全 文 ：大孔吸附树脂分离纯化复方瓜子金中的靛玉红
★　董岿　徐国良　刘淑平　(江西江中药业股份有限公司　南昌 330077)
摘要:目的:考察中草药中非水溶性成分靛玉红在大孔树脂上的吸附及解吸行为。方法:采用 HPLC 法。结果:在确立的纯化
条件下 , 12-1树脂对靛玉红的吸附量为 0.256 mg/ g , 纯化倍数为 9.2。结论:在一定条件下 , 大孔吸附树脂可用于非水溶性
中草药有效成分的分离纯化。
关键词:大孔树脂;复方瓜子金;靛玉红
中图分类号:R 284.2　　文献标识码:A
　　大孔吸附树脂是近年来国内外新发展的分离纯
化技术 ,并在医药领域(特别是天然药物精制)中广
为运用 ,是提取分离中草药中水溶性有效成分的一
种有效方法[ 1] 。但对非水溶性有效成分的分离纯
化却未见报道 。为此 ,我们研究了中草药中非水溶
性成分在大孔吸附树脂上的吸附及解吸行为。
复方瓜子金系由瓜子金 、大青叶 、紫花地丁 、野
菊花 、海金沙 、白花蛇舌草等中药组成的复方制剂 ,
具有清热利喉 、散结止痛 、祛痰止咳的功效 。临床用
于急慢性咽喉炎及上呼吸道感染 , 有良好的疗
效[ 2] 。靛玉红为复方瓜子金中的重要成分之一 ,其
不溶于水 ,微溶于乙醇 。水煎煮靛玉红难以提取出
来 ,用 60%酒精提取 。当回收酒精后 ,靛玉红则大
量沉淀。我们采用大孔吸附树脂技术 ,分离纯化
60%酒精提取液中的靛玉红 ,取得满意效果 ,纯化倍
数为 9.2 。
1　仪器与试药
1.1　仪器
Waters公司 600E 型泵 ,Waters 486UV/Vis检
测器;大连依利特科学仪器有限公司 ECHrom98色
谱工作站;7725i进样阀(20μL);TGL-16G高速离
心机;SZ-93自动双重纯水蒸馏器 ,上海亚荣生化
仪器厂;KQ-50型超声波清洗器 ,昆明市淀山湖检
测仪器厂。12-1大孔吸附树脂 ,市场上购买 ,由本
实验室重新编号 。
1.2　试剂与试药
甲醇 、甲酸为分析纯 ,水为重蒸水 ,乙醇为药用
级 。靛玉对照品购自中国药品生物制品检定所 。瓜
子金 、大青叶 、紫花地丁 、野菊花 、海金沙由市场购
买 ,由江中药业公司质检部门鉴定 。
2　实验方法及结果
2.1　大孔吸附树脂处理
大孔吸附树脂 12-1 用药用酒精浸泡数天 ,装
柱后用药用酒精洗至流出液与水 1∶1混合不产生混
浊 ,改用大量水洗 ,水浸泡备用。
2.2　大孔吸附树脂再生
用 95%酒精洗脱至流出液无色 ,用大量水洗去
酒精 ,即可 。再生树脂可用于相同植物成分的提取
分离 。如树脂颜色变深 ,可用稀酸和稀碱溶液洗涤 ,
最后洗至洗出液呈中性 ,即可重复使用 。
2.3　检测方法
根据研究要求 , 本文靛玉红含量测定采用
HPLC 法。HPLC 法直接测定复方瓜子金醇提液中
靛玉红的含量另文发表 。
2.4　吸附量的测定
2.4.1　实验方法　取经过 60%乙醇处理的 12-1
树脂 10 mL 加入 60%乙醇复方瓜子金提取液样品
100 mL ,搅拌 ,每隔 1小时取样品 1 mL ,共取 10个
样。用 HPLC 法按上述色谱条件测定取样的峰面
积 ,根据靛玉红的线性关系计算得到取样的浓度。
另取 10 mL 同样的 12-1树脂烘干至恒重称重得
3.14 g , Qt=(Co-Ct)×V/ W ,式中:Qt为吸附量
(mg/g), Co 为起始浓度(mg/ml), Ct 为剩余浓度
(mg/ml), V 为溶液体积(ml), W 为树脂重量(g)。
求出吸附量 Q 。作出吸附树脂对靛玉红的吸附动
力学曲线 。结果见表 1。
·48·
江西中医学 院学报 2 0 0 5 年 2 月第 1 7 卷第 1期
JOURNAL OF JIANGXI UNI VERSITY OF TCM 2005 Vol.17 No.1
　
○中药现代化○
表 1　靛玉红的吸附量测定结果
时间/h 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h
浓度/mg·ml-1 1.54×10-2 1.23×10-2 9.25×10-3 7.31×10-3 6.62×10-3 6.11×10-3 5.78×10-3 4.86×10-3 4.76×10-3 4.03×10-3
吸附量/ mg·g-1 0 9.82×10-2 1.95×10-1 2.56×10-1 2.78×10-1 2.94×10-1 3.05×10-1 3.34×10-1 3.38×10-1 3.61×10-1
2.4.2　样品中靛玉红吸附动力学曲线的绘制　根
据上面测定的样品中靛玉红的浓度计算出吸附量
Q 。以吸附量 Q 对时间 T 作图 ,得到 12-1 树脂对
靛玉红的吸附动力学曲线 ,见图 1 。
图 1　12-1 树脂对靛玉红的吸附动力学曲线
　　从 12-1树脂对靛玉红的吸附动力学曲线可以
看出 ,12-1树脂在 3小时已趋饱和 。
2.5　60%乙醇复方瓜子金的提取液对 12-1树脂
的穿透实验
2.5.1　实验条件　柱高 38 cm ,直径 1.5 cm ,流速
2.1 ml/min。
2.5.2　实验方法　用经过 60%乙醇处理的 12-1
树脂装入柱中 ,柱高 38 cm ,然后用 60%的复方瓜子
金醇提液过柱 ,每上样 50 mL 取样一次 ,按上述色
谱方法用 HPLC 法测定浓度 。得到靛玉红的穿透
曲线 ,利用穿透曲线图可计算出上样量。穿透曲线
如图 2 。结果见表 2。
表 2　复方瓜子金醇提液对 12-1 树脂的穿透实验结果
上样量/ml 200 300 400 450 600 700 800
浓度/ mg·ml-1 0.022×10-2 0.066×10-2 0.162×10-2 0.246×10-2 0.574×10-2 0.839×10-2 1.067×10-2
图 2　靛玉红穿透曲线
2.5.3　吸附率　根据靛玉红对大孔树脂的穿透曲
线可计算 , 在上样量为 300 mL 时的吸附率为
95.7%。
2.5.4　上样量　根据靛玉红的穿透曲线计算可得
到上样量为 5个柱体积(335 mL)为最佳 。
2.6　12-1树脂对 60%乙醇复方瓜子金的提取液
的动态吸附实验
2.6.1　实验方法　取 5个柱体积的 60%乙醇复方
瓜子金的提取液以 2.1 mL/min 的流速上柱 ,过完
柱后 ,用 1个柱体积的 60%乙醇过柱清洗。然后用
90%乙醇洗脱得洗脱液 ,测量洗脱液的体积 V 。取
少量洗脱液经处理 ,以高效液相法测定其靛玉红的
浓度 C。另取少量 60%乙醇复方瓜子金的提取液
用高效液相法测定其浓度为 A 。把洗脱液置水浴
把乙醇蒸发后 ,在 105 ℃的烘箱中烘2小时得固体 ,
称固体重量 G 。另取同样 5个柱体积的 60%乙醇
复方瓜子金的提取液水浴蒸干乙醇后 ,在 105 ℃的
烘箱中烘 2小时得固体 ,固体称重 W 。
2.6.2　洗脱曲线实验 　上样后 ,用 90%的乙醇洗
脱 ,每洗脱一个柱体积(67 mL)时收集一个样品 ,按
上述色谱条件用高效液相色谱法测定各样品的浓
度 ,以浓度对洗脱量作图 ,得到用 90%乙醇洗脱 ,复
方瓜子金中靛玉红对 12-1树脂的洗脱曲线 。结果
见表 3 。
表 3　复方瓜子金中靛玉红对 12-1树脂的洗脱实验结果
洗脱液体积 /ml 134 201 268 335 405.5
洗脱液浓度/mg·ml-1 3.127 ×10-2 1.008 ×10-2 0.360 ×10-2 0.096 ×10-2 0.049 ×10-2
　　根据上表作出 90%乙醇对靛玉红的洗脱曲线
图。如图 3 。
图 3　靛玉红的洗脱曲线
2.6.3　洗脱率的测定　根据靛玉红的洗脱曲线图
计算可得出在洗脱了 5个柱体积(335 mL)时靛玉
红对 90%的乙醇 的解吸率。计算 解吸率为
89.01%。
2.6.4　纯化倍数　按上述色谱条件(下转第 67页)
·49·
董岿等:大孔吸附树脂分离纯化复方瓜子金中的靛玉红
　
○中药现代化○
DNA。
(3)通过染料的电荷来解释:甲基绿电离后 ,在
5价氮处产生 2个正电荷 ,碱性较强 ,因此容易和细
胞核(等电点 pH3.8 ～ 4.2)进行极性吸着;派洛宁电
离后会产生 1个正电荷 ,碱性较甲基绿弱 ,所以和细
胞浆(等电点 pH4.6 ～ 5.2)结合 。
3.2　诊断性应用　在实验室里 ,对一些来自器官移
植病人的标本(肝 、胃活检)用 HE染色 ,对浆细胞在
形态学上虽然容易认识 ,但要识别嗜派洛宁性单核
细胞(免疫母细胞),如果不用甲基绿-派洛宁染色 ,
则较难。目前用免疫的方法可以标记 ,但价格相对
昂贵。鉴于这种细胞在器官移植组织中出现的重要
性(是排异反应发生的一种重要指标),因此 ,用本法
可靠地显示这些细胞是非常重要的。
甲基绿-派洛宁染色 ,在淋巴结反应性增生 、淋
巴瘤的应用上 ,及中医药对机体免疫功能影响方面 ,
可以反映一些情况 ,具有一定的意义。在判断肿瘤
细胞有无凋亡方面 ,也是一个很好的指标[ 2] 。
3.3　注意事项　甲基绿-派洛宁染色 ,根据各人经
验中对不同方法的实践 ,看法很不一致 ,总的说来有
固定液的选用 、染料的挑选 、染色液的配制 、分化和
脱水剂的选用等几个方面。甲醛固定的材料(特别
是固定时间超过 1周的组织),染色结果不是出现偏
蓝或偏红 ,就是出现非特异性嗜派洛宁性染色 。
我们认为 Carnoy 氏液或中性缓冲福尔马林液
固定可获得好的结果 。一般的甲醛液 ,只要固定时
间不超过 2天 ,也可获得较好的效果 。
染料的质量 ,特别是派洛宁 G 的质量 ,实际上
是最重要的一环。各种方法中介绍 Grubler , Egurr
及G T Gurr染料的质量为佳。但不管怎样 ,获得染
料样品后 ,必须用已知阳性材料进行 。有时染色效
果不良 ,并不一定是染料本身的质量问题 ,除了严格
的固定外 ,可能对方法的采用 、染料的配制 、染色后
的分化和脱水剂的使用等也有很大关系 。有的甲基
绿-派洛宁染色液配方加有苯酚 ,可能作为一种促染
剂来应用 ,但比例最好不要超过 1%;有的加有甘
油 ,可能是防止染液因蒸发而改变浓度 ,这对滴染切
片是有帮助的;有的加酒精 ,可能毫无意义;有人注
意到派洛宁通过脱水 、分化而被大量地抽提掉 ,故有
采用甲基绿和派洛宁分开进行染色的。
染色后的分化剂和脱水剂的使用很重要 ,水洗
可以去除甲基绿颜色 ,丙酮可去除部分派洛宁的颜
色 ,乙醇可去除大多数颜色 ,异丙醇也未显优点 ,而
用丙酮分化和脱水比较适合 ,既可分化掉切片背景
上的甲基绿 ,又可尽量地减少对派洛宁的褪色 ,这一
步须严格掌握好 ,是获得满意结果的关键。
我们认为 , 要获得好的甲基绿-派洛宁染色效
果 ,必须要考虑以下几点:
(1)固定液的选用:Carnoy 氏液中性缓冲福尔
马林液;(2)派洛宁的选用:要选用不含初级胺的染
料(派洛宁 Y或 G均可);(3)染色液的 pH值:醋酸-
醋酸钠缓冲液(pH4.8)是恰当的 ,过酸甲基绿染色
效果差 ,过碱则派洛宁染色效果不良。
参考文献
[ 1] 龚志锦,詹 洲.病理组织制片和染色技术[ M] .上海:上海科
学技术出版社 , 1994.298
[ 2] 姜泊 ,张亚历 , 周殿元.分子生物学常用实验方法[ M] .北京:人
民军医出版社 , 1996.172
(收稿日期:2004-07-13)
(上接第 49页)测定洗脱液中靛玉红的峰面积 ,根据
靛玉红的线性关系得到洗脱液中靛玉红的浓度为
0.008 65 mg/mL。洗脱液体积为 685 mL。得到靛
玉红的重量为 5.924 mg 。把洗脱液水浴蒸干乙醇
后 ,放烘箱中在 105 度下干燥 2小时得固体 0.5 g 。
所以每克重洗脱液固体中含靛玉红的重量为
11.849 mg 。取 335 mL 的 60%乙醇的复方瓜子金
提取液水浴蒸干乙醇后 ,在烘箱中 105 度下干燥 2
小时得固体重量 4.0 g ,原样品按上述色谱条件测定
靛玉红的峰面积 ,据靛玉红的线性关系得到原样品
中靛玉红的浓度为 0.015 4 mg/mL。所以 335 mL
原样品中靛玉红重量为 5.148 54 mg 。所以每克原
样品固体中含靛玉红的量为 1.287 mg 。所以纯化
倍数:11.849/1.287=9.2 。
2.6.5　固体得率　根据上面纯化倍数数据 ,洗脱液
固体重量为0.5 g ,原样品固体重量为 4.0 g ,所以得
固体得率:(0.5÷4.0)×100%=12.5%。
3　讨论
中药复方制剂成分复杂 ,有效成分的提取纯化
较难 。靛玉红是复方瓜子金中的主要成分之一。本
实验采用大孔吸附树脂技术 ,对复方瓜子金的质量
进行精制 ,考察了靛玉红在 12-1树脂上的吸附量 、
吸附及解吸行为 。确定用 12-1树脂进行分离纯化 ,
用 90%乙醇进行洗脱 ,上样量和洗脱量均为 5BV 。
在该纯化条件下 ,靛玉红吸附率高 ,能有效地分离杂
质 ,靛玉红纯化倍数达 10倍左右 。
参考文献
[ 1] 马振山.大孔吸附树脂在药学领域中的研究应用[ J] .中成药 ,
1997 , 19(12):40
(收稿日期:2004-09-24)
·67·
胡敏:显示细胞 DNA
和 RNA的甲基绿-派洛宁技术的改进
　
○实验研究○