全 文 ：神秘果素（miraculin protein）是从一种原产于
西非的植物神秘果（Synsepalum dulcificum）中分离
出来的一种植物特异糖蛋白[1-4]。 神秘果素由 191 个
氨基酸组成， 分子量为 24.6 ku[5-6]。 1969年 Kurihara
和 Beidler[7]首次利用离子交换色谱分离得到神秘果
素， 并表明它是一种碱性糖蛋白。 随后 Masuda等[8]
从神秘果果实中克隆得到了神秘果素基因。 神秘果
素的单体在任何 pH下均无活性， 其二聚体和四聚体
在酸性 pH 下表现出使味觉改变的活性 [9]。 2010 年
Gahloth 等 [10]从月橘中克隆出了神秘果素相似蛋白
（miraculin-like protein， MLP）基因。 Kuwabara 等[11]
从粗皮柠檬（Citrus jambhiri）里克隆出了编码RlemMLP2
（miraculin-like protein 2）和RlemMLP3的基因， RlemMLP2
包含一个神秘果素的结构域。 但是， MLP2 并没有
使味觉改变的功能， 它可能对胰蛋白酶活性有抑制
作用并且在植物防御方面起一定的作用 [12]。 神秘果
素和神秘果素相似蛋白的序列与 Kunitz STI（Kunitz
型大豆胰蛋白酶抑制剂） 家族的序列都表现出了相
似性， 可以抑制蛋白质的水解， 根据 N 末端的氨
基酸序列可以推导出这两种蛋白属于 Kunitz 家族，
是一种主要的种子贮藏蛋白 [10]。 大部分的 Kunitz
STI 家族成员在酸碱度和温度有较大的变化时仍然
表现出较强的稳定性[13-17]。
金弹（Fortunella crassifolia）属于芸香科（Rutaceae）
常绿果树， 其试管苗可以在常规组培条件下长期无
继代离体保存。 2007 年韩牙琴[18]在对金弹和四季桔
试管苗长期无继代离体保存的研究中发现， 离体保
存过程中神秘果素相似蛋白大量累积， 因此该蛋白
对延缓金弹和四季桔试管苗衰老可能起到重要的作
用。 本研究克隆并分析了金弹试管苗的 MLP2基因，
热带作物学报 2013， 34（3）： 442-450
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2012-12-21 修回日期 2013-03-24
基金项目 福建省重大科技平台建设项目（No. 2008N2001）和国家支撑计划资助项目（No. 2007BAD07B01）。
作者简介 金建涛（1986年—）， 男， 硕士研究生； 研究方向： 果树生物技术。 *通讯作者： 赖钟雄， E-mail: laizx01@163.com。
金弹试管苗叶片MLP2基因的
克隆及其生物信息学分析
金建涛， 赖钟雄 *
福建农林大学园艺植物生物工程研究所， 福建福州 350002
摘 要 采用 RT-PCR 结合 RACE 技术， 以金弹（尤溪金柑Fortunella crassifolia cv. Youxijingan）试管苗的叶片为
材料， 克隆得到金弹 Fc-MLP2 基因的全长 cDNA 序列， 其在 GenBank 中的登录号为 JX310276。 Fc-MLP2 基因
全长 908 bp， 含有一个 669 bp 的开放阅读框， 编码 223 个氨基酸。 生物信息学分析表明： 该蛋白是定位于细胞
外的一种疏水性分泌蛋白， 具有 2 个功能位点、 13 个磷酸化位点和信号肽， 其二级结构由 α 螺旋、 β 折叠、 β
转角、 无规则卷曲组成。 系统进化树分析表明， 金弹 Fc-MLP2 与粗皮柠檬的 RlemMLP2 蛋白亲缘关系较近， 聚
为同一类。 该蛋白可能在植物抗虫、 抗病原菌、 抗饥饿和延缓植物衰老方面起到一定作用。
关键词 金弹； 试管苗； Fc-MLP2； 基因克隆； 生物信息学
中图分类号 Q344.14 文献标识码 A
Cloning and Bioinformatics Analysis of MLP2 Gene from the
Leaves of in vitro Plantlets of Fortunella crassifolia
JIN Jiantao, LAI Zhongxiong
Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
Abstract The Fc-MLP2 cDNA sequence was cloned from the leaves of Fortunella crassifolia cv. Youxijingan
using RT-PCR and RACE techniques. The accession number was JX310276 in GenBank. The cDNA sequence
consisted of 908 bp with an intact open reading frame of 669 bp, encoding a polypeptide of 223 amino acids.
Bioinformatics analysis showed that the protein was a hydrophobic secretory protein located in extracellular
position, with two functional sites, 13 phosphorylation sites and a signal peptide. The secondary structure was
made of alpha helixes, beta sheets, beta turns and coils. Phylogenetic analysis also indicated that the Fc-MLP2
was close to RlemMLP2 of Citrus jambhiri in genetic relationship.
Key words Fortunella crassifolia; In vitro plantlets; Fc-MLP2; Gene cloning; Bioinformatics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.03.011
第 3 期
为进一步研究 MLP2 在抵御外来侵害和柑桔离体保
存机理方面奠定了分子生物学基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以 6 个月苗龄的金弹品种尤溪金柑（Fortunella
crassifolia cv. Youxijingan）实生试管苗叶片为材料，
材料经液氮处理后保存到-40 ℃冰箱。 采用 Tripure
法提取植物叶片总 RNA， -80℃条件下保存备用。
1.2 方法
1.2.1 金弹 MLP2 基因保守区的克隆 比较 NCBI
上公布的其它柑橘属植物的 cDNA 保守序列， 设计
一对保守区扩增引物， 上游引物为 S1： 5′-TCTCCT
TCCTTATCCTTACCTTGG-3′， 下游引物为 X1： 5′-
GCTGCAACAAAATTGGCGTTTC-3′。
采用 RevertAidTM First-Strand Synthesis System
试剂盒进行保守区 cDNA第一链的合成， 其中接头
为AP（序列为 5′-GTACTAGTCGACGCGTGGCC-3′），
产物-20 ℃保存。 反应程序为： 94 ℃预变性 5 min，
94℃变性 45 s， 55℃退火 45 s， 72℃延伸 40 s， 72 ℃
最后延伸 10 min， 扩增 35 个循环。 特异的 PCR条
带经 Solarbio公司的琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回
收， 连接、 转化后选择正确的转化子由深圳华大基
因科技有限公司进行序列测定。
1.2.2 金弹 MLP2 基因 3′RACE 3′RACE cDNA
第一条链的合成同保守区 cDNA 第一链的合成方
法， 产物于-20 ℃保存。 将得到的 MLP2 基因保守
区序列与其它物种的比对， 选择相对特异的区域设
计出 2 条顺式上游引物： S3-1： 5′-TTGTCCGAGA
ATCCACTG-3′， S3-2： 5′-GATTCTCAGTGTTGCTA
TCTGG-3′。
采用 RT-PCR进行 MLP2基因 cDNA 3′端序列
的扩增， 第一轮 PCR 的下游锚定引物为 3P： 5′-
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3， 第二轮 PCR
的下游锚定引物为 3NP： 5′-CGCTACGTAACGGCA
TGACAGTG-3。 PCR 反应程序除第一轮退火温度
改为 54.2 ℃和第二轮退火温度改为 56.2 ℃外， 其
余 PCR 扩增参数同保守区克隆。 后续步骤同保守
区克隆。
1.2.3 金弹 MLP2基因 5′RACE 5′RACE cDNA的
逆转录是根据 5′RACE System for Rapid Amplification
of cDNA Ends， Version 2.0的试剂盒进行操作。
根据已得到的 MLP2 基因保守区序列设计出 2
条反式上游引物： S5-1： 5′-CGGTGACAGTGTTAA
TTTGATTCC-3′， S5-2： 5′-CAGTGGATTCTCGGA
CAATTGTAG-3′。 RT-PCR 扩增的第一轮 PCR 下
游锚定引物为 3P， 第二轮 PCR 下游锚定引物为
3NP。 PCR 反应程序除第一轮退火温度改为 57 ℃、
第二轮退火温度改为 58.7 ℃和 72 ℃延伸时间改为
40 s外， 其余参数及后续步骤同保守区克隆。
1.2.4 金弹 MLP2 基因全长的拼接及 ORF 验证
根据获得的MLP2基因全长， 设计 ORF引物 S2： 5′-
ATGAAGATTTCATTAGCAACAACACTC-3′和 X2： 5′
-TTACACAGACGTTGATCTTTCTGTAGC-3′ ， 进行
金弹 MLP2 cDNA 的 ORF 验证， PCR 反应程序除
退火温度改为 57.8℃和 72℃延伸时间改为 50 s外，
其余参数及 PCR 产物的回收纯化、 目的片段连接、
转化及测序同保守区克隆。
1.2.5 金弹 MLP2 生物信息学分析 用 DNAMAN
软件对获得的保守区、 3′和 5′端序列进行拼接获得
基因全长。 采用 NCBI 在线 BLAST 比对基因序列
推导的蛋白序列同源性。 利用 DNAMAN 软件推测
蛋白质一级结构， 并应用在线 ExPASy（http://www.
expasy.ch/tools/）蛋白分析软件 ProtParam、 ProtScale、
ScanProsite、 SWISS-MODEL、 COILS、 InterProScan
及在线 CBS Prediction Servers蛋白分析软件（http://www.
cbs.dtu.dk/services/）、 PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.
uk/psipred/submit） 、 WoLF PSORT （http://wolfpsort.org/）
对所获基因推导的氨基酸序列进行分析， 并利用
MEGA5.0 软件构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 金弹试管苗叶片总 RNA的提取
叶片总 RNA 电泳结果如图 1。 由图 1 可知，
提取的总 RNA质量较好， 28S rRNA和 18S rRNA条
带都较完整， 且 28S rRNA 的亮度约为 18S rRNA
亮度的两倍。 RNA在-80℃条件下保存备用。
图 1 金弹叶片总 RNA 琼脂糖凝胶电泳
1 为金弹叶片总 RNA， M 为 Mark DL 2 000。
1 M
bp
2 000
1 000
750
500
250
100
28S
18S
金建涛等： 金弹试管苗叶片 MLP2基因的克隆及其生物信息学分析 443- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
图 2 金弹 Fc-MLP2 亲疏水性预测
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
-0.5
-1
-1.5
-2
-2.5
0 50 100 150 200
ProtScale output for user sequence
Hphob . / Kyte ＆ Doolittle
Sc
or
e
Position
2.3.2 金弹 Fc-MLP2 的信号肽和亚细胞定位预测
分析 信号肽的预测结果如图 3： 金弹中 Fc-
MLP2 剪切位点值（C值）最大为 0.393， Y 值（综合
考虑S值和C值的一个参数）最大为 0.610， 在位点
26 处达到最大值， 因此该信号肽的切割位点应在
26位氨基酸处。 从 N端氨基酸开始到剪切位点（1-
2.2 金弹 MLP2基因全长的克隆
2.2.1 金弹 MLP2 基因保守区克隆 以 cDNA 第
一链为模板， PCR 扩增得到一条约 200 bp 的目的
条带。 测序显示该片段长度为 213 bp。 BLAST 比
对后， 认为所获得的序列是金弹 MLP2 基因的保守
序列。
2.2.2 金弹 MLP2 基因 3′RACE 获得的 3′RACE
片段长度为 602 bp， 与保守区有 104 bp 的重复序
列， 该序列实际大小为 498 bp， 其中包括一个含
24 个腺苷酸的poly（A）。 BLAST 比对后， 认为所获
得的序列是金弹 MLP2基因的 3′端序列。
2.2.3 金弹 MLP2 基因 5′RACE 获得的 5′RACE
片段长度为 269 bp， 与保守区有 50 bp 的重复序
列， 减去加尾序列和重复序列， 该序列实际大小为
197 bp。 BLAST 比对后， 认为所获得的序列是金弹
MLP2基因的 5′端序列。
2.2.4 金弹MLP2基因全长拼接与 ORF验证 根据
金弹 MLP2 基因保守区、 5′端和 3′端序列， 拼接出
全长 cDNA， 预测目的片段大小 672 bp， 测序结果
符合预期， 表明该序列为金弹 MLP2 基因序列。 该
cDNA 全长 908 bp， 具有完整的 ORF（15-683）， 共
669 bp， 编码 223 个氨基酸。 该 cDNA 序列已登录
GenBank， 登录号为 JX310276， 并命名为Fc-MLP2。
2.3 金弹 Fc-MLP2序列的生物信息学分析
2.3.1 金弹 Fc-MLP2 序列理化性质及亲疏水性预
测分析 分析结果如下： Fc-MLP2 由 223 个氨基
酸残基组成， 分子量为 24 149.6 ku， 理论等电点为
6.29， 由 20 种氨基酸组成， 其中 Leu、 Gly、 Ser 所
占比重较大， Met 含量最低。 负电荷氨基酸残基总
数为（Asp+Glu）为 20， 正电荷的总数（Arg+Lys）为
19， 分子式： C1081H1710N288O324S7， 原子总数： 3 410；
预测结果还显示该蛋白是一个稳定蛋白， 不稳定系
数为 31.93低于 40， 脂肪系数为 100.45， 总平均疏
水指数（GRAVY）为0.041， 表明它是一个疏水蛋白。
亲疏水性分析结果如图 2 所示。 由图 2 可知
ProtScale 程序预测结果与 ProtParam 程序预测结果
一致， 金弹 Fc-MLP2 属于疏水性蛋白， 疏水性氨
基酸数目偏多， 但整个多肽链中亲水性和疏水性氨
基酸的分布并不均匀， 其中该蛋白的第 13 位氨基
酸为疏水性最强的位点， 分值达到了 2.811， 第 119
位氨基酸为亲水性最强的位点分值为-2.144， 7-20
位有一个疏水性很强的区域， 其分值均在 1.5以上。
疏水性/亲水性是氨基酸的特点， 是影响蛋白质构
象的重要因素， 蛋白质结构的稳定性在很大程度上
依赖分子内的疏水作用， 因此可以推定金弹 Fc-MLP2
是一种稳定性较高的蛋白质， 具有保守区域。
444- -
第 3 期
该蛋白是在细胞膜或细胞外行使其功能。
2.3.3 金弹 Fc-MLP2 跨膜结构预测分析 由图 4
可以看出： Fc-MLP2 可能会在 7-29 和 44-66 位氨
基酸处分别形成两个跨膜螺旋， Fc-MLP2 的跨膜
螺旋氨基酸期望值为 39.252 48 远大于 18， 因此该
蛋白很可能是一个跨膜蛋白。 从 N 末端开始的前
60 个氨基酸期望值（Exp number， first 60 Aas）为
35.054 21 大于 10， 因此可以预测金弹 Fc-MLP2 具
有信号肽的序列， 其中 7-29 处的跨膜螺旋可形成
N末端在膜外、 方向由内向外的跨膜螺旋的概率达
到了 0.930 07， 由此可以推断金弹 Fc-MLP2 是一
个跨膜蛋白。 因此， 金弹 Fc-MLP2 可能与细胞信
25位）各氨基酸的平均值（S-mean）为 0.944， 此段
的 D 值（S平均值和Y最大值的加权平均值）达到了
0.790， 这段正是 ProtScale 工具预测的该蛋白最强
疏水区域， 由此可以判断金弹 Fc-MLP2 中具有信
号肽， 推测该蛋白为分泌蛋白， 即该蛋白具有跨膜
结构， 在信号肽的引导下分泌到细胞外， 预测该蛋
白是定位于细胞外。
亚细胞定位预测结果表明： 金弹 Fc-MLP2 定
位于细胞外的可能性为 0.776， 定位于内质网膜、
内质网腔、 高尔基体的可能性很低， 均为 0.1。 由
此可以推测该蛋白为分泌蛋白， 这与 SignalP 4.0
程序对其进行信号肽的预测结果一致。 因此， 推测
Position
Sc
or
e
SignalP-4.0 prediction（euk networks）： ERP44_HUMAN
C-score
S-score
Y-score1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
图 3 金弹 Fc-MLP2 信号肽预测
图 4 金弹 Fc-MLP2 跨膜区预测
pr
ob
ab
ili
ty
TMHMM posterior probabilities for Sequence
transmembrane inside outside
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
50 100 150 200
金建涛等： 金弹试管苗叶片 MLP2基因的克隆及其生物信息学分析 445- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
功能位点预测结果显示： 金弹 Fc-MLP2 有 2
个功能位点， 第一个为 TonB 受体蛋白（1-26 位），
它可以与膜外的一种受体蛋白相互作用参与一些物
质由膜内到膜外运输。 第二个属于 Kunitz STI 蛋白
家族（33-49 位）， 它对植物中的一些蛋白酶的活性
有抑制作用， 而且 Kunitz STI蛋白家族中一些成员
会在抵御逆境伤害方面起到一定作用。 拥有相同的
功能位点的蛋白其生物学功能具有相似性， 由此说
明， 金弹 Fc-MLP2 可能与一些物质由膜内到膜外
运输有关， 而且还可能在抵御病原菌和害虫伤害方
面起作用。
保守结构域预测结果如图 6： Fc-MLP2 含有专
属 Kunitz STI 蛋白家族特征的 3个结构域， 它们在
蛋白肽链上的第 32-66、 第 71-91、 第 156-175 位
号传导和物质在细胞膜内外的运输有关。
2.3.4 金弹 Fc-MLP2磷酸化位点、 功能位点和保守
结构域的预测分析 磷酸化位点预测结果如图 5：
在多肽链中丝氨酸（Ser）、 苏氨酸 （Thr）和酪氨酸
（Tyr） 都可能发生磷酸化， 其中丝氨酸磷酸化位点最多，
有 7 个（分别是第 91、 102、 114、 134、 176、 191、
222 位氨基酸）， 预测的最高分达到 0.997， 在第
191 位氨基酸处； 其次在第 141、 168、 217、 221
位的苏氨酸也能发生磷酸化， 酪氨酸的磷酸化位点
只有 2 个， 分别在第 118、 169 位氨基酸处。 蛋白
质的磷酸化是重要的翻译后修饰， 磷酸化的丝氨酸
和苏氨酸在生理条件下十分稳定， 与植物免疫系统
有关。 Fc-MLP2的一个重要特点就是拥有较多的磷
酸化位点， 这些位点与植物的防御功能密切相关[19]。
因此， 金弹 Fc-MLP2 可能与抵抗病原菌伤害时的
防御机制有密切关系。
图 5 金弹 Fc-MLP2 磷酸化位点的预测
Sequence position
Ph
os
ph
or
yl
at
io
n
po
te
nt
ia
l
NetPhos 2.0： predicted phosphorylation sites in Sequence
Threshold
Tyrosine
Threonine
Serine
0 50 100 150 200
1
0
图 6 金弹 Fc-MLP2 保守结构域预测分析
446- -
第 3 期
三维结构预测模型如图 8： 该蛋白的主要结构元
件是 β 折叠和无规则卷曲。 在 SWISS-MODEL 文
库中比对显示该蛋白来自源于神秘果素相似蛋白，
但该蛋白没有变味的特性， 这与 Tsukuda[12]的研究
结果一致。
卷曲螺旋预测结果显示 ： 金弹 Fc-MLP2 在
window=14、 21 和 28 时， 形成卷曲螺旋的预测概
率都较低， 均远低于 0.5， 说明金弹 Fc-MLP2 不能
形成卷曲螺旋结构。
2.3.6 金弹 Fc-MLP2氨基酸序列分析及系统进化树
的构建 将获得的金弹 Fc-MLP2基因 ORF推导的
氨基酸序列登录到 NCBI网站， 用 BLAST进行蛋白
质同源性检索， 发现该序列与粗皮柠檬（BAE79511.1）、
柠檬 （AEK31196.1） 、 来檬 （AEK31197.1） 、 酸橙
（AEO27901.1）、 橘（AEK31200.1）、 木橘（AEK31199.1）、
氨基酸之间。 蛋白结构与其发挥的功能密切相关，
结构的保守性与功能的保守性呈正相关。 以上结果
可以看出， 从金弹叶片中克隆的 Fc-MLP2 含有典
型的 Kunitz STI 保守结构域， 拥有共同的保守结构
域意味着其拥有相似功能。 Kunitz STI 在植物中起
防御作用， 因此推测金弹 Fc-MLP2 应该和植物受
到外界侵害时的防御机制有关。
2.3.5 金弹 Fc-MLP2二级结构、 三级结构和卷曲螺
旋的预测分析 二级结构分析结果如图 7： Fc-MLP2
的结构由 α螺旋、 β折叠和无规则卷曲组成。 在整
个蛋白中， 无规则卷曲为比例最大的结构元件， α
螺旋所占比例最小， 整个 Fc-MLP2 只有一个区域
有该结构元件， β 折叠和无规则卷曲分布在整个氨
基酸序列中。 金弹 Fc-MLP2 的结构功能定位于氨
基酸序列中的 1-26 位和 33-49 位， 而从二级结构
分布图可以看出， 在这一区域内的氨基酸大部分呈
β 折叠和 β 转角， 可能金弹 Fc-MLP2 在这个区域
存在功能位点， 这与其结构有密切关系。 N 末端的
50 位氨基酸残基含有较多的无规则卷曲， 推测金
弹 Fc-MLP2 在 N端可能存在活性位点。
图 7 金弹 Fc-MLP2 二级结构的预测结果
图 8 金弹 Fc-MLP2 三维结构预测
金建涛等： 金弹试管苗叶片 MLP2基因的克隆及其生物信息学分析 447- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
3 讨论
3.1 金弹 Fc-MLP2基因的克隆与序列分析
目前已经从其它植物物种中克隆到了MLP2基因，
但这些植物除葫芦属于葫芦科（Cucurbitaceae）外，
其他均属于芸香科（Rutaceae）。 本研究对金弹 Fc-
MLP2 蛋白进行生物信息学分析发现： Fc-MLP2 可
能是一个定位于细胞外的疏水性蛋白质， 具有一个
信号肽， 这与 Masuda 等 [8]的预测结果是基本一致
的； Fc-MLP2 蛋白以 Ser 为主 Thr 和 Tyr 为辅发生
磷酸化， 蛋白质的磷酸化通过影响蛋白质整体构象
及酶的活性和功能并提供被其他蛋白质识别的标志。
Fc-MLP2 的二级结构中 β 折叠和无规则卷曲占较
大比例， 说明该蛋白具有较多的活性位点。 进化树
分析发现： 金弹 Fc-MLP2 与粗皮柠檬 RlemMLP2
的亲缘关系很近， 相似性达到了 99％， 推测二者
的生物学功能较相似。
3.2 金弹 Fc-MLP2的结构与功能
研究发现： 在成熟的奇异果果实中神秘果素可
以达到水溶性蛋白的 10％， 此蛋白在成熟奇异果、 转
基因番茄和转基因莴苣的细胞间隙中大量积累 [20-21]，
Tsukuda 等[12]认为植物受到伤害或被病原体感染时
MLP2 会分泌到细胞壁和角质层的间隙， 是防御病
原体攻击的第一道防线， 这和本研究该蛋白是定位
于细胞外的分泌蛋白的预测结果一致 。 烟草中
月橘（AEK31201.1）、 葫芦（AEO27900.1）、 调料九
里香（AEK31202.1）、柚（AEK31198.1）的相似性都很
高分别达到了 99％、 97％、 95％、 96％、 92％、
91％、 92％、 89％、 86％和 82％。
采用 MEGA5.0 软件分析构建金弹 Fc-MLP2 的
系统进化树如图 9： 金弹 Fc-MLP2 与粗皮柠檬
RlemMLP2 的亲缘关系比较近， 聚为同一类， 因此
可以推测粗皮柠檬 RlemMLP2 与金弹 Fc-MLP2
的功能间具有一定的相似性， 在植物体中起到防卫
作用。
金弹 Fortunella crassifolia
粗皮柠檬 Citrus jambhiri
酸橙 Citrus aurantium
柠檬 Citrus limonia
来檬 Citrus aurantiifolia
橘 Citrus reticulata
木橘 Aegle marmelos
葫芦 Lagenaria siceraria
月橘 Murraya paniculata
柚 Citrus maxima
调料九里香 Murraya koenigii
温州蜜柑 Citrus unshiu
葡萄柚 Citrus × paradisi
杂柑 Citrus hybrid cultivar
0.05
70
58
39
79
43
88
68
81
96
85
100
图 9 金弹 Fc-MLP2 的系统进化树
448- -
第 3 期
MLP2基因与病原体的侵害协同表达， 产生不同蛋白
酶抑制剂来抵抗由微生物引起的病原体侵害 [22]。
MLP2 还可以起到抑制引起柑橘属植物黑腐病病菌
孢子萌发的作用 [23-24]。 RlemMLP2 在粗皮柠檬受到
害虫或病原菌伤害时， 起到一定的防御作用 [4]， 金
弹 Fc-MLP2与粗皮柠檬 RlemMLP2的亲缘关系比较
近， 因此可以推测金弹 Fc-MLP2 也可以对害虫或
病原菌的侵害起到防御作用。 神秘果素抗真菌的作用
可能与定位于细胞外的真菌蛋白有一些关联 [11，25-26]。
因此， 该蛋白是分泌到细胞外起作用， 这也印证了
金弹 Fc-MLP2 定位于细胞外的推测。 本研究发现
金弹 Fc-MLP2 具有 Kunitz STI 的功能位点和相似
的保守区域， 该蛋白还有多个丝氨酸磷酸化位点，
因此金弹 Fc-MLP2 可能在调控其生理功能方面起
作用。 Kunitz-STI 可以抑制害虫和病原菌消化蛋白
酶的活性， 对植物防御有重要作用 [27]。 有证据显
示： 从蚕豆和玉米中提取的胰蛋白酶抑制剂可以抑
制真菌活性 [28-29]。 最近研究显示： 柑橘植株在感染
黄龙病（HLB）时， MLP含量有显著提升[30]。
Kunitz STI 对植物本身有保护作用， 并具有抗
虫作用 [31]。 金弹 Fc-MLP2 具有 Kunitz STI 的功能
位点， 含有典型的 Kunitz STI保守结构域， 因此可
以推测金弹 Fc-MLP2 具有大豆胰蛋白酶抑制剂相
似功能。 本研究推测： 组培条件下金弹试管苗受到
光照、 生长空间、 氧气和营养物质等胁迫， 促使
Fc-MLP2 基因大量表达， Fc-MLP2 分泌到细胞壁
和角质层间隙起到抵抗饥饿和延缓植物衰老的作
用。 但是， Fc-MLP2 基因在金弹离体种质保存中
作用的研究还极少有人进行， Fc-MLP2 在金弹抗
饥饿和延缓植物衰老方面的作用机制还需要进一步
深入研究。
参考文献
[1] 成翠兰. 神秘果的生物学特性及提取物的应用[J]. 云南热作科
技， 2000， 23（001）： 34-36.
[2] Brouwer J， Van Der Wel H， Francke A， et al. Miraculin，
the sweetness -inducing protein from miracle fruit [J]. J Biol
Chem，1968， 220： 373-374.
[3] Giroux E L， Henkin R I. Purification and some properties of
miraculin， a glycoprotein from Synsepalum dulcificum which
provokes sweetness and blocks sourness[J]. Journal of Agricultural
and Food Chemistry， 1974， 22（4）： 595-601.
[4] Kurihara Y. Characteristics of antisweet substances， sweet proteins，
and sweetness -inducing proteins [J]. Critical Reviews in Food
Science & Nutrition， 1992， 32（3）： 231-252.
[5] Theerasilp S， Hitotsuya H， Nakajo S， et al. Complete amino
acid sequence and structure characterization of the taste-modifying
protein， miraculin[J]. Journal of Biological Chemistry ， 1989，
264（12）： 6 655-6 659.
[6] Paladino A， Costantini S， Colonna G， et al. Molecular modelling
of miraculin： structural analyses and functional hypotheses [J].
Biochemical and biophysical research communications， 2008，
367（1）： 26-32.
[7] Kurihara K， Beidler L M. Mechanism of the action of taste-
modifying protein[J]. Nature， 1969， 222： 1 176-1 179.
[8] Masuda Y， Nirasawa S， Nakaya K， et al. Cloning and sequencing
of a cDNA encoding a taste -modifying protein， miraculin [J].
Gene， 1995， 161（2）： 175-177.
[9] Mondego J M C， Duarte M P， Kiyota E， et al. Molecular
characterization of a miraculin-like gene differentially expressed
during coffee development and coffee leaf miner infestation [J].
Planta， 2011， 233（1）： 123-137.
[10] Gahloth D， Selvakumar P， Shee C， et al. Cloning， sequence
analysis and crystal structure determination of a miraculin-like
protein from Murraya koenigii [J]. Archives of biochemistry and
biophysics， 2010， 494（1）： 15-22.
[11] Kuwabara C， Takezawa D， Shimada T， et al. Abscisic acid-
and cold-induced thaumatin-like protein in winter wheat has
an antifungal activity against snow mould， Microdochium nivale[J].
Physiologia plantarum， 2002， 115（1）： 101-110.
[12] Tsukuda S， Gomi K， Yamamoto H， et al. Characterization of
cDNAs encoding two distinct miraculin -like proteins and
stress -related modulation of the corresponding mRNAs in
Citrus jambhiri Lush. [J]. Plant molecular biology， 2006， 60
（1）： 125-136.
[13] Sweet R， Wright H， Janin J， et al. Crystal structure of the
complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor
（Kunitz）at 2.6 A resolution[J]. Biochemistry， 1974， 13（20）：
4 212-4 228.
[14] Onesti S， Brick P， Blow D M. Crystal structure of a Kunitz-
type trypsin inhibitor from Erythrina coffra seeds[J]. Journal of
molecular biology， 1991， 217（1）： 153-176.
[15] Roychaudhuri R， Sarath G， Zeece M， et al. Reversible denaturation
of the soybean Kunitz trypsin inhibitor[J]. Archives of biochemistry
and biophysics， 2003， 412（1）： 20-26.
[16] Kang Z， Jiang J， Wang D， et al. Kunitz-type trypsin inhibitor
with high stability from Spinacia oleracea L. seeds[J]. Biochemistry
（Moscow）， 2009， 74（1）： 102-109.
[17] Chaudhary N S， Shee C， Islam A， et al. Purification and
characterization of a trypsin inhibitor from Putranjiva roxburghii
seeds[J]. Phytochemistry， 2008， 69（11）： 2 120-2 126.
[18] 韩牙琴. 金弹和四季桔试管苗离体保存及其蛋白质组学研究[D].
福州： 福建农林大学， 2007.
[19] Selvakumar P， Gahloth D， Tomar P P S， et al. Molecular
evolution of miraculin-like proteins in soybean kunitz super-
family[J]. Journal of molecular evolution， 2012： 1-11.
[20] Hirai T， Sato M， Toyooka K， et al. Miraculin， a taste-modifying
protein is secreted into intercellular spaces in plant cells [J].
Journal of plant physiology， 2010， 167（3）： 209-215.
[21] Sun H J， Cui M， Ma B， et al. Functional expression of the
taste -modifying protein， miraculin， in transgenic lettuce [J].
FEBS letters， 2006， 580（2）： 620-626.
金建涛等： 金弹试管苗叶片 MLP2基因的克隆及其生物信息学分析 449- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
[22] Goodwin P H， Xie W， Valliani M. Three genes of miraculin-
like proteins from Nicotiana benthamiana with dissimilar putative
structures show highly similar patterns of induction following
bacterial and fungal infections [J]. European Journal of Plant
Pathology， 2012： 1-16.
[23] Isshiki A， Akimitsu K， Yamamoto M， et al. Endopolygalacturonase
is essential for citrus black rot caused by Alternaria citri but
not brown spot caused by Alternaria alternata [J]. Molecular
plant-microbe interactions， 2001， 14（6）： 749-757.
[24] Akimitsu K， Peever T L， Timmer L. Molecular， ecological and
evolutionary approaches to understanding Alternaria diseases of
citrus[J]. Molecular plant pathology， 2003， 4（6）： 435-446.
[25] Schweiger-Hufnagel U， Ono T， Izumi K， et al. Identification
of the extracellular polysaccharide produced by the snow mold
fungus Microdochium nivale[J]. Biotechnology letters， 2000， 22
（3）： 183-187.
[26] Ibeas J I， Yun D J， Damsz B， et al. Resistance to the plant
PR -5 protein osmotin in the model fungus Saccharomyces
cerevisiae is mediated by the regulatory effects of SSD1 on
cell wall composition [J]. The Plant Journal ， 2001， 25 （3）：
271-280.
[27] Ryan C A. Protease inhibitors in plants： genes for improving
defenses against insects and pathogens [J]. Annual review of
phytopathology， 1990， 28（1）： 425-449.
[28] Chen Z Y， Brown R L， Lax A R， et al. Inhibition of plant-
pathogenic fungi by a corn trypsin inhibitor overexpressed in
Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology，
1999， 65（3）： 1 320-1 324.
[29] Ye X， Ng T， Rao P. A Bowman-Birk-type trypsin-chymotrypsin
inhibitor from broad beans[J]. Biochemical and biophysical research
communications， 2001， 289（1）： 91-96.
[30] Fan J， Chen C， Yu Q， et al. Comparative iTRAQ proteome
and transcriptome analyses of sweet orange infected by “Candidatus
Liberibacter asiaticus” [J]. Physiologia plantarum， 2011， 143
（3）： 235-245.
[31] 金 蓓， 田少君. 大豆胰蛋白酶抑制剂研究概况[J]. 粮食与油
脂， 2005， 6： 3-6.
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