全 文 ：中国药房 2009年第 20卷第 18期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.18 · 1403·
Δ2007年湖南省科技计划项目(2007SK3071)
#通讯作者:主任药师 ,硕士 ,硕士研究生导师。研究方向:新制剂
研发、药物分析。电话:0731-2278320。E-mail:hnsrydn@sina.com
RP -HPLC 法同时测定地锦草中 4种黄酮类成分 Δ
邓 楠* ,邓银华 #(湖南省人民医院药剂科 ,长沙市 410005)
中图分类号 R284.1;R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)18-1403-02
摘 要 目的:建立以反相高效液相色谱法同时测定地锦草药材中 4种黄酮类成分含量的方法 。方法:色谱柱为 Hypersil BDS
C 18(150 mm×4.6 mm , 5 μm), 流动相为甲醇-0.3%磷酸(梯度洗脱), 流速为 1.0 mL ·min -1 , 柱温为 30 ℃, 检测波长为 360
nm 。结果:地锦草中芦丁 、槲皮素 、木犀草素和山柰酚 4种黄酮类成分的进样量分别在 0.127 2 ～ 2.034 4μg(r=0.999 9)、0.089 1 ～
1.425 6μg(r =0.999 8)、0.076 6 ～ 1.226 4μg(r =0.999 7)、0.113 0 ～ 1.808 0μg(r =0.999 8)范围内与各自峰面积积分值呈
良好的线性关系;四者平均回收率分别为 97.6%、99.4%、98.1%、101.9%, RSD 分别为 0.94%、0.73%、0.99%、1.34%(n均=9)。
结论:本方法操作方便、结果准确 、重现性好 ,可用于地锦草药材的质量控制。
关键词 地锦草;芦丁;槲皮素;木犀草素;山柰酚;反相高效液相色谱法;含量测定
Determination of Four Flavonoids in Herba Euphorbiae Humifusae by RP-HPLC
DENG Nan , DENG Yin-Hua(Dept.o f Pharmacy , Hunan Provincial Peoples Hospital , Changsha 410005 ,
China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To establish a RP -HPLC met hod fo r simultaneous dete rmination o f 4 flavono ids in Herba Eu-
phorbiae Humifusae.METHODS:The samples w ere separated on Hypersil BDS C 18 colum n(150 mm ×4.6 mm , 5 μm)with
CH 3OH -0.3%H 3PO 4 as mobile phase(gradient e lution)at a flow ra te of 1.0 mL ·min -1.The co lumn tempera ture w as m ain-
tained a t 30 ℃and the detec tive w aveleng th w as set a t 360 nm.RESULTS:The linear ranges o f 4 flavonoids including rutin ,
querce tin , luteo lin and kaempfe rol w ere 0.127 2 ～ 2.034 4 μg(r =0.999 9), 0.089 1 ～ 1.425 6 μg(r =0.999 8), 0.076
6 ～ 1.226 4 μg(r =0.999 7), 0.113 0 ～ 1.808 0 μg(r =0.999 8)respec tively , and their average recoveries w ere 97.6%,
99.4%, 98.1%and 101.9%, respectively with RSD a t 0.94%, 0.73%, 0.99%and 1.34%, respectively (a ll n=9).CON-
CLUSION :This method w as proved to be simple , accura te , reproducible and applicable f or the quality contro l of Herba Eu-
phorbiae H umifusae.
KEY WORDS Herba Euphorbiae Humifusae;Rutin;Querce tin;Luteolin;Kaempfero l;RP -HPLC ;Content de termina tion
[ J] .中国现代应用药学杂志 , 2006 , 23(8):798.
[ 3] 肖培根.新编中药志(第 3卷)[M ] .北京:化学工业出版
社 , 2002:32.
[ 4] 刘庆堂 ,李锐增 ,李 坚.紫外分光光度法测定龙胆中微
量元素硒[ J] .广东药学 , 2001 ,11(6):3.
[ 5] 周件贵 ,辛国爱.陈皮中微量元素硒的含量测定 [ J] .广
东药学 , 2003 , 13(1):7.
[ 6] 周春阳 ,张 翔 ,蔡春燕 ,等.硒和/或维生素 E对实验性
高脂血症大鼠心、肝、肾及血清中一氧化氮及一氧化氮合
酶的影响[ J] .中国药房 , 2005 , 16(1):22.
[ 7] 李改平 ,王梦亮 ,吉广庆 .硒蛋白对心血管疾病辅助治疗
的临床评价[ J] .山西医药杂志 , 2002 , 31(1):17.
[ 8] Maehira F ,M iyag i I ,Eguchi Y.Selenium regulates tran-
scription factor NF -kappa B activa tion during the a-
cutephase reaction[ J] .Cli n Chi m Acta , 2003 , 334(1 ～
2):163.
[ 9] 邓守恒 , 孙各琴 , 陈崇宏 .硒化壳聚糖对 NB4细胞的周
期阻断及与阿霉素的协同作用 [ J] .中国药房 , 2007 , 18
(10):741.
(收稿日期:2008-07-16 修回日期:2009-04-02)
地锦草为大戟科植物地锦 Euphorbia humi f usa Willd.
或斑地锦 Euphorbia maculate L.的干燥全草 , 具有清热解
毒 、凉血止血的功效 ,主要用于痢疾 、泄泻 、咳血 、尿血 、便血 、崩
漏 、疮疖痈肿的治疗 [1 ] 。化学成分研究显示 ,地锦草主要含有黄
酮类 、有机酸类 、鞣质类等化学成分 [2 , 3 ] , 其中黄酮类为主要的
活性成分 [4 ] 。有研究者通过测定黄酮的含量来控制地锦草的质
量 [5 ] 。目前 , 仅有极少数学者对地锦草药材的质量控制方法进
行了初步研究 [6 ] , 但由于检测成分较少 , 不能较全面地反映药
材的质量 。笔者采用反相高效液相色谱(RP -HPLC)法同时测
定地锦草提取物中 4种黄酮类成分 ,方法重现性好 、操作简便 、
结果准确 ,可用于地锦草药材的质量控制 。
1 仪器与试药
1100型 HPLC仪 , 包括 DAD 检测器等(美国 Agilent公
司);HS -6150型超声波清洗仪(长沙湘仪仪器有限公司)。芦
丁 、槲皮素标准品由湖南省人民医院临床药学实验室自制 , 其
含量经 HPLC检测 ,纯度均>98.5%;木犀草素对照品(批号:
111520-200504)、山柰酚对照品(批号:110861-200507)均购
于中国药品生物制品检定所;地锦草药材购于湖南省药材公
· 1404· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.18 中国药房 2009年第 20卷第 18期
司 ,经湖南省药品检验所鉴定为真品;甲醇为色谱纯 ,其余试剂
为分析纯 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:大连依利特 Hypersil BDS C 18(150mm×4.6 mm ,
5μm);流动相:甲醇-0.3%磷酸(三乙胺调 pH 2.8),梯度洗脱
(0 min , 30∶70;20 min , 45∶55);流速:1.0mL ·min -1 ;柱温:
30 ℃;检测波长:360 nm;进样量:20μL 。
2.2 系统适应性试验
按“2.1”项下色谱条件 , 将配制好的芦丁 、槲皮素 、木犀草
素和山柰酚分别进样 , 其保留时间分别为 7.817 、 12.028 、
12.995 、17.334 min 。色谱见图 1 。
2.3 溶液的制备
2.3.1 混合对照品溶液的制备:分别精密称取芦丁 、槲皮素
标准品及木犀草素 、山柰酚对照品 25.43 、17.82 、15.33 、22.60
mg ,分别置于 10 mL 容量瓶中 ,甲醇定容 ,作为贮备液 。分别精
密量取上述贮备液各 1.0 mL ,置于同一 100 mL 容量瓶中 , 甲
醇定容 ,即得混合对照品溶液 。
2.3.2 供试品溶液的制备:精密称取地锦草全草药材 0.5 g ,
斩碎后置于烧杯中 , 甲醇(每次 10 mL)超声提取 3次 , 时间分
别为 30 、20 、10 m in [7 ] 。合并提取液 , 置于同一 50 mL 容量瓶
中 ,甲醇定容 ,即得 。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取芦丁 、槲皮素 、木犀草素 、山柰酚贮备液
0.25 、0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、4.0 mL ,置于同一 100 mL 容量瓶中 ,
甲醇定容 ,微孔滤膜过滤 ,精密吸取 20μL 进样 ,记录色谱图 。
以峰面积积分值(Y)对进样量(X)进行线性回归 ,计算得回归
方程 。 4种黄酮类成分的线性关系考察结果见表 1。
表 1 4种黄酮类成分的线性关系考察结果
Tab 1 Linear relat ions of 4 flavonoids(rutin , quercetin ,
luteolin and kaempferol)
成分 回归方程 r 线性范围/μg芦丁 Y =3 704.2X+11.550 1 0.999 9 0.127 2～ 2.034 4
槲皮素 Y =3 569.1X —1.309 0 0.999 8 0.089 1～ 1.425 6
木犀草素 Y =2 568.4X+13.876 9 0.999 7 0.076 6～ 1.226 4
山柰酚 Y =3 006.5X —9.742 2 0.999 8 0.113 0～ 1.808 0
2.5 精密度试验
精密吸取“ 2.3.1”项下混合对照品溶液 20μL ,重复进样 6
次 ,记录色谱图。结果 ,芦丁 、槲皮素 、木犀草素和山柰酚峰面积
的 RSD 分别为 0.22%、0.37%、0.54%、0.68%, 表明仪器精
密度良好 。
2.6 重现性试验
精密称取斩碎的地锦草药材 0.5 g ,按“ 2.3.2”项下方法制
备供试品溶液 ,平行操作 6份 ,分别测定含量 ,记录色谱图。结
果 , 芦丁 、槲皮素 、木犀草素和山柰酚峰面积的 RSD分别为
0.79%、1.13%、1.50%、1.21%,表明方法重现性良好 。
2.7 稳定性试验
取“2.3.1”项下混合对照品溶液 ,室温下放置 ,分别于 0、1、2、
4、8 、12、24、48 h进样测定 ,记录色谱图。结果 ,芦丁 、槲皮素 、木犀
草素和山柰酚峰面积的 RSD 分别为 0.69%、 0.57%、 0.72%、
0.94%,表明供试品溶液在室温条件下放置 48 h稳定性良好 。
2.8 加样回收率试验
精密称取斩碎后的地锦草 0.5 g ,共 9份 ,分别精密加入各
成分的贮备液 0.4 、0.5 、0.6 mL 各 3份 ,按“ 2.3.2”项下方法制
备供试品溶液 ,按上述色谱条件进样 ,记录色谱图 。结果 ,芦丁 、
槲皮素 、木犀草素和山柰酚的平均加样回收率分别为 97.6%
(RSD = 0.94%)、 99.4% (RSD = 0.73%)、 98.1%
(RSD =0.99%)、101.9%(RSD =1.34%)。
2.9 样品含量测定
取地锦草药材 0.5 g , 共 3份 , 按上述方法操作 , 记录色谱
图 ,以外标法计算各成分含量 。结果 ,芦丁 、槲皮素 、木犀草素和
山柰酚的含量分别为 1.69 ～ 1.93 、 1.47 ～ 1.88 、 0.64 ～ 0.89 、
0.79 ～ 1.06 mg ·g -1。
3 讨论
3.1 目标成分的确定
根据文献报道 [2 , 3 ] ,黄酮类是地锦草的主要活性成分 ,其中
芦丁 、槲皮素 、木犀草素和山柰酚的含量较高 ,故以此 4种成分
为目标成分来研究地锦草药材的 HPLC质量控制方法 。
3.2 流动相的确定
本试验采用甲醇-0.3%磷酸 (三乙胺调 pH 2.8)为流动
相 , 并以梯度进行洗脱 , 主要是由于槲皮素和木犀草素的结构
仅相差一个羟基 , 当进行等梯度洗脱时 , 不能有效地将此 2种
成分分离 ,故使用梯度洗脱来获得满意的分离度 。
3.3 检测波长的确定
经紫外光谱扫描 , 芦丁、槲皮素 、木犀草素和山柰酚在约
250 、360 nm 波长处均有强吸收带 ,而 360 nm 波长处的吸收更
强 ,且干扰更小 ,故选择 360 nm 作为检测波长 。
参考文献
[ 1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S] .2005
年版.北京:化学工业出版社 ,2005:84.
[ 2] Yoshida T ,Amakura Y ,Liu YZ ,et al.Tannins and rela_
ted po lyphenols o f euphorbiaceous plants.XI.Three
new hydro lyzable tannins and a polyphenol g lucoside
from E uphorbia h umi f usa[ J].Chem Pharm B ull , 1994 ,
42(9):1 803.
[ 3] Deng F , Tang N ,Xu J , et al.New alpha-pyrrolidinon_
oids and g lycosides from Euphorbia hum i fusa[ J].J As_
ian Nat Prod Res , 2008 , 10(5 ～ 6):531.
[ 4] 褚小兰 ,范崔生.地锦类中草药的化学成分和药理研究概
况[ J].中国野生植物资源 , 1998 , 17(2):17.
[ 5] 王晓英 ,原红霞 ,赵云丽 ,等.RP -HPLC法同时测定地锦
草片中 3种黄酮苷元的含量 [ J] .沈阳药科大学学报 ,
2007 ,24(9):564.
[ 6] 雷 鹏 , 刘 韶 , 李新中 , 等 .HPLC 测定地锦草中槲皮
素 、山柰素的含量[ J].中药材 ,2005 ,28(8):666.
[ 7] 徐小燕.超声技术在中草药提取中的应用[ J] .中国药房 ,
2007 ,18(18):1 426.
(收稿日期:2008-12-26 修回日期:2009-05-25)