全 文 ：现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress inModern Biomedicine Vol.15 NO.35 DEC.2015
doi: 10.13241/j.cnki.pmb.2015.35.007
扁蒴藤素对人鼻咽癌 HNE2细胞增殖的抑制作用研究 *
李 暐 1 郭江睿 2△ 姚正盛 1 陈 清 1 蔡心颖 1 张志强 1
（1福建医科大学药学院 福建福州 350004；2福建医科大学附属协和医院血液科 福建福州 350004）
摘要 目的：探讨扁蒴藤素对人鼻咽癌 HNE2细胞增殖的抑制作用，明确 HSP70在肿瘤发展过程中的抑制作用。方法：噻唑蓝法
（MTT）检测扁蒴藤素对 HNE2细胞生长抑制作用，流式细胞术检测扁蒴藤素诱导 HNE2细胞凋亡，免疫印迹法检测 Caspase、
PARP、酪氨酸激酶、AKT及 Bcl-2家族蛋白表达。结果：扁蒴藤素抑制 HNE2细胞的生长，促使 Caspase 9，Caspase 3和 PARP蛋
白被切割，上调 Bim等促凋亡蛋白的表达，减少 Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表达，下调 EGFR等受体酪氨酸激酶,抑制 AKT磷酸化，
上调热休克蛋白 70（HSP70）的表达。用热休克反应抑制剂 KNK437抑制 HSP70的表达可以增强扁蒴藤素促进细胞凋亡的能力。
结论：扁蒴藤素通过下调受体酪氨酸激酶，激活 caspase介导的凋亡通路抑制鼻咽癌 HNE2细胞的增殖，抑制 HSP70的表达可增
强其抗肿瘤作用。
关键词：扁蒴藤素；鼻咽癌；酪氨酸激酶；热休克蛋白
中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2015）35-6826-05
The Growth Inhibition Effects of Pristimerin on Human Nasopharyngeal
Carcinoma Cell Line HNE2*
LI Wei1, GUO Jiang-rui2△, YAO Zheng-sheng1, CHEN Qing1, CAI Xin-ying1, ZHANG Zhi-qiang1
(1 School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou, Fujian, 350004, China;
2 Department of Hematology, Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou, Fujian, 350004, China)
ABSTRACT Objective: To investigate the inhibitory effects of pristimerin on proliferation of human nasopharyngeal carcinoma
HNE2 cells, and the inhibition of HSP70 in tumor development. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to evaluate
the growth inhibition effects of pristimerin on HNE2 cells, flow cytometry was performed to detect pristimerin induced apoptosis in
HNE2 cells, Western blotting was used to detect the expression of Caspases, PARP, Bcl-2 family protein, tyrosine kinases and AKT. Results:
Pristimerin can inhibit the growth of HNE2 cells, the Caspase 9, Caspase 3 and PARP protein was cut. Pristimerin down-regulated recep-
tor tyrosine kinases, modulated the expression of Bcl-2 family proteins, inhibited AKT phosphorylation, enhanced HSP70 expression and
finally triggered Caspases-mediated apoptotic signal transduction. The activity of inducing apoptosis of pristimerin could be enhanced
when combination of HSP70 inhibitor KNK437 with pristimerin augmented pristimerin induced apoptosis. Conclusion: Pristimerin can
induce Caspases-mediated apoptosis via modulating the expression of receptor tyrosine kinases and Bcl-2 family proteins, inhibiting AKT
phosphorylation. Inhibition of HSP70 can enhance the anti-tumor activities of pristimerin.
Key words: Pristimerin; Nasopharyngeal carcinoma; Tyrosine kinase; Heat shock protein
Chinese Library Classification(CLC): R739.6 Document code: A
Article ID: 1673-6273(2015)35-6826-05
*基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(81001453)；福建省自然科学基金青年基金项目(2010J05068)；福建省教育厅青年科技项目(JA10141)
作者简介：李暐(1978-)，男，博士，讲师，研究方向：肿瘤药理及生物技术药物，E-mail：liweil1978@163.com
△通讯作者：郭江睿（1980-），女，主治医师，研究方向：血液系统疾病及肿瘤研究，E-mail：guojiangrui1980@126.com
（收稿日期：2015-07-19 接受日期：2015-08-14）
前言
鼻咽癌(nasoplwyngeal carcinoma, NPC)是我国南方尤其是
广东省常见的一种恶性肿瘤，俗称“广东瘤”。以调强放疗为主
的综合治疗对早期鼻咽癌非常有效，但因其起病隐匿，具有强
烈的转移倾向，约 75%的患者首诊时就已到达晚期，发生局部
淋巴结和 /或远处转移，早期诊断是临床一大难题；而治疗后
复发或转移则预后极差，成为鼻咽癌治疗失败、生存率下降的
主要原因。因此，筛查鼻咽癌的肿瘤标记物，争取早期发现、合
理治疗、预测预后、监测复发，对鼻咽癌临床诊治具有极其重要
的意义[1]。相对于传统化疗药物而言，人们更关注天然抗肿瘤药
物[2]。扁蒴藤素是从卫矛科植物南蛇藤中提取得到的一种醌甲
基三萜化合物，近年来的研究发现，扁蒴藤素具有多种生物活
性，如抗氧化、抗炎等。尤其在抗肿瘤方面，目前已有研究证实，
扁蒴藤素对胃癌、宫颈癌等多种肿瘤具有显著的抑制活性，扁
葫藤素能抑制大鼠腹膜炎渗出液脂质过氧化产物 MDA的生
成，同时又能升高 SOD及 CAT的活性，扁葫藤素的抗炎作用
可能是通过增强体内抗氧化酶(SOD及 CAT)的活性，清除氧
自由基、抗脂质过氧化而产生的。但其对鼻咽癌的作用还未见
报道[3,4]。本课题组考察了扁蒴藤素对人鼻咽癌细胞 HNE2的生
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长抑制作用，并对其作用机制进行了初步探索。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
人结肠癌 HNE2 细胞系（中山大学实验动物中心 )。
KNK437（美国 Sigma公司）、二甲基亚砜、扁蒴藤素（美国 R&D
Systems公司），链霉素、氨苄青霉素、胰蛋白酶 -EDTA消化液
（美国 Life-technologies公司），达尔伯克改良胎牛血清、伊格尔
氏培养基（DMEM），噻唑蓝（美国 Sigma公司）。流式细胞仪
（美国 Becton Dickinson公司），垂直电泳仪（美国 BioRad公
司）。垂直电泳仪（美国 BioRad公司）。Annexin V/PI双染试剂
盒（南京凯基）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 培养基的标准为体积分数 10 %的胎牛血清
DMEM。培养箱的温度为 37 ℃，内含有体积分数为 5 %的
CO2，保证细胞贴壁生长。
1.2.2 噻唑蓝（MTT）检测 使用胰蛋白酶 -EDTA消化液收集
消化正在生长的细胞，将单细胞混悬液调节至密度为 5×104
mL-1，接种致 96孔培养板。在 CO2培养箱中，孵育 24 h后，加入
扁蒴藤素，扁蒴藤素需通过细胞培养液稀释，保证药物的终浓
度为 0.5、1.0、1.5、3.0、6.0 μmol·L-1。为每一浓度的药物设 3个
复孔。经过 24 h培养后，每孔加入质量浓度为 5 g·L-1的噻唑蓝
20 μL，因噻唑蓝能有溶解于磷酸盐缓冲液，继续孵育 4 h，认真
仔细吸去上清液，加入二甲基亚砜 150 μL，在摇床上震荡 10
min，在波长为 570 nm的位置，用酶标仪测定吸光度。
1.2.3 Annexin V/PI双染 在 6孔培养板上接种 HNE2细胞。
当细胞融合度达到 80 %时，加入扁蒴藤素，扁藤素浓度固定。
37℃的 CO2培养箱中孵育 24 h后，进行细胞收集，1 000 r/min-1
离心 5 min，使用磷酸盐缓冲液（PBS）反复润洗 2次，采用 An-
nexin V/PI双染试剂盒（南京凯基），按照试剂盒说明书用流式
细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.4 免疫印记法检测蛋白表达 细胞裂解液的制备：配置三
羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl缓冲液，浓度为 50 mmol·L-1，加入
氯化钠调节浓度，最终浓度为 150 mmol·L-1，再分别加入 1
mmol·L-1的正钒酸钠、2.5 g·L-1的去氧胆酸钠、1 mmol·L-1的乙
二胺四乙酸钠、1 mmol·L-1的氟化钠，待完全溶解后，加入乙基
苯基聚乙二醇（NP-40），其体积分数为 1 %。使用之前，加入苯
甲基磺酰氟化物（PMSF），浓度为 1 mmol·L-1，同时加入抑胃
肽、亮肽素及抑酶肽 1 mg·L-1。6孔培养板上接种 HNE2细胞。
细胞融合度达到 80 %时，加入一定浓度的扁蒴藤素，在 37℃
的 CO2培养箱中孵育 24 h后，弃去培养液，用 PBS反复润洗 2
遍，加入细胞裂解液，冰上平静放置 15 min，刮取细胞，12 000
r/min-1离心 20 min，取上清液，蛋白根据用考马斯亮蓝比色法
定量蛋白。细胞经药物处理好，进行收集，裂解后行蛋白定量。
从每个样品中取 30 μg总蛋白，加入上样缓冲液后混匀、煮沸，
进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转到聚偏氟乙
烯膜上，当脱脂奶粉的质量分数达到 5 %时，其 PBS溶液能够
在室温下封闭 1 h，以相应的第 1 抗体在室温下孵育 1 h，用
PBS清洗 3次后，加入辣根过氧化酶标记的第 2抗体稀释液孵
育 40 min，洗膜后用化学发光试液进行发光反应，以 β-肌动蛋
白（β-Actin）作为上样内参照。
1.3 统计学方法
用 SPSS17.0进行统计学分析，正态计量资料用 x±s表
示，组间比较采用 t检验。
2 结果
2.1 扁蒴藤素抑制鼻咽癌 HNE2细胞的生长
噻唑蓝（MTT）比色实验的结果显示，扁蒴藤素对 HNE2细
胞活力具有一定的抑制功能，但是这种功能需靠剂量造成，存
在依赖性，给药 24 h后，其 IC50为 2.84 μmol·L-1(图 1)。
2.2 扁蒴藤素诱导 HNE2细胞凋亡
采用流式细胞仪进行了 Annexin V/PI双染色。结果显示用
扁蒴藤素处理 24 h后，Annexin V/PI染色双阳性细胞的比例随
药物剂量的提高而明显上升。说明扁蒴藤素能够诱导 HNE2细
胞凋亡。(图 2A)。
2.3 扁蒴藤素对 Caspase与 PARP的影响
免疫印记实验结果表明，用浓度分别为 0、1、3、6 μmol·L-1
的扁蒴藤素处理 HNE2细胞 24 h后，出现被切割的 PARP条
带和 Caspase 9与 Caspase 3的条带，表明扁蒴藤素通过 Cas-
pase介导的通路诱导细胞凋亡 (图 2B)。
2.4 扁蒴藤素对酪氨酸激酶表达的影响
免疫印记实验结果显示，用浓度为 0、1、3、6 μmol·L-1的扁
蒴藤素处理 HNE2细胞 24 h后，表皮生长因子受体（EGFR），
肝细胞生长因子受体（C-MET），血管内皮细胞生长因子受体
（VGFR）的蛋白含量随给药剂量递增而出现不同程度的下降
(图 3A)。
2.5 扁蒴藤素对 AKT表达及其磷酸化水平的影响
免疫印记实验结果显示，用浓度为 0、1、3、6 μmol·L-1的扁
蒴藤素处理 24 h后，AKT的总蛋白含量变化不大，其磷酸化水
平则随着给药剂量递增而明显下降 (图 3B)。
2.6 扁蒴藤素对 Bcl-2家族蛋白表达的影响
免疫印记实验结果显示，浓度为 0、1、3、6 μmol·L-1扁蒴藤
素处理 24 h后，HNE2细胞中 Bcl-xL的蛋白表达降低，Bim蛋
白的含量显著增加(图 4)，Bcl-2和 Bax的含量变化不明显。
图 1 不同剂量扁蒴藤素对人鼻咽癌 HNE2细胞生长抑制作用
Fig. 1 The inhibitory effects of different doses of pristimerin of growth of
human nasopharyngeal carcinoma HNE2 cell
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图 3 不同剂量扁蒴藤素对 cleaved Caspase 9、Caspase 3和 PARP蛋白
表达的影响
Fig.3 Effect of different dosages of pristimerin on the protein level of
cleaved Caspase 9, Caspase 3 and PARP
图 4 不同剂量扁蒴藤素对酪氨酸激酶 EGFR、C-MET、VEGFR蛋白表
达的影响
Fig.4 Effect of different dosages of pristimerin on the expression levels of
EGFR, C-MET and VEGFR
图 5 不同剂量扁蒴藤素对 AKT总蛋白表达及其磷酸化水平的影响
Fig.5 Effect of different dosages of pristimerin on the expression level and
phosphorylation state of AKT
2.7 扁蒴藤素对热休克蛋白表达的影响
免疫印记实验结果显示，浓度为 0、1、3、6 μmol·L-1扁蒴藤
素处理 24 h后，HSP90的蛋白含量未见明显变化，HSP70的蛋
白表达则随用药剂量递增而明显增强（图 5A）。
2.8 抑制 HSP70表达可增强扁蒴藤素抗肿瘤活性
免疫印记实验结果显示，用浓度为 5 μmol·L-1的 HSP70
表达抑制剂 KNK437与 3 μmol·L-1扁蒴藤素共同处理细胞 24
h后，扁蒴藤素导致的 HSP70上调被阻断，而 cleaved Caspase 9
片段含量则比单用扁蒴藤素时明显增加（图 5B）。MTT实验也
表明, 5 μmol·L-1的 KNK437与 3 μmol·L-1扁蒴藤素共同处理
细胞 24 h可获得比 3 μmol·L-1扁蒴藤素单独给药更高的细胞
生存抑制率（图 5C）。
3 讨论
鼻咽癌是我国华南地区（广东，广西，香港，福建等地）最常
见的恶性肿瘤之一，早期病变通过根治性放疗可达到很高的控
制率，多数病人发现时已进入中晚期，需要采用药物治疗，但最
终仍有很大一部分患者死于远处转移和局部复发[5-7]。因此，迫
图 2 不同剂量扁蒴藤素诱导人鼻咽癌 HNE2细胞凋亡的作用
Fig. 2 Effect of different dosages of pristimerin in induces apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma HNE2 cells
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图 6 不同剂量扁蒴藤素对 Bcl-xL、Bim、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
Fig.6 Effect of different dosages of pristimerin on the expression level of
Bcl-xL, Bim, Bax and Bcl-2
图 7 不同剂量扁蒴藤素对 HSP90、HSP70蛋白表达的影响
Fig.7 Effect of different dosages of pristimerin on the expression level of
HSP90 and HSP70
图 8 5 μmol·L-1的 KNK437，3 μmol·L-1的扁蒴藤素分别单独给药以
及二者联合给药对 HSP70和 cleaved Caspase 9蛋白表达的影响
Fig.8 Effect of 5 μmol·L-1 KNK437, 3 μmol·L-1 pristimerin and their
combination on the expression of HSP70 and cleaved Caspase 9
图 9 5 μmol·L-1的 KNK437，3 μmol·L-1的扁蒴藤素分别单独给药以
及二者联合给药对 HNE2细胞生长的抑制作用
Fig.9 Inhibitory effect of 5 μmol·L-1 KNK437, 3 μmol·L-1 pristimerin and
their combination on the growth of HNE2 cells
切需要寻找和开发新型抗鼻咽癌药物。研究表明，从卫矛科植
物南蛇藤 (Celastrus orbiculatus Thunb)中提取的扁蒴藤素具有
广泛的药理活性，如抗微生物、抗氧化、抗疟疾等，其抗肿瘤活
性尤其受到关注，近年来已证实其可通过抑制蛋白酶体和热休
克蛋白 90的活性而发挥抗肿瘤作用，目前主要用于抗肿瘤的
研究[8-10]。
本实验首次釆用人鼻咽癌 HNE2细胞系对扁蒴藤素进行
研究，根据预实验的结果选取合适的浓度梯度，从而进行 MTT
实验，作用 24小时发现扁蒴藤素对肿瘤细胞增殖的抑制作用
具有剂量依赖性，可以在较低浓度下抑制肿瘤细胞生长，进一
步的实验表明扁蒴藤素在这一浓度范围内显著诱导细胞凋亡。
受体酪氨酸激酶（RTK）是最大的一类酶联受体，包括表皮生长
因子受体 EGFR、血管内皮细胞生长因子受体 VEGFR、肝细胞
生长因子受体 C-MET等众多成员，对许多肿瘤的发生和发展
起到关键作用。RTK活化以后可引起下游多个信号通路被激
活，AKT是其中有代表性的一个重要的信号分子，AKT被磷
酸化激活后可直接或间接的影响多个下游蛋白，从而促进细胞
增殖并抗拒凋亡。目前已在鼻咽癌中发现多种受体酪氨酸激酶
和 AKT都存在过度表达和过度活化的现象，以受体酪氨酸激
酶 EGFR为靶点的治疗性抗体已在多个国家上市，应用于鼻咽
癌的治疗[11-13]。本实验研究证明，扁蒴藤素可显著下调 EGFR,
VEGFR，C-MET的表达，并降低 AKT的磷酸化水平，这可能是
其抑制 HNE2细胞生长的机制之一。
细胞凋亡存在多种途径，最常见的是由半胱天冬蛋白酶(
Caspase )介导的凋亡通路，半胱天冬蛋白酶包含多种成员，在
凋亡过程中发挥传感器和效应分子的作用[14]。Caspase 3是典型
的效应型 caspase，当发生内源性或外源性细胞凋亡时，Caspase
3被上游的 Caspase 9切割活化，可一系列底物蛋白质进行催
化切割，使细胞出现程序性死亡[15,16]。PARP是其最典型的底物。
本实验应用免疫印记法检测 Caspase通路的活化程度，发现扁
蒴藤素导致细胞中 Caspase 3，Caspase 9和 PARP的蛋白切割
片段含量显著上升，这种变化存在剂量依赖性，这说明扁蒴藤素
促使鼻咽癌 HNE2细胞凋亡的机制与 Caspase信号通路有关。
Bcl-2家族蛋白是与凋亡途径密切相关的一大类蛋白质，
包括 Bcl-xL与 Bcl-2等多种促生存因子和 Bax，Bim等促凋亡
因子，Bcl-2家族中这些作用相反的成员互相制约，共同调控线
粒体外膜的通透性，共同决定了细胞是否发生凋亡 [17-19]。扁蒴
藤素处理后，导致 Bcl-2家族中的促凋亡成员 Bim表达升高，
抗凋亡成员 Bcl-xL的表达降低，对促凋亡成员 Bax和抗凋亡
成员 Bcl-2的表达影响不大，说明扁蒴藤素可能通过上调 Bim，下
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调Bcl-xL，增强线粒体外膜通透性，引发线粒体通路凋亡过程。
最近的研究表明，扁蒴藤素具有热休克蛋白 90（HSP90）抑
制剂的活性[7]。HSP90是细胞内的一种分子伴侣，包括受体酪氨
酸激酶和 AKT在内的多种原癌蛋白都依赖于 HSP90的保护
来维持其构象的稳定，以发挥其促进肿瘤增殖的活性。因此，
HSP90抑制剂已成为抗肿瘤药物研发中备受关注的一个领域。
但 HSP90抑制剂往往会促使细胞发生热休克反应，导致另一
个分子伴侣热休克蛋白 70（HSP70）的表达显著升高，而 HSP70
又具有强烈的抗凋亡和促增值作用，这很可能是限制 HSP90
抑制剂疗效的一个重要原因[20]。本实验研究表明，扁蒴藤素也
会导致 HNE2细胞中的 HSP70表达上升，而在扁蒴藤素给药
的同时加入 HSP70表达抑制剂 KNK437，则可以逆转扁蒴藤
素对 HSP70表达的促进作用，并达到更强的抑制细胞生长和
促进凋亡的效果。我们由此推测，在使用 HSP90抑制剂的同时
抑制 HSP70 的表达有望成为提高抗癌药物疗效的一个新途
径。
总之，本实验采用人鼻咽癌 HNE2细胞系进行研究，发现
扁蒴藤素可以通过下调受体酪氨酸激酶，抑制 AKT的磷酸化，
调控 Bcl-2家族蛋白的表达，激活 Caspase介导的凋亡通路抑
制人鼻咽癌 HNE2细胞增殖，抑制热休克蛋白 70的表达则可
以增强扁蒴藤素的抗鼻咽癌活性。我们将在以后的研究中进一
步探讨鼻咽癌的致病机制及扁蒴藤素的抗肿瘤作用原理。
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