全 文 ：JTCVM
年第 5 期2010
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Effect of E.ulmolides leaves on the development of immuneorgans in hybrid broilers
LV Jin-fang, NIU Xiao-long, NING Kang-jian, FENG Bao-ming, YING Ru-hai, WANG Ming-gen
(Anhui Science and Technology University, Fengyang Anhui 233100, China)
Abstract: 272 one -day -old hybrid broilers were randomly divided intoⅠ -Ⅳ groups which were administered with E.
ulmolides leaves at the concentration of 0 (control),5.0 (low dose),10.0 (moderate dose) and 15.0 g/L (high dose), respectively, in
drinking water for six weeks. Eight hybrid broilers were weighed and slaughtered in all groups at each weekend to observe the
effect of E.ulmoides leaves with different doses on the development of immune organs in hybrid broilers. The results showed that
the thymus weight and thymus index in all groups had no differences (P > 0.05) from first to fifth week, but the high dose group
was decreased significantly (P< 0.05) at the sixth week. At the third week, spleen weight and spleen index of different dose
groups were all higher than that of the control group, while they were all decreased in the test groups from fifth to sixth
week. At the third week, bursa of fabriocius index of different dose groups were all higher than that of the control group, but
had no significant difference between 3 treated groups at six -week -old. Conclusion: E.ulmoides leaves could improve the
indexes of both spleen and bursa of fabriocius in hybrid broilers during early growing stage, and has no obvious effect on the
thymus development.
Key Words: E.ulmoides leaves; hybrid broilers; immune organs
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地锦草总黄酮对小鼠免疫功能及细胞因子mRNA表达影响
徐 波 1，3，张建超 2，3，付作明 2，聂厚湘 2，孙志良3
（1．湖南农业大学外国语学院，湖南长沙 410128；2.浏阳市畜牧水产局；3.湖南农业大学动物医学院）
摘 要： 探讨地锦草总黄酮对小鼠免疫功能及细胞因子 IL- 2、IL- 12、IFN- γ、TNF- α mRNA表达影响。将小
鼠随机分成 4组：地锦草总黄酮高剂量组（H 组）、中剂量组（M组）、低剂量组（L组）和纯水对照组（C 组），连续灌胃 9 d
后，检测其单核巨噬细胞吞噬功能、2％绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应、肝脏指数和脾脏指数，并用逆转录酶 -
聚合酶链式反应的方法检测脾脏 IL- 2、IL- 12、IFN- γ和 TNF- α mRNA表达水平。结果显示，地锦草总黄酮 3个剂量
组脾脏指数、廓清指数（K）、吞噬指数（α）、24 h足跖增厚值均显著高于 C 组；M组和 H 组肝指数显著高于 C 组（P<0.
01）；3个剂量组均能提高 IL- 2、IL- 12、IFN- γ和 TNF- α mRNA的表达水平，与 C 组相比，H 组最显著。试验结果表
明，地锦草总黄酮能有效提高机体的免疫功能及 IL- 2、IL- 12、IFN- γ和 TNF- α mRNA表达。
关键词： 地锦草；总黄酮；细胞因子；反转录 - PCR
中图分类号：S853.74 文献标识码：A 文章编号：1000- 6354（2010）05- 0022- 05
收稿日期：2010- 05- 26
基金项目：湖南省科学技术厅项目（06FJ3107）
作者简介：徐 波（1981-），男，硕士研究生，主要从事分子与细胞生物学研究。
通讯作者：孙志良，sunzhiliang1965@yahoo.com.cn
地锦草为大戟科植物地锦 （Euphorbiae humifusae Willd）或班地锦（Euphorbiae macilate L.）的干燥全草 [1]，有
草血竭、血见愁草、扑地草奶汁等之称 [2]。具有清热解毒、
利湿退黄、抗菌抗氧化等功效，临床上主要用于治疗菌痢、
肠炎、肝炎等疾病[3]。地锦草化学成分的研究表明，其主要
含有槲皮素甙、山柰素甙等黄酮类化合物 [4]。现代药理研究
证明地锦草具有抗菌、抗病毒、抗氧化、护肝、止血等生物
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DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2010.05.010
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活性 [5]；其黄酮类化合物具有抗氧化抗衰老 [6]、抗菌抗病
毒、免疫调节、抗心血管疾病等生物活性。近年来，虽然对
地锦草的研究已有了初步进展，但对于地锦草有效成分的
提取、地锦草黄酮的分离和纯化、地锦草黄酮的药理作用
及作用机理等，研究还不够深入。笔者等提取了地锦草黄
酮，对其进行了免疫药理学研究，并从分子水平探讨地锦
草黄酮对机体产生细胞因子的影响，对阐明地锦草药理作
用以及进一步开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 PCR 仪（德国 ABI公司），高速冷冻离心机
（德国 eppendorf 5417R），紫外分光光度计（UV- 9100 北京
瑞利），凝胶成像系统（GIS- 2020 天能科技上海有限公
司），微型凝胶电泳槽（DYY- 31A北京六一公司）。
1.1.2 药物和试剂 2.762%的地锦草总黄酮（湖南农业
大学动物医学院药理学课题组提取）；绵羊红细胞（购自湖
南省解放军一六三医院）；刀豆蛋白 A（ConA，Sigma）；脂多
糖 （LPS）；Trizol （Fermentas 公司）；IL- 2、IL- 12、IFN-γ、
TNF-α 和 β- actin 特异性引物（Invitrogen 合成）；焦碳酸
二乙脂（DEPC）。
1.1.3 实验动物 昆明系小鼠 100 只，体重（20±2）g，均
购于湖南中医学院动物实验中心（批准号：医动字第
20- 002 号）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及给药方法 昆明系小鼠 100 只，雌雄
各半，18- 22 g，将其随机分为 4 组：高剂量组（H 组）、中
剂量组（M组）、低剂量组（L组）、对照组（C组），每组 25
只。H 组、M组、L组分别灌胃地锦草总黄酮 300、200 和
100 mg/kg，对照组灌胃纯水 0.5 mL，1 次 /d，连续 9 d。实
验期间动物自由采食、饮水。
1.2.2 小鼠脏器 / 体重比值 末次给药 24 h 后，称重，各
组均取小鼠 6 只，颈椎脱臼处死，分别称取、肝脏、脾脏与
小鼠体重的比值为肝脏指数和脾脏指数 [7]。计算公式：肝
脏(脾脏)指数 =肝脏(脾脏)重量 /小鼠体重。
1.2.3 小鼠炭粒廓清实验 末次给药 24 h 后，各组均取
小鼠 8 只，每只尾静脉注入稀释印度墨汁（每 10 g 体重
用量为 0.1 mL），于 2（t2）和 10 min（t10）后眼眶静脉采血
20 μL，立即吹入 2 mL 0.1% Na2CO3 溶液中摇匀，置分光
光度计 600 nm处比色，测定 A值（分别用 A2 和 A10 来表
示 2 和 10 min 所取血样的 A 值）。最后将小鼠脱颈处
死，分别取脾脏及胸腺称重，κ 值经体重及肝脾重换算后
得 α 值。按下式计算：
廓清指数（κ）= lgOD2 - lgOD10T10 - T22
吞噬指数（α） 体重
脾重×肝重×
3 K
1.2.4 小鼠迟发型变态反应的影响 末次给药 24 h 后，
各组均取小鼠 8 只，每只小鼠用 2％绵羊红细胞腹腔注射
0.2 mL致敏 4 d，后用游标卡尺测定左后足跖部厚度，于
该处皮下注射 20％绵羊红细胞 20 μL，注射后 24 h再用游
标卡尺测定左后足跖部厚度，取 3次平均值，以攻击前后足
跖厚度的差值（增厚值）来表示迟发性变态反应的程度。
1.2.5 脾脏总 RNA的提取及逆转录 PCR 反应
1.2.5.1 脾脏总 RNA的提取 各组均于第 9 天取小鼠 3
只，腹腔注射 ConA 250 μg和 LPS 50 μg以诱导小鼠细胞因
子的表达。12 h后将所有小鼠断头处死，无菌条件下分离脾
脏。采用 Trizol法提取与纯化脾脏 RNA。用 50- 100 μL DEPC
水溶解，- 20℃保存备用。用分光光度计测定 RNA的浓度，
并用含甲醛琼脂糖凝胶电泳检查 RNA完整性[8]。
1.2.5.2 逆转录 - PCR 反应 采用 RevertAidTM First Strand
cDNA合成试剂盒，按试剂盒说明操作。cDNA第一链的合
成使用反转录酶，以脾脏总 RNA为模板，oligo（dT）18 为逆
转录引物，反转录体系为：总 RNA 0.1- 0.5 μg、反应缓冲液
（5×）5 μL、dNTPs 2 μL、RiboLockTM RNA酶抑制剂 1 μL、
Oligo （dt）1 μL、Revertaid m- mulv transcriptase 1 μL，用
DEPC处理过的水补足体积至 20 μL，反转录条件为 72 ℃
水浴 10 min，冰浴 2 min 终止反应后，置 - 20 ℃冰箱备用。
1.2.5.3 目的基因 PCR 扩增 通过试验确定最佳反应体
系：PCR 缓冲液（10×）5.0 μL、MgCl2（25 mM）3.0 μL、dNTP
混合物（10 mM）1 μL、Taq 聚合酶（1 u/μL）1 μL 、cDNA 模
板 2.0 μL、以及上下游引物各 1 μL（终浓度 0.2 μmol/L）加
DEPC- water至 25 μL；扩增条件：94 ℃ 4 min 变性，94 ℃
30 s，57 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，循环 30 次，72 ℃ 7 min 延伸，
4 ℃保存。扩增引物见表 1。
表 1 RT-PCR 引物序列
作为内参 β- actin 反应条件同目的基因。以上反应体
系和反应程序为基本反应条件，需根据具体情况进行预备
试验优化反应条件，并且每项 PCR 设置空白对照。如果
PCR 反应特异性不强，则用 PCR 热启动方法并在反应体
系中加 Clontech 公司生产的 Taq 酶抗体来增强反应的特
异性。
1.2.5.4 PCR 产物的琼脂糖电泳 为了比较各组间 IL- 2、
IL- 12、IFN- γ、TNF- α mRNA的表达，用同一样品 β- actin
的扩增产物作内参照。取 PCR 产物 15 μL，加凝胶载样缓
IL- 2 5TGA TGGACC TACAGGAGCTCC TGAG3 167
5GAG TCAAATCCAGAACATGCCGCAG3
IL- 12 5AACCTCACC TGTGACACGCC3 309
5CAAGTCCATGTTTCTTTGCACC3
IFN-γ 5AAC TCAAGTGGCATAGATGT3 251
5AAC TCAAACTTGGCAATAC3
TNF-α 5CGAGTGACAAGCCTG TAGC3 396
5TAC TTGGGCAGATTGACC TCA3
β- actin 5CAC TGTGCCCATCTACGAG- 3 200
5CCA TCTCCTGCTCGAAGTC- 3
基 因 引物序列 PCR产物(bp)
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冲液 3 μL，充分混匀，加入点样孔，1%琼脂糖凝胶电泳
（EB浓度为 0.6 μg/μL），电泳电压为 70 V，电泳时间约为
40 min。电泳完毕后，在凝胶成像系统下成像，观察电泳结
果并拍照。并用 UVP Labworks Analysis Software 图象分析
软件进行表达强度分析，以 β- actin 表达量为对照，计算并
比较各因子相对表达量。
1.2.5.5 统计学处理 所有数据均以平均值±标准差表
示，应用 SPSS 13.0 软件进行方差分析，P<0.05 为差异显
著，P<0.01 为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 地锦草总黄酮对小鼠脏器指数的影响
地锦草总黄酮对小鼠脏器指数的影响见表 2。由表 2
可知，与对照组相比，各个剂量组脾脏指数有所提高，但差
异不显著（P>0.05）；而中、高剂量组的肝脏指数与对照组
相比差异极显著（P<0.01）。
2.2 地锦草总黄酮对小鼠炭粒廓清的影响
结果见表 2。由表 2 可知，与对照组相比，各剂量组的
廓清指数（κ）与吞噬指数（α）均有所提高，且高剂量组差
异极显著（P<0.01）。
表 2 地锦草总黄酮对小鼠免疫功能的影响
注：与对照组比较，a表示 P<0.05；aa表示 P<0.01。
2.3 地锦草总黄酮对小鼠迟发型变态反应的影响
结果见表 2。由表 2 可知，与对照组相比，各剂量组
足跖增厚值均有所增加，且中、高剂量组差异极显著
（P<0.01）。
2.4 脾脏细胞因子 mRNA的表达
2.4.1 RNA浓度测定 利用紫外分光光度计对 RNA 的
浓度进行了检测，其 RNA A260/A280在 1.8- 2.0 之间。从图 1
电泳检测结果可知，未降解的 RNA 样品可见到 3 条明显
的 28 S、18 S 和 5 S rRNA 区带，表明所提取的白细胞总
RNA结构完整，没有被 RNA酶降解，且 RNA纯度较高。
2.4.2 脾脏细胞因子 mRNA表达 见图 2- 5、表 3。由图 2
可知，H 组和 M组 IL- 2 mRNA表达水平均升高，与 C组
相比，H 组和 M组有极显著差异（P<0.01）；由图 3 可知，
各剂量地锦草总黄酮对 IFN-γ mRNA 表达水平均有提
高，特别是 H 剂量组（P<0.01）；由图 4 可知，与对照组相
比，各剂量地锦草总黄酮对 IL- 12 mRNA表达水平稍有提
高，但差异不显著（P>0.05）；由图 5 可知，与对照组相比，
各剂量地锦草总黄酮对 TNF- αmRNA表达水平均有升高，
且差异显著（P<0.01）。
图 1 小鼠脾脏细胞因子 mRNA 的鉴定
图 2 地锦草总黄酮对小鼠脾脏中 β- actin与 IL- 2表达影响
注：M：DNA标准 100 bp Ladder；I：高剂量组；Ⅱ：中剂量组；Ⅲ：低剂
量组；Ⅳ：对照组。
图 3 地锦草总黄酮对小鼠脾脏中 β- actin与 IFN-γ表达影响
注：M：DNA标准 100 bp Ladder；I：高剂量组；Ⅱ：中剂量组；Ⅲ：低剂
量组；Ⅳ：对照组。
图 4 地锦草总黄酮对小鼠脾脏中 β- actin与 IL- 12表达影响
注：M：DNA标准 100 bp Ladder；I：高剂量组；Ⅱ：中剂量组；Ⅲ：低剂
量组；Ⅳ：对照组。
图 5 地锦草总黄酮对小鼠脾脏中 β- actin与 TNF- α表达影响
注：M：DNA标准 100 bp Ladder；I：高剂量组；Ⅱ：中剂量组；Ⅲ：低剂
量组；Ⅳ：对照组。
组别 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组
脾指数 0.010 3±0.270 2 0.015 52±0.283 7 0.016 94±0.172 1 0.017 80±0.762 3
肝指数 0.057 3±0.002 5 0.056 4±0.003 5 0.062 4±0.000 6aa 0.063 8±0.0043aa
廓清指数（κ） 2.312 3±0.114 3 2.350 7±0.029 6 2.368 2±0.031 4 2.556 7±0.0339aa
吞噬指数（α） 1.712 3±0.283 4 1.913 4±0.031 3 2.940 6±0.314 0 4.318 0±0.942 2aa
24h足跖增厚值 0.062 3±0.012 1 0.074 5±0.013 8 0.128 0±0.032 6aa 0.134 5±0.0345aa
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表 3 地锦草总黄酮对小鼠脾脏细胞因子 mRNA 表达定量
检测结果（n=3）
注：与对照组比较，aP<0.05；aaP<0.01。
3 讨论
脾脏是机体最大的外周免疫器官，参与全身的细胞免
疫和体液免疫，是各类免疫细胞居住的场所，在机体防御
方面起重要作用。肝脏是以代谢功能为主的器官，并具有
去氧化、解毒、储存肝糖原、合成蛋白质等功能。免疫器官
指数是反映机体发育情况与免疫功能动态的一个重要指
标，常以脾脏指数、肝脏指数作为免疫功能研究的指标。本
实验结果显示，地锦草总黄酮 3 个剂量组小鼠脾脏、肝脏
指数均有所提高，表明地锦草总黄酮能提高免疫器官功
能，增加肝脏的解毒功能，从而提高机体抵抗力。
迟发型超敏反应是由特异性致敏效应 T细胞介导的
细胞免疫反应，其中的 T细胞在移植排斥、自身免疫和肿
瘤免疫等方面起关键作用，是检测细胞免疫功能的常用方
法之一。本实验应用绵羊红细胞腹腔注射致敏小鼠，测定
足跖部厚度来表示迟发性变态反应的程度。实验结果显
示，中、高剂量组跖增厚值均显著提高。说明地锦草总黄酮
能增强 T细胞介导的细胞免疫反应能力。
单核 - 巨噬细胞系统具有强大的吞噬功能，能迅速吞
噬、廓清进入机体的异体颗粒（病毒、异物等）和机体自身
产生的抗原性物质，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫
功能的标志之一[9]。由于单核巨噬细胞系统的激活包括巨
噬细胞增值及功能活跃两个方面，因此用廓清指数（κ）和
吞噬指数（α）相结合分别反映巨噬细胞的增值状态及吞
噬能力。实验表明，地锦草总黄酮 3 个剂量组的 κ 值和 α
值均高于纯水对照组，说明地锦草总黄酮能提高小鼠单核
巨噬细胞系统的吞噬能力，从而增强机体非特异性免疫，
提高机体的抗病能力。
细胞因子主要是由免疫细胞分泌的能调节细胞功能，
参与炎症反应、免疫反应、创伤愈合等过程的蛋白质和小
分子多肽[10]。细胞因子具有局效性的特点，主要在分泌局
部发挥自分泌和旁分泌效应。脾脏聚集了大量的免疫细
胞，势必有众多细胞因子的分泌并发挥免疫作用。IL- 2、
IL- 12、IFN- γ、TNF- α4 个细胞因子是脾脏组织典型的免疫
细胞因子。IL- 2 是 T细胞的自分泌或旁分泌因子，其生理
功能主要是促进 T淋巴细胞的增殖与分化，在机体免疫应
答中起关键性作用 [11]；IL- 12 主要作用于 CTL和 NK细胞，
是迄今为止最有效的 CTL 和 NK 细胞活性刺激因子；
IFN- γ 具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖及免疫调节等生物
活性，是目前临床上抗病毒治疗的主要药物 [12]；TNF-α 的
典型生物活性包括抗感染和抗肿瘤。本试验结果表明，地
锦草总黄酮能在转录水平剂量依赖性促进此 4 种细胞因
子 mRNA表达，从而说明其免疫增强和抗菌、抗病毒作用
是与其在转录水平增强 4 种细胞因子 mRNA表达分不开
的。3 个不同剂量组的细胞因子表达水平不同，表明地锦
草总黄酮促进细胞因子 mRNA表达与给药剂量有关，与地
锦草总黄酮的非特异性免疫调节功能相吻合。总之，本实
验表明地锦草总黄酮能有效提高机体的免疫功能，对防治
病原性疾病具有重要意义。
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高剂量组 300 4.962±0.142aa 1.126±0.087 2.378±0.112aa 3.797±0.147aa
中剂量组 200 4.054±0.123aa 1.238±0.104 1.146±0.098aa 3.465±0.139a
低剂量组 100 3.674±0.043 0.864±0.056 0.947±0.057aa 2.890±0.102a
对照组 0 3.579±0.015 0.276±0.026 0.473±0.019 0.348±0.064
组别
剂量
/mg·kg-1
IL- 2
/β- actin
IFN-γ
/β- actin
TNF-α
/β- actin
IL- 12
/β- actin
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Effects of Euphorbiae humifusae total flavonoids on immunity and mRNA
expression of some cytokines in mice
XUBo
（College of Foreign Language，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128，China）
Abstract: Objective: To investigate the effect of Euphorbiae humifusa total flavonoids on immunity and mRNA expression of
some cytokines，such as IL-2，IL-12，IFN-γ and TNF-α in mice. Methods: Kunming mice were divided into 4 groups randomly:
the mice in control group were treated with water（c），other 3 groups were treated with high（H），moderate（M）and low（L）dose
of Euphorbiae humifusa total flavonoids for 9 d，respectively. Then phagocytosis of mononuclear macrophage，DTH induced by
sheep red blood cell，liver index and spleen index were determined. The mRNA expression level of IL-2，IL-12，IFN-γ and
TNF-α were examined by RT-PCR on 9 th. Results: The levels of carbon particle clearance index，phagocytic index，DTH
induced by sheep red blood cell and spleen index in three treated groups were significantly higher than that of control group，the
leves of liver index in M and H groups were significantly higher than that of control group（P<0.01）. The mRNA expression levels
of IL-2，IL-12，IFN-γ and TNF-α in three treated groups were increased，and the level in H group was the highest. Conclusion:
The results showed that Euphorbiae humifusa total flavonoids could enhance immunity and mRNA expression of IL-2，IL-12，
IFN-γ and TNF-α in mice.
Key words: Euphorbiae humifusae；total flavonoids；cytokine；RT-PCR
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