全 文 ：·中草药· 北方园艺２０１３（０７）：１７０～１７２
第一作者简介：徐琴（１９７８－），女，硕士，助理研究员，现主要从事植
物培养等研究工作。
基金项目：中科院“西部行动计划高新技术”资助项目（ＫＧＣＸＺ－
ＹＷ－５０９）。
收稿日期：２０１２－１２－１３
苘麻叶肉原生质体的分离和培养研究
徐 琴１，王 晓 军１，王 卉１，２，刘 敏１，郝 秀 英３
（１．中国科学院 新疆理化技术研究所，新疆 乌鲁木齐８３００１１；２．中国科学院 研究生院，北京１０００３９；
３．新疆农业科学院 微生物应用研究所，新疆 乌鲁木齐８３００９１）
摘 要：以苘麻的叶片、种子为试材，对苘麻叶肉原生质体游离培养过程的影响因素进行了
研究。结果表明：采用无菌苗幼叶作为原生质体分离起始材料效果较好；质壁分离４ｈ，纤维素酶
０．５％＋离析酶０．３％组合酶解１２～１４ｈ可以获得产量和活力较高的原生质体。在有机成分较丰
富的ＤＰＤ培养基中，细胞生长较为旺盛。
关键词：苘麻；原生质体；游离
中图分类号：Ｓ ５６３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１３）０７－０１７０－０３
苘麻（Ａｂｕｔｉｌｏｎ ａｖｉｃｅｎｎａｅ）又名青麻，在中国的种植
和利用已有悠久历史，为韧皮纤维作物，茎皮产生一种
长而强韧的纤维，可用来制麻绳、麻袋［１］。苘麻可以入
药。全草味苦，性平，能解毒、祛风，治痢疾、中耳炎、耳
鸣、耳聋、关节酸痛等。种子性味甜，无毒，能清热利湿、
解毒、退翳，用于治疗赤白痢疾、淋病涩痛、痈肿目翳、瘰
疬。根味苦、性平，有消炎、利尿、下乳等作用［２］。对苘麻
叶肉原生质体的分离培养及其影响因素的作用的研究，
可以为苘麻的遗传转化，体细胞融合和良种的筛选培育
提供一条新的技术途径。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
苘麻的叶片、种子均来源于新疆农业科学院种植试
验场。
１．２ 试验方法
１．２．１ 野外采集叶片的消毒 从野外采集的叶片先用
自来水和洗洁精洗去表面灰尘，７０％乙醇浸泡３０ｓ，放入
０．１％ＨｇＣ１２溶液中消毒３～４ｍｉｎ，１５％的Ｈ２Ｏ２中浸泡
１５ｍｉｎ，用无菌水冲洗３～４次，无菌滤纸吸干水分待用。
１．２．２ 无菌苗幼叶的获得 苘麻种子先用７０％乙醇浸
泡３０ｓ，放入０．１％ＨｇＣ１２溶液中消毒６～８ｍｉｎ，在１５％
的Ｈ２Ｏ２中浸泡３０ｍｉｎ后，用无菌水冲洗３～４次，接种
于含ＭＳ培养基中，２５℃恒温培养，５～７ｄ可以发芽，再
培养１０ｄ左右，剪取幼叶作为试验材料。
１．２．３ 原生质体的分离纯化 将叶片去掉大的叶脉，切
碎，按照１∶１０比例加入质壁分离液（ＣＰＷ溶液加１３％
的甘露醇，ｐＨ ５．６），质壁分离后按照同样比例转入酶解
液（ＣＰＷ溶液加１０％的甘露醇、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ和不同
浓度组合纤维素酶、离析酶见表１，ｐＨ ５．６）中于摇床
上轻摇（８０ｒ／ｍｉｎ）酶解（２８℃黑暗条件下），酶解后用
４００目不锈钢细胞筛过滤酶解分离的原生质体；滤液
８００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入原生质体清洗液
（ＣＰＷ溶液加１０％的甘露醇，ｐＨ值为５．８）离心清洗，
弃上清液，重复清洗２次；最后用原生质体培养基离心
清洗２次即可游离出原生质体［３］。ＣＰＷ 溶液成分：
ＫＨ２ＰＯ４２７．２ｍｇ／Ｌ、ＫＮＯ３１０１ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
２４６ｍｇ／Ｌ、ＫＩ １０．１６ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０．０２５ｍｇ／Ｌ、
ＣａＣ１２·２Ｈ２Ｏ １ ４８０ｍｇ／Ｌ［３］。以上所有试剂及原生质
体培养基、稀释培养基均经０．２２μｍ微孔滤膜抽滤灭
菌，所有培养基ｐＨ均为５．８［３］。
表１ 不同浓度的酶液组合
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
项目Ｉｔｅｍｓ １ ２ ３ ４ ５ ６
纤维素酶Ｃｅｌｕｌａｓｅ／％ ０．５ ０．５ ０．５ ０．３ ０．３ ０．３
离析酶 Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ／％ ０．５ ０．３ ０．１ ０．３ ０．２ ０．１
１．２．４ 原生质体计数与培养 原生质体采用血球计数
板计数原生质体产量，计算四角４个大格和中间１个大
格的原生质体细胞总数，按公式计算出细胞浓度。细胞
浓度（个／ｍＬ）＝５格内细胞总数×５×１０４×稀释倍数，
每样品重复５次，取平均值，根据稀释总体积计算出原
生质体总产量（个／ｇ）。原生质体活力用０．１％酚藏花红
进行检验［４］，每个样品重复５次，取平均值。原生质体活
力＝（未被染上红色的细胞数／细胞总数）×１００％。用
原生质体培养基按照１×１０５个／ｍＬ密度悬浮稀释获得
的原生质体，采用液体浅层方式静置恒温（２８℃）培养。
前３周暗培养，每隔５～６ｄ添加１次培养基，约加０．３～
０．５ｍＬ，３周后将培养物置于漫射光下进行培养［３］。
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北方园艺２０１３（０７）：１７０～１７２ ·中草药·
２ 结果与分析
２．１ 不同叶片材料对原生质体产量的影响
前期选材是影响原生质体产量的一个重要因素，该
试验采用了３种不同的叶片材料来收集原生质体。无
菌苗幼叶（表２中１号组）、野外采集植株顶端嫩叶（表２
中２号组）和下端老叶（表３中３号组）。其中２号组与
３号组因为均来自野外，所以都进行了灭菌处理。试验
中质壁分离时间都为４ｈ，酶液采用纤维素酶０．５％＋离
析酶０．５％组合，酶解时间为８ｈ。由表２可以看出，１号
组与２号组的产量都较高，但是１号组的细胞碎片较少，
检测时背景较干净，而且１号组的原生质体活力比２号
组、３号组都高。２号组的细胞碎片较多，检测时背景杂
乱，３号组试验效果最差，背景杂乱，产量不高，活力也很
低。故１号组即无菌苗幼叶作为分离材料收集原生质
体效果较好。
表２ 不同叶片材料对原生质体产量的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｌｅａｖｅｓ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
项目Ｉｔｅｍｓ １ ２ ３
产量Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｙｉｅｌｄ／×１０５个·ｇ－１ ２．０４ １．９６ ０．６７
原生质体活力Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｖｉｔａｌｉｔｙ／％ ７０．５ ６２．３ ４０．３
细胞碎片Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌ ＋ ＋＋ ＋＋＋
注：细胞碎片的多少以“＋”来表示。下同。
２．２ 不同质壁分离时间对原生质体产量和活力的影响
质壁分离时间的长短会影响酶解效果。该试验采
用了２、３、４、５、６ｈ５种不同的时间处理，酶液组合依旧采
用纤维素酶０．５％＋离析酶０．５％组合，酶解时间为８ｈ。
由表３可知，其中４ｈ的原生质体产量最高，而原生质体
活力以３ｈ最高。随着时间的延长，５、６ｈ的原生质体产
量下降，活力也大大下降，镜检时也可以看到很多破裂
的细胞碎片。综合不同时长质壁分离后所获得的原生
质体活力和产量的结果，质壁分离４ｈ为最佳时长。
表３ 不同质壁分离时间对原生质体
产量和活力的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
项目Ｉｔｅｍｓ
质壁分离时间／ｈ
２ ３ ４ ５ ６
产量Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｙｉｅｌｄ／×１０５个·ｇ－１ １．２３ １．３４ ２．２３ １．７２ １．８８
原生质体活力Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｖｉｔａｌｉｔｙ／％ ６５．３ ７０．１ ６７．１ ５６．０ ５２．３
２．３ 不同酶液组合以及不同酶液浓度对原生质体产量
的影响
酶解步骤是收集原生质体的关键步骤，酶液的种类
与组合都直接影响到所收的原生质体的产量以及所获
得的原生质体活力的大小。用不同浓度组合的纤维素
酶与离析酶处理试验材料（表１），一共进行了６个处理，
酶解时间都为８ｈ。由表４可以看出，２号组原生质体产
量最高，其次是４号组与５号组，１号组、３号组、６号组
原生质体产量都较低。２号组、３号组、５号组、６号组获
得的原生质体活力都比较高，３号组和６号组细胞碎片
少，１号组细胞碎片相比较其它是验组要多。综合试验
结果，２号组的原生质体产量高而且原生质体活力也较
高，细胞碎片相对较少，２号组即纤维素酶０．５％＋离析
酶０．３％试验结果好于其它酶液组合。
表４ 不同酶液组合以及不同酶液浓度对
原生质体产量和活力的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
项目
Ｉｔｅｍｓ
产量
Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｙｉｅｌｄ／×１０５个·ｇ－１
原生质体活力
Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｖｉｔａｌｉｔｙ／％
细胞碎片
Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌ
１ ２．１０ ６８．６ ＋＋＋＋
２ ３．４４ ７１．４ ＋＋
３ １．５６ ７５．０ ＋
４ ３．０２ ６９．０ ＋＋
５ ２．８８ ７０．７ ＋＋
６ １．２５ ７３．２ ＋
注：细胞碎片的多少以＋来表示。
２．４ 不同酶解时间对原生质体产量与活力的影响
酶解时间的长短也是影响原生质体产量的一个因
素，采用筛选出的最佳酶液组合，即纤维素酶０．５％＋离
析酶０．３％组合对苘麻无菌苗幼叶分别进行４、８、１０、１２、
１４、１６ｈ的酶解处理。由图１可以看出，在４～１４ｈ内，
随着酶解时间的增加，原生质体产量也相应提高，其中，
酶解１２ｈ的原生质体产量为３．８０×１０５个／ｇ，酶解１４ｈ
则达到４．１５×１０５个／ｇ。酶解时间超过１４ｈ后，由于悬
浮液中原生质体破裂加速，镜检时也可以发现原生质体
细胞碎片明显增多，原生质体产量也相应下降。在图２
中，前期４、８、１０ｈ原生质体活力变化不大，１２ｈ的原生
质体活力达到最高值８４．５％，１４ｈ有一定的下降，为
７６．７％，１４～１６ｈ原生质体活力迅速下降。说明酶解时
间最好不要超过１４ｈ为宜，时间过长，对原生质体的产
量及活力都有很大的影响。
图１ 不同酶解时间对原生质体产量的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
２．５ 不同培养基对原生质体培养的影响
将所收集到的原生质体细胞调整密度稀释至
０．９２×１０５个／ｍＬ，添加激素６－ＢＡ １．０＋２，４－Ｄ １．５［５］，用
下面４种不同的培养基进行培养。每隔２４ｈ对培养物
镜检。由表５可以看出，ＤＰＤ培养基较其它培养基，原
生质体分裂较早，镜检时发现细胞生长也较为良好，而
ＭＳ培养基效果最差。分析原因，这４种培养基的有机
１７１
·中草药· 北方园艺２０１３（０７）：１７０～１７２
图２ 不同酶解时间对原生质体活力的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
成分差别很大，ＤＰＤ培养基的有机成分含量较其它培养
基要丰富很多，所以细胞的长势要好于其它培养基，但
是在添加培养基时，ＤＰＤ培养基的污染率也明显高于其
它培养基。
表５ 不同培养基对原生质体培养的影响
Ｔａｂｌｅ ５ Ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａｓ ｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
项目Ｉｔｅｍｓ ＤＰＤ Ｎ６ ＮＴ ＭＳ
细胞浓度
Ｃｅｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／个·ｍＬ－１
０．９２×１０５ ０．９２×１０５ ０．９２×１０５ ０．９２×１０５
２４ｈ后细胞浓度
Ｃｅｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ
２４ｈｏｕｒｓ／个·ｍＬ－１
１．１４×１０５ ０．９８×１０５ ０．９６×１０５ ０．９４×１０５
第１次分裂时间
Ｆｉｒｓｔ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｔｉｍｅ／ｄ
４ ５．５ ７ ８
图３ 分离得到的原生质体细胞
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｃｅｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
３ 讨论
在选取制备原生质体的材料上最好选用幼嫩、生长
旺盛的部位。如桑树叶肉原生质体分离采用的是培养
２０ｄ的无菌苗叶片［６］。该试验选取了野外生长植株顶
端的嫩叶和无菌苗的幼叶比较，无菌苗的幼叶效果较
好，获得的原生质体活力较高，大小、状态也比较均一
（图３），这与许多先前的报道基本一致［７－８］。
该试验最初采用７０％乙醇＋０．１％ ＨｇＣｌ２消毒的方
法，试验材料污染严重，后用７０％乙醇＋０．１％ＨｇＣｌ２＋
１５％Ｈ２Ｏ２，材料污染率大大降低。分析原因该是该试验
材料表面密被柔毛，而 Ｈ２Ｏ２浸润性较强，且毒性比
ＨｇＣｌ２弱，易洗净，所以采用７０％乙醇＋０．１％ＨｇＣｌ２＋
１５％Ｈ２Ｏ２组合的消毒方法，不仅大大降低了试验材料的
污染率，还减少了消毒过程中试验材料的损耗。
常用的叶肉细胞游离原生质体的方式是撕下叶表
皮，将叶面朝下放入酶液进行酶解的方法。该验所采用
的叶片材料不易撕下叶表皮，尤其是无菌苗叶片以及植
株顶端幼嫩叶片，因此使用了切碎材料的做法，以致后
期收集到的原生质体细胞碎片较多，所以苘麻叶肉原生
质体细胞的纯化方式还需改进和优化。
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ＸＵ Ｑｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１，ＷＡＮＧ Ｈｕｉ １，２，ＬＩＵ Ｍｉｎ１，ＨＡＯ Ｘｉｕ－ｙｉｎｇ１
（１．Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ８３００１１；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３９；３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊａｎｇ ８３００９１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ａｂｕｔｉｌｏｎ ａｖｉｃｅｎｎａｅ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｓｏｐｈｙｌ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍＡｂｕｔｉｌｏｎ ａｖｉｃｅｎｎａｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｂｕｔｉｌｏｎ ａｖｉｃｅｎｎａｅ；ｉｆ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ０．５％
ｃｅｌｕｌａｓｅ＋０．３％ ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ ｆｏｒ １２～１４ｈｏｕｒｓ，ｍｏｒｅ ｂｅｔｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗｉｌ ｂｅ ｇｏｔｔｅｎ．Ｉｎ ｔｈｅ ＤＰＤ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ
ｃｅｌｓ ｇｒｅｗ ｂｅｔｔｅｒ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｂｕｔｉｌｏｎ ａｖｉｃｅｎｎａｅ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
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