另外，本品药用部位为干燥叶，包括了叶片、
叶柄和托叶，在同一片叶中，三者的山柰酚 -3-O-龙胆二
糖苷含量可能也不相同，而且采集的药材可能部分是完
整叶，部分仅有叶片，这样也可能导致采集的药材含量
有所偏差。因此，药材产地、采收时间、药材各部位的
差异与完整性等可能是影响龙脷叶含量的因素，在今后
的工作中我们将增加样品批次，作进一步的研究考证。
参考文献
[1] 中国药典 2010年版 .一部 [S]. 2010：90.
[2] 汪小根，邱蔚芬 .龙脷叶挥发油的气 -质联用分析 [J].食品
与药品，2007，9（5）：19-20.
[3] 中国科学院植物研究所 .中国植物志 [M].北京：科学出版社，
2005：167.
[4] 刘蓉 .龙脷叶质量分析与抗炎镇痛作用研究 [D].南宁：广
西中医学院，2009.
[5] 谭健兵，黄明菊，曾光尧，等 .高效液相色谱法测定肿节
风药材中异嗪皮啶与山柰酚 -3-O-葡萄糖醛酸苷的含量 [J].
中南药学，2009，7（3）：177-178.
[6] 于丹，成禹杉，胡尚钦，等 .红花及其白花变种中总黄酮
及山柰酚 -3-O-芸香糖苷的含量测定 [J].华西药学杂志，
2010，25（6）：751-753.
[7] 易长英 .高效液相色谱法测定复方矮地茶止咳合剂中的槲
皮素和山奈酚含量 [J].中南药学，2014，12（1）：66-69.
（收稿日期：2014-01-20；修回日期：2014-04-20）