全 文 ：［收稿日期］ 20121117(006)
［基金项目］ 云南省科技厅应用基础研究项目(2009ZC121m)
［通讯作者］ * 林春榕，硕士，副教授，从事生化药理学研究，
Tel:0872-2257150，E-mail:dalijcyxy@ 163. com
高河菜根茎多糖的提取工艺优选及抗氧化作用考察
林春榕* ，张翠香，董莎莎，左绍远
( 大理学院基础医学院，云南 大理 671000)
［摘要］ 目的:优选高河菜根茎多糖的提取工艺条件并考察其抗氧化作用。方法:采用水提醇沉法从高河菜根茎中提取
多糖，以多糖提取率为指标，通过正交试验优选多糖的提取工艺条件，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，并考察高河菜根茎多糖
对清除羟基自由基(·OH)与超氧阴离子自由基(O －2·)的作用。结果:高河菜根茎多糖的最佳提取工艺为提取温度 80 ℃，提
取时间 12 h，料液比 1∶ 15;多糖平均得率 1. 973%(ＲSD 1. 87%) ，高河菜根茎多糖与葡萄糖的换算因子为 1. 127 (n = 5) ，高河
菜根茎粗多糖中多糖质量分数 80. 17%(ＲSD 2. 13%)。体外抗氧化试验表明，高河菜根茎多糖对·OH 和 O －2·有一定清除作
用，且呈剂量效应关系。结论:优选的提取工艺稳定可行，提取效率高;高河菜根茎多糖具有一定的体外抗氧化作用。
［关键词］ 高河菜根茎多糖;提取工艺;正交实验;含量测定;抗氧化
［中图分类号］ Ｒ283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)10-0046-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013100046
Optimization of Extraction Technology and Investigation of Anti-oxidant
Effects of Polysaccharides from Stems of Megacarpaea delavayi
LIN Chun-rong* ，ZHANG Cui-xiang，DONG Sha-sha，ZUO Shao-yuan
(College of Basic Medicine，Dali University，Dali 671000，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extracting conditions of polysaccharides from stems of Megacarpaea
delavayi，and investigate its anti-oxidation effects． Method:Polysaccharide in stems of M． delavayi was isolated
by water extracting-alcohol precipitating method， taking extraction rate of polysaccharides as index， optimal
extracting conditions were studied by orthogonal test． The content of polysaccharides was determined． by phenol-
sulfuric acid method，moreover， in vitro activities on scavenging free radicals of·OH and O －2 · of the
polysaccharide were also observed． Ｒesult:Optimal extraction conditions of polysaccharides were as followings:
extracted 12 h with 15 times the amount of water at 80 ℃;under these conditions， the average yield of
polysaccharides was 1. 973% (ＲSD 1. 87%) ，the conversion factor between glucose and the polysaccharides was
1. 127 (n = 5) ，the content of polysaccharides was 80. 17% (ＲSD 2. 13%) in the crude polysaccharides． In
addition，the polysaccharides had a certain effect on scavenging free radicals of·OH and O －2·in vitro and exhibited
the dose-effect relation． Conclusion:This optimized technology was stable and feasible with high extraction rate;
Polysaccharides in stems of M． delavayi possessed a certain anti-oxidant effect．
［Key words］ polysaccharides from stems of Megacarpaea delavayi;extraction technology;orthogonal test;
content determination;anti-oxidant
高河菜为多年生草本植物。该属植物全世界约
7 种，我国有 3 种，主要分布于云南、西藏、四川、甘
肃等地，云南产 1 种，即高河菜，主要分布于滇西北
的大理、丽江、中甸等海拔 ＞ 3 800 m 的高山草甸地
区［1-3］。高河菜味辛，性凉，具有清热、健胃、消食之
功效，为大理白族传统药用野生植物，全草入药。民
间用其治疗肺热咳嗽、体虚、胃热积滞、痢疾和消化
不良等症［4］。目前对高河菜的生药学特征［5］、人工
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第 19 卷第 10 期
2013 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 10
May，2013
引种驯化［6］、组织培养繁殖［7］、治疗积滞化热证［8］
及其脂溶性成分分析［9］等方面的研究已有报道，但
有关其根茎多糖的研究尚未见报道。多糖是一类结
构复杂的生物大分子物质，具有增强机体免疫力、调
节血糖、降血脂及抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种活
性［10-14］，目前其已成为新药资源研究的热点之一。
因此，本实验对高河菜根茎多糖的提取工艺及其体
外抗氧化活性进行研究，为云南野生高河菜药用资
源的开发与利用提供实验依据。
1 材料
HH-W420 /600 型恒温水浴箱(金坛市瑞华仪器
有限公司) ，AG 135 型电子天平(瑞士梅特勒-托利
多公司) ，FD-1 型冷冻干燥机(北京博医康技术有限
公司) ，UV2550 型紫外-可见分光光度计(日本岛津
苏州仪器有限公司) ，TDL-5-A型低速台式大容量离
心机(上海安亭科学仪器厂)。
D-葡萄糖对照品(上海酶联生化试剂公司，批
号 1772-03-4) ，二乙基氨基乙基-葡聚糖 A-50 色谱
柱(DEAE-Sephadex A-50 色谱柱，Sigma公司) ，试剂
均为国产分析纯。高河菜采自云南大理苍山，经大
理学院左绍远教授鉴定为十字花科高河菜属植物高
河菜 Megacarpaea delavayi Franch的根茎。
2 方法与结果
2. 1 苯酚试剂的配制 称取苯酚 100 g，加铝粉和
NaHCO3 各 0. 1 g，蒸馏，收集 182 ℃馏分，精确称取
该馏份 6. 0 g，加双蒸水 100 mL，得 6. 0%苯酚试液，
置棕色瓶内，放 4 ℃冰箱保存，备用。
2. 2 标准曲线的绘制 精密称取于 105 ℃干燥至
恒重的葡萄糖对照品 100 mg，置 100 mL 量瓶中，用
水溶解并稀释至 100 mL，得葡萄糖对照品储备液。
吸取该储备液 10 mL 置 100 mL 量瓶中，用水定容，
精密吸取该溶液 0. 1，0. 2，0. 3，0. 4，0. 5，0. 6，0. 7，
0. 8 mL，分别置于具塞试管，各加水至 2. 0 mL，加
6. 0%苯酚试剂 1. 0 mL，迅速加浓 H2SO4 5. 0 mL，摇
匀，沸水加热 10 min，迅速流水冷却;另取水 2. 0
mL，同法操作，加入试剂作空白对照，于 490 nm 测
定吸光度(A) ，以 A为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横
坐标，得标准曲线 Y = 0. 009X + 0. 035(Ｒ2 = 0. 996) ，
表明葡萄糖质量浓度在 20 ～ 70 mg·L －1与 A呈良好
线性关系。
2. 3 粗多糖的制备 高河菜根茎洗净后自然晾干，
切碎，过 40 目筛后称取 1 kg，用石油醚回流 2 h，过
滤;滤渣自然晾干，用 95%乙醇回流 2 次，每次 2 h，
过滤;滤渣室温晾干后加 20 倍量水于 80 ℃水浴提
取 12 h，过滤，收集滤液。滤渣加 10 倍量水于 80 ℃
水浴提取 8 h，过滤;合并滤液，减压浓缩至适当体
积，加 95%乙醇至乙醇体积分数 75%，置 4 ℃冰箱
过夜，离心取沉淀。沉淀用 Sevage 法脱蛋白(三氯
甲烷-正丁醇 4∶ 1)至 280 nm无明显吸收峰，加 95%
乙醇至乙醇体积分数 75%，置 4 ℃冰箱过夜，离心
取沉淀。沉淀分别用蒸馏水、去离子水透析过夜，同
法醇沉，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤
3 次，冷冻干燥后溶于适当体积水中，上 DEAE-
SephadexA-50 色谱柱(2. 5 cm × 28 cm) ，用水洗脱，
硫酸-苯酚法跟踪检测，收集于 490 nm 处的吸收峰
部分，加 95%乙醇至乙醇体积分数 80%，置 4 ℃冰
箱过夜，离心取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙
醚洗涤 3 次，冷冻干燥至恒重，即得高河菜根茎粗多
糖，置玻璃干燥器中备用。
2. 4 换算因子的测定 精密称取高河菜根茎粗多
糖 10 mg置 100 mL量瓶中，加双蒸水溶解并稀释至
刻度，得粗多糖样品溶液(100 mg·L －1)。精密吸取
该样品溶液 5 份，每份 1. 0 mL，置于具塞试管中，加
水至 2. 0 mL，按 2. 2 项下自“加水至 2. 0 mL”起，同
法操作，测定 A，按 f = W /(C × D)计算换算因子
(f)。式中 W 为称取粗多糖的质量，C 为粗多糖溶
液中葡萄糖质量浓度，D 为多糖的稀释因素。结果
测得高河菜根茎多糖与葡萄糖的平均换算因
子 1. 127。
2. 5 稳定性试验 精密吸取 2. 4 项下制备的样品
溶液 1. 0 mL于具塞试管中，按 2. 2 项下方法于 4 h
内每隔 30 min测定 1 次 A，结果 ＲSD 1. 87%，表明
样品溶液与反应试剂在 4 h内显色稳定。
2. 6 精密度试验 精密吸取 2. 4 项下制备的样品
溶液 0. 50 mL 于具塞试管中，按 2. 2 项下方法于
490 nm连续测定 6 次 A，结果 ＲSD 1. 13%，表明仪
器精密度良好。
2. 7 重复性试验 精密吸取 2. 4 项下制备的样品
溶液 5 份，每份 1. 0 mL，分别置于具塞试管中，按
2. 2 项下方法操作，结果多糖含量的 ＲSD 2. 41%，表
明该方法重复性良好。
2. 8 加样回收率试验 精密吸取 2. 4 项下制备的
样品溶液 9 份，每份 0. 20 mL，各加入已知含量的葡
萄糖对照品溶液 0. 1，0. 15，0. 20，0. 25，0. 30，0. 35，
0. 40，0. 45，0. 50 mL，按 2. 2 项下方法测定 A，计算
葡萄糖加样回收率。结果平均加样回收率
100. 78%，ＲSD 1. 73%。
2. 9 样品测定 精密吸取高河菜根茎粗多糖样品
·74·
林春榕，等:高河菜根茎多糖的提取工艺优选及抗氧化作用考察
溶液 5 份，每份 1. 0 mL，分别置于具塞试管中，按
2. 2 项下方法测定 A，计算葡萄糖含量，并推算多糖
含量。结果多糖质量分数 80. 17%，ＲSD 2. 13%。
2. 10 提取工艺优选 选择提时间、提取温度，料液
比为考察因素，多糖提取率为评价指标，按 L9(3
4)
正交表进行试验，因素水平见表 1，试验安排及结果
见表 2，方差分析见表 3。
表 1 高河菜根茎多糖提取工艺正交试验因素水平
水平 A提取时间 /h B提取温度 / ℃ C料液比
1 8 60 1∶ 10
2 10 70 1∶ 15
3 12 80 1∶ 20
表 2 高河菜根茎多糖提取工艺正交试验安排
No． A B C D (空白)
多糖提取率
/%
1 1 1 1 1 1. 209
2 1 2 2 2 1. 551
3 1 3 3 3 1. 754
4 2 1 2 3 1. 379
5 2 2 3 1 1. 809
6 2 3 1 2 1. 883
7 3 1 3 2 1. 749
8 3 2 1 3 1. 975
9 3 3 2 1 1. 978
K1 1. 505 1. 446 1. 689 1. 665
K2 1. 690 1. 778 1. 636 1. 728
K3 1. 901 1. 872 1. 771 1. 703
Ｒ 0. 396 0. 426 0. 135 0. 062
表 3 多糖提取率方差分析
方差来源 SS f MS F P
A 0. 236 2 0. 118 39. 333 ＜ 0. 05
B 0. 301 2 0. 151 50. 167 ＜ 0. 05
C 0. 028 2 0. 014 4. 667 ＞ 0. 05
D(误差) 0. 010 2 0. 005
注:F0. 05(2，2)= 19. 00。
由直观分析可知，各因素对多糖提取率的影响
顺序为 B ＞ A ＞ C。方差分析表明，提取温度、提取
时间对提取率的影响有显著性差异，而料液比影响
则不显著。结合生产实际考虑，选择最佳提取条件
为 A3B3C2，即提取温度 80 ℃，浸提时间 12 h，料液
比 1∶ 15。为验证优选的提取条件，按此工艺进行 3
次平行试验，结果多糖提取率分别为 1. 968%，
1. 977%，1. 973%，表明优选的工艺稳定可行。
2. 11 高河菜根茎多糖对清除羟基自由基(·OH)
的作用［15］ 配制质量浓度分别为 0. 1，0. 2，0. 3，
0. 4，0. 5，0. 6 g·L －1的多糖样品溶液，各精密吸取
1. 0 mL，分别加入 9. 0 mmoL·L －1 FeSO4 和 9. 0
mmoL·L －1水杨酸-乙醇各 1. 0 mL，对照组以水 1. 0
mL代替多糖溶液。加 8. 8 mmoL·L －1H2O2 启动反
应，于 37 ℃水浴反应 0. 5 h，用水调零，于 510 nm测
定 A。为扣除多糖溶液本身可能产生的 A，以不加
H2O2 的多糖溶液作为本底管。以 Vc 作阳性对照
品，临用前用水配制成与多糖溶液相同的质量浓度，
同法操作，进行对照试验，计算清除率(图 1)。结果
表明高河菜根茎多糖对清除·OH 的作用有剂量依
赖性，在 0. 60 ～ 40. 0 g·L －1，表现出一定的剂量效应
关系。
清除率 =(A0 － Ax － Ax0)/A0 × 100%
式中 A0 为对照组吸光度，Ax 为多糖样品吸光
度，Ax0为本底管吸光度。
图 1 不同质量浓度高河菜根茎多糖和 Vc对·OH的清除率
2. 12 高河菜根茎多糖对清除超氧阴离子自由基
(O －2·)的作用 采用邻苯三酚自氧化法
［16-17］进行
测定，多糖样品配制同 2. 11 项。取 pH 8. 2 的 Tris-
HCl缓冲液 0. 50 mL，置于具塞试管中，加不同质量
浓度的多糖液 1. 0 mL，置 25 ℃水浴保温 20 min，加
入于 25 ℃预热的 5. 0 mmoL·L －1邻苯三酚溶液 0. 5
mL，混匀，置于 25 ℃水浴中 4 min，快速摇匀，于 325
nm处以 pH 8. 2 的 Tris-HCl 缓冲液调零，每隔 30 s
测定 1 次 A，连续测定 4 min，计算加入多糖样品后
的自氧化速率(ΔAx)。ΔAx =(最后 1 次 A测定值 －
第 1 次 A测定值)/4。空白对照组以 1. 0 mL水代替
多糖样品，同法操作，测定自氧化速率(ΔA0)。同法
以 Vc作为阳性对照试验，计算清除率(图 2)。结果
表明随多糖质量浓度的增加，对 O －2·的清除率逐渐
增加，且呈一定的剂量效应关系;于质量浓度 0. 60 g
·L －1时，清除率达最大值(41. 43%) ，为阳性对照品
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Vc相同质量浓度清除率的 0. 558 倍。
清除率 =(ΔA0 － ΔAx)/ΔA0 × 100%
图 2 不同质量浓度高河菜根茎多糖和 Vc对 O －2·的清除率
3 讨论
为提高试验结果的准确度与可靠性，本实验在
提取过程中，先用石油醚回流去除脂类，再用乙醇回
流，透析，DEAE-SephadexA-50 柱色谱纯化，以除去
单糖、低聚糖、生物碱、苷类及色素等干扰成分，从而
防止其影响多糖纯度及含量的测定。
体外抗氧化活性实验表明，高河菜根茎多糖具
有一定的清除·OH和 O －2·的作用，且随多糖质量浓
度的增加，清除能力逐渐增加，呈现出一定的剂量效
应关系。但在相同的质量浓度下，多糖对·OH 自由
基和 O －2·自由基的清除率 ＜ Vc，表明多糖在体外的
抗氧化能力弱于 Vc，但作为一种纯天然抗氧化物
质，多糖具有毒副作用小、来源广等特点，因而可长
期使用。体外抗氧化活性试验结果虽不一定能完全
代表体内清除自由基的作用，但对药物功效的初步
筛选仍具有重要参考价值。有关高河菜根茎多糖的
生物学活性、药理学作用及单糖组成、结构等尚待进
一步研究。
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［责任编辑 仝燕］
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