全 文 ：农业环境科学学报 2006,25(2):281-285
JournalofAgro-EnvironmentScience
收稿日期:2005-11-25
基金项目:中国科学院创新团队国际合作伙伴计划“土壤生物环境与
农产品安全研究”(NO.CXTD-Z205-4-1);江苏省自然科学
基金项目(BK2004219;BK2001064)
作者简介:薛 艳(1978—),女,硕士,主要研究方向为土壤环境化学。
通讯联系人:周东美 E-mail:dmzhou@issas.ac.cn
摘 要:选择具有耐性差异的 2个青菜品种火青菜和四月慢为供试材料,通过水培试验考察其对铜的吸收、根系活力、叶绿素、氨
基酸和谷胱甘肽(GSH)含量以及铜结合蛋白等生理生化指标的影响。结果表明:四月慢较火青菜对铜有较快的吸收;与四月慢相
比,火青菜在铜的胁迫条件下能够产生更多的氨基酸和 GSH,并表现出更强的根系活力。根系蛋白凝胶色谱结果显示有 2个峰出
现,分别为大分子的铜结合蛋白和小分子的Cu-PCs。不同青菜品种对铜耐性的差异与它们的生理生化响应过程有关。
关键词:铜;青菜;品种差异;生理生化过程
中图分类号:X503.23文献标识码:A 文章编号:1672-2043(2006)02-0281-05
蔬菜是人们日常生活中不可或缺的重要副食品,
它提供了丰富而廉价的多种维生素、纤维素和矿物
质,在食物的结构中占有重要地位。不同种类蔬菜对
重金属的吸收是不相同的。黄雅琴等[1]发现在一种铜
污染土壤上生长的胡萝卜的铜含量较其在清洁土壤
上生长的增加 1.3倍,菠菜仅增加 0.29倍,而在高铅
浓度下,菠菜中的铅含量远远大于胡萝卜和韭菜[2]。段
敏等[3]检测了17种蔬菜,发现在其他蔬菜镉含量均未
超标情况下,茄子中有 16.7%超标,最高超标达 4
倍;芹菜中有33.3%超标,最高超标达1.4倍;而对铬
含量,菜花中有20%超标,最高超标达 5.2倍。类似
结果还有很多报道。一些研究还表明同一种蔬菜的不
同品种吸收重金属也存在差异,如 Michalik等[4]把 4
个变种的胡萝卜播种在3个不同重金属污染的地方,
发现无论在何处,变种“Kama”肉质根中的 Pb、Ni、Cr、
2 种不同耐性青菜品种对铜胁迫响应差异的机制研究
薛 艳 1,2,周东美 1,郝秀珍 1,沈振国 2,陈怀满 1
(1.中国科学院南京土壤研究所,土壤与农业可持续发展国家重点实验室,江苏 南京 210008;2.南京农业大学生命科学院,江苏
南京 210095)
StudyofResponseMechanismsofTwoCultivarsofPakchoi(Brassica chinensis)toCu
XUEYan1,2,ZHOUDong-mei1,HAOXiu-zhen1,SHENZhen-guo2,CHENHuai-man1
(1.StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China;
2.CollegeofLifeScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)
Abstract: ResponsemechanismsoftwocultivarsofBrassicachinensistoCuwereinvestigatedusinghydroponiccultureexperiments. The
resultsshowedthattherootCuconcentrationwashigherthanthatoftheshootinboththetwocultivarsofB. chinensis. Withtheincreasing
cultivation period, the Cu concentrations in root and shoot in the same cultivar had the similar accumulation tendency, but it is different
betweenthetwocultivars.TheCuuptakeofHuoqingcaireachedtoequilibriummorequicklythanSiyueman.Incomparisonwiththecultivar
Siyueman,Cutreatmentmorestronglyincreasedthecontentofaminoacids,GSH,andtherootlivingnessaswellforthecultivarHuoqingcai,
whichmeansthatthesephysiologicalindexesaffectedthetoxicityofCutopakochiotosomeextend. Inthedilutiondiagramofplantrootby
SephadexG-50, therearetwoCuandproteinspeaksappeared. ThefirstoneislabeledasCu-inducedprotein, andthesecondoneissmall
molecularCu-combinedPCsoraminoacids. ThequantitiesofproteininthetwocultivarsofB. chinensissignificantlyincreasedwiththe
increasingCutreatmentconcentrations.
Keywords:copper;Brassicachinensis;cultivar;physiologicalandbiochemicalprocess
2006年4月
Cu、Mn等重金属含量均为最高。不同蔬菜对重金属
吸收能力的差异原因很多,其中主要是根际在重金属
胁迫下的生理响应差异。不同植物根系分泌物相差很
大,如烟草属植物根系分泌物能够促进重金属 Cd的
溶解,而玉米根系分泌物则不能[5];另外,不同植物对
重金属的吸收能力和重金属在植物体内的传输能力
存在差异[6]。
本试验选用的两个青菜品种均是江苏普遍栽培
蔬菜,且对铜分别表现出敏感性和耐性[7、8]。通过研究
这2种青菜对铜的吸收动力学、青菜叶绿素含量、根
际活力、GSH和铜结合蛋白的的变化,揭示了不同耐
性品种对铜响应差异的机制。
1 试验材料与方法
1.1水培试验
火青菜和四月慢均购自南京蔬菜研究所。挑选大
小一致的种子播于河沙中,在室温下萌发,于播种后
5d选取长势良好且一致的幼苗移植在含2L营养液
的营养钵中生长,每2d更换1次培养液。培养液是
1/2Hoagland营养液(微量元素不稀释)。营养液pH用
HCl和NaOH调至5.3。
试验设 3个铜处理,分别为 CK(0.32μmol·L-1)、
3.0和10μmol·L-1(Cu2+以CuSO4提供),每处理3个重
复。铜处理0、2、4和8d时,分别采集植物样品,将根
系和地上部分开,洗净,于 70°C烘至恒重,用于测定
植株中铜的含量。分析测定方法:烘干的植物样品用
不锈钢的“灿坤”磨样机磨碎,用HNO3-HClO4混合液
消煮,Hitachi180-80火焰原子吸收分光光度计
(AAS)测定重金属元素和其他阳离子的含量。
生理指标的测定包括叶绿素、根系活力、氨基酸、
谷胱甘肽和铜结合物等。
1.2叶绿素含量的测定
叶绿素测定参照张宪政[9]的方法:取新鲜植株的
第4片真叶,用自来水冲洗后再用去离子水冲洗,吸
水纸吸干水分,用不锈钢剪刀剪成细条型(避开大叶
脉),准确称取1.00g左右的碎叶片,放于10mL的刻
度试管中用丙酮∶乙醇 (V∶V)=1∶1提取4h以上至叶
片全变白。分别测定提取液的A645、A663,按丙酮法
公式计算叶绿素含量。
1.3根系活力的测定
参照李合生[10]的方法:称取根尖样品 0.5g,放入
10mL烧杯中,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的
等量缓和液 10mL,把根充分浸没在溶液内,在 37℃
下暗保温 3h,此后加入 1mol·L-1硫酸 2mL,以停止
反应。与此同时作一个空白试验,先加硫酸,再加根样
品,在37℃下暗保温3h后加硫酸。把根取出,吸干水
分后与乙酸乙脂3~4mL和少量石英砂一起在研钵内
磨碎。红色提取液全部移入试管,最后加入乙酸乙脂
使总量为10mL,以空白作参比,测OD485。
1.4氨基酸的测定
参照李合生的方法[10]:取新鲜植株样品,洗净擦
干剪碎混匀后,称取 0.1g左右于研钵中加入 3
mL10%乙酸,研磨匀浆后,用蒸馏水稀释至50mL,混
匀,并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。根据作标准曲
线的方法加入显色剂,最后定容至10mL。混匀后用
1cm光径比色皿在570nm波长下测定吸光度,对照
标准曲线,算出100g样品中氨基态氮含量。
1.5谷胱甘肽含量的测定
参照Guri[11]和Elman[12]的方法:取新鲜植株的第
4片和第5片真叶,用自来水冲洗后再用去离子水冲
洗,吸水纸吸干水分,用不锈钢剪刀剪成小块(避开大
叶脉)混匀,准确称取 1.00g左右,加入 0.5mmol·L-1
EDTA-Na2(含0.3%TCA)5mL冰浴研磨提取。提取液
在冷冻条件下过滤,取过滤清液定容至 10mL,然后
用 6mol·L-1NaOH调节其 pH在 6.0~8.0范围内,记
录试管刻度。另取一组刻度试管编号,使每一试管含
有3mL缓冲液 (0.2mol·L-1的磷酸缓冲液,pH7.0),
0.1mLDTNB,1mL植株清液。放置 30min后,测
OD412,空白不加DTNB。
1.6铜结合物分析
铜结合物提取参照黄玉山等[13]的方法:分别取
CK(0.32μmol·L-1)、3.0和 10μmol·L-1铜处理 8d的
青菜根系10.0g,置于研钵中,加 15mL预冷(4℃)的
50mmol·L-1PBS(pH7.4,含10mmol·L-1β-巯基乙
醇),冰浴研磨,再加 20mL上述浸提液提取,4层纱
布过滤,滤液80000g离心60min,上清液冰冻备用。
SephadexG-50柱(1.6cm×65cm)先用 10mmol·
L-1PBS(pH7.4)平衡,取2mL粗提液上柱,并用相同
的缓冲液洗脱,流速0.5mL·min-1,排10mL外水体积
后每 5mL收集一支试管。洗脱液分别用于 λ254、
λ280的紫外吸收分析和铜含量的测定。
2 结果与分析
2.1青菜含铜量随处理时间的变化
生长28d的青菜幼苗用不同浓度的铜溶液处理
不同天数后,测定植株铜含量,结果见图1。同一品种
薛 艳等:2种不同耐性青菜品种对铜胁迫响应差异的机制研究282
第25卷第2期 农 业 环 境 科 学 学 报
地上部和根系含铜量随铜处理时间的变化趋势基本
一致。例如,火青菜地上部和根系含铜量随铜处理时
间的延长而增加,而四月慢的地上部和根系的铜含量
随铜处理时间的延长先增加后有下降的趋势。2个品
种相比,在3.0μmol·L-1铜处理时,四月慢只需2d的
时间其体内的地上部铜含量就达到最大值,在其后的
处理过程中,地上部的铜含量几乎保持不变;而火青
菜在8d处理的过程中,其地上部的铜含量一直趋于
增加。在10.0μmol·L-1铜处理时,火青菜地上部的铜
含量随着铜处理时间的延长一直缓慢增加,四月慢地
上部的铜含量在前4d随着处理时间的延长而增加,
4d后有下降的趋势。
0 2 4 8 0 2 4 8
20
15
10
5
0
20
15
10
5
0
处理时间/d 处理时间/d
地
上
部
铜
含
量
/m
g·
kg
-1
图1 不同浓度铜处理不同时间火青菜(A)和四月慢(B)植株地上部分铜含量
Figure1ShootCuconcentrationsofHuoqincai(A)andSiyueman(B)exposingtodiferentconcentrationsofCu
2.2不同铜处理对叶绿素含量和根系活力的影响
抑制叶绿素合成及破坏叶绿体结构是铜过量对
植物产生毒害的重要原因之一[14]。Luna等[15]报道,0.1
和 1.0mmol·L-1Cu2+使燕麦叶绿素和类胡萝卜素降
解,同时还可以抑制光合作用电子传递。本研究发现,
不同铜浓度处理青菜,2个品种的叶绿素变化趋势一
致,均为先下降后上升,但变化不显著,见图2。这与
其他实验结果不一样[16],可能是因为铜的毒害使青菜
的叶子变小变厚,单位体积的叶绿素增加所致,其机
理有待于进一步研究。
不同铜浓度处理四月慢和火青菜,2个品种的根
系活力变化情况不同。其中四月慢的根系活力随着铜
处理浓度的升高而降低,而火青菜的根系活力随着铜
浓度的升高先升高后降低。2个品种相比较,对照时
(铜 0.32μmol·L-1),其根系活力没有差异,而铜处理
浓度达到3.0μmol·L-1时,两者的根系活力差异显著
(P<0.05),火青菜的根系活力远大于四月慢的根系活
力,见图2。
2.3氨基酸和GSH含量
不同铜浓度处理四月慢和火青菜的地上部氨基
酸的变化情况不同。其中四月慢地上部的氨基酸含量
随着铜处理浓度的升高而有下降的趋势,但是变化不
大,而火青菜地上部的氨基酸含量随着铜浓度的升高
先升高后降低。2个品种相比较,对照时 (铜 0.32
图2不同浓度铜处理青菜叶绿素和根系活力的影响
Figure2ChangesofpigmentscontentandrootlivingnessofB.chinensisasafectedbydiferentCuconcentration
CK 3 10
铜处理浓度/!mol·L-1
CK 3 10
铜处理浓度/!mol·L-1
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
15
12
9
6
3
0
C
hl
.a
含
量
/m
g·
g-
1
根
系
活
力
/g·
g-
1 ·
h-
1
四月慢
火青菜
CK
3
10
CK
3
10
四月慢
火青菜
地
上
部
铜
含
量
/m
g·
kg
-1
A B
283
2006年4月
CK 3 10
铜处理浓度/!mol·L-1
四月慢
火青菜
μmol·L-1)其地上部的氨基酸含量没有差异,而铜处
理浓度达到3.0μmol·L-1时,两者的氨基酸含量差异
显著(P<0.05),火青菜地上部的氨基酸含量远大于四
月慢地上部的氨基酸含量,见图3。
与有机物质发生螯合是植物对细胞内重金属解
毒的方式之一,进入细胞内的重金属离子可以与细胞
中的有机酸、氨基酸、蛋白质等结合,从而使重金属的
毒性降低。试验结果表明,在3.0和10.0μmol·L-1铜
浓度处理过程中,2个品种青菜叶片中的 GSH含量
都表现为先上升后下降,见图4。铜处理浓度越高,四
月慢和火青菜的叶片中GSH含量也越高。但是处理
浓度不同,2品种叶片中GSH含量的变化趋势不同。
在铜处理浓度是 3.0μmol·L-1时,2个品种都是在第
4d达到最大值,而且两者没有显著差异。而铜处理浓
度是10.0μmol·L-1时,2个品种都是在第 2d达到最
大值;与 3.0μmol·L-1铜处理不同的是,此时 2个品
种GSH的含量差异显著,火青菜叶片中的GSH明显
高于四月慢叶片中的GSH。
2.4铜在蛋白质提取液中的分布
青菜根系蛋白提取液经 SephadexG-50凝胶过
滤(外水体积10mL),层析结果见图5。
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
氨
基
酸
含
量
/%
图3不同浓度铜处理青菜地上部氨基酸含量的影响
Figure3ContentofaminoacidsintheshootofB.chinensisas
afectedbydiferentconcentrationsofCu
图4火青菜(A)和四月慢(B)叶片中GSH含量的变化
Figure4EfectsofCutreatmentsontheGSHcontentsofHuoqincai(A)andSiyueman(B)
在所有处理中,根系蛋白提取液中蛋白质和铜的
分布曲线主要有 2个峰 (20~25mL和 95~100mL)。
蛋白质及铜含量因铜浓度处理和品种的不同而有差
异。无论蛋白质还是铜含量在对照植株中都比较少,
而 3.0和 10.0μmol·L-1铜处理均能增加 2个品种青
菜根系蛋白质提取液中铜和蛋白质的含量。
铜在蛋白提取洗脱液中出现的位置与蛋白质出
现的位置相一致。其中第1个峰表明铜可能被一些大
分子量的蛋白质结合;第 2个峰表明铜可能以 Cu-
PCs的形式存在[17、18]或是被一些小分子量的蛋白或氨
基酸类结合。铜的结合蛋白包括组成型和诱导型两部
分,本研究所洗脱出的分别出现在2个峰的蛋白质分
别代表了这2种类型:蛋白质分布的第1个峰(20~25
mL)受铜处理促进而增加,属于诱导型蛋白质;第 2
个峰(95~100mL)虽然也受铜处理促进而增加但是
现象不如第1个峰明显,所以该峰的蛋白质应该是诱
导型和组成型相混合的蛋白。本研究结果虽然表明青
菜根系中可能有铜结合蛋白或多肽存在,但是还未进
一步分析这些结合蛋白或多肽的分子量、结构及其作
用。
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CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
0 2 4 8
90
60
30
0
90
60
30
0
G
SH
含
量
/m
g·
kg
-1
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
处理时间/d
0 2 4 8
处理时间/d
A B
G
SH
含
量
/m
g·
kg
-1
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0 20 40 60 80 100 120 140 160 180200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180200
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
收
值
/2
80
nm
吸
收
值
/2
54
nm
C
u含
量
/m
g·
kg
-1
a
b
c
d
e
f
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
CK
3μmol·L-1
10μmol·L-1
洗脱体积/mL 洗脱体积/mL
图5不同浓度铜处理8d火青菜(a-Cu含量;b-吸收值/254nm;c-吸收值/280nm)和四月慢(d-Cu含量;e-吸收值/254nm;
f-吸收值/280nm)根系结合蛋白提取液SephdaxG-50层析图
Figure5GelfiltrationofCubindingproteinintherootsofHuoqingcai(a-Cuconcentration;b-absorbance/254nm;c-absorbance/280nm)
andSiyueman(d-Cuconcentration;e-absorbance/254nm;f-absorbance/280nm)onSephadexG-50
285