全 文 ：收稿日期:2004 - 12 - 03;修回日期:2005 - 08 - 25
基金项目:四川省科技厅应用基础研究资助项目(02GY029011)
联系人简介:梁渠(1959 -),男 ,副教授 ,主要从事有机及高分子教学和科研。 Em ai l:LiangQ@ cdu .t edu. cn
文章编号:1004 - 1656(2005)06 - 0737 - 04
麻风树种子中毒蛋白的提取分离
梁　渠 ,闫书一 ,李　瑜 ,陈康生 ,何文琼 ,何丽丽
(成都理工大学材料与化学化工学院 ,四川　成都　610059)
摘　要:研究了从麻风树种子中提取毒蛋白的过程。在冰水浴中用缓冲溶液在不同的 pH值范围内对麻风树
种子毒蛋白进行粗提 ,得到最高的提取率为 98. 2%。以改性聚丙烯酰胺与甲苯二异氰酸酯等进行混合发泡
合成功能泡沫塑料。然后用合成的功能泡塑作为填料 , 用柱层析法对蛋白质进行分离 , 具有较好的分离效
果。对分离得到的麻风树毒蛋白毒性进行检测 ,实验证明其有良好的杀虫杀菌效果。
关键词:麻风树;毒蛋白;功能泡沫塑料
中图分类号:0658. 9　　　　文献标识码:A
近来的研究发现麻风树乳中含有一种生物碱
具有抗癌作用。其种子[ 1] (含水 6.2%, 蛋白质
18.0%,油脂 38.0%, 碳水化合物 17.0%, 纤维
15.50%,灰份 5.30%)除可榨油制生态柴油[ 2] 、肥
皂等外 ,还可以提取毒蛋白制杀虫剂及杀菌剂。
麻风树种子是有毒的 ,其含毒成分主要是种
子毒蛋白。 Stirpe在 1976年对 curcin(泄果素 ,麻
风树种子毒蛋白 )进行了部分分离 ,并认为它与 ri-
cin(蓖麻毒蛋白 )和 crotin(巴豆毒蛋白 )毒性相
似 ,也具有抑制真核细胞无细胞系统蛋白质合成
的作用 [ 3] 。黄德如在 1991年对厦门麻风树种子
中的 curcin进行了进一步分离纯化并对其相关性
质进行了初步研究[ 5] 。 Ba rbie ri在 1993年阐述
curcin属单链核糖体失活蛋白 [ 6] 。从种子中提取
毒蛋白通常分为两步:一是粗蛋白的提取 (通常为
混合蛋白);二是粗蛋白的分离纯化。粗蛋白提取
一般的工艺周期较长 ,毒蛋白容易变性。粗蛋白
的分离纯化常用葡聚糖凝胶法 、琼脂糖凝胶法等 ,
这些方法操作成本较高。
本文自行合成的功能聚氨酯泡塑(俗称海绵)
是一种可重复利用的高聚物 。它空隙率高 ,比表
面大 ,内外孔相通 ,且分子主链上含有大量的亲水
基 ( -NHCO - 、 -O - ),故水易向泡塑内渗透 ,具
有良好的流体力学性能。聚氨酯泡塑具有与蛋白
质相似的结构 ,而且原料易得 、价廉。为了使该功
能泡塑对混合蛋白质具有分离功能 ,将聚丙烯酰
胺用乙二胺进行处理后(胺交换 )再与合成聚氨酯
的原料共混发泡聚合 ,聚合产物再经胺化便得到
具有分离功能的泡塑。本文用自行合成的功能聚
氨酯泡塑把毒蛋白从混合蛋白中分离出来 ,取得
了很好的分离效果 ,具有一定的应用推广价值。
1　实验部分
1.1　主要药品与仪器
磷酸二氢钠 、磷酸氢二钠 、丙酮 、巯基乙醇 、聚
丙烯酰胺 、标准牛血清蛋白 、溶菌酶 、茚三酮(均为
为分析纯 );聚醚树脂 330、硅油 、二月桂酸丁二锡 、
三乙烯二胺 、 2, 4 -甲苯二异氰酸酯 (均为化学
纯)。实验所用药品均由成都沪泰化学试剂科学
仪器有限公司提供。
康式振荡仪;紫外光谱仪 (GENESYSTM 10 Se-
ries);红外光谱仪;灭菌锅(WX280B)。
1.3　蛋白质的提取
将新鲜的麻风树种子经去皮 、研磨后 ,用索氏
抽提器 ,溶剂用丙酮脱去其油脂部分 。将去了油
脂的种仁加入磷酸盐的缓冲溶液 (并加入少量的
巯基乙醇 ,以防止蛋白质变性 ),然后置于康式振
荡仪中振荡 6h,抽提得到蛋白质提取液 (全过程在
冰水中进行),用茚三酮进行定性检测 。取抽提液
样品稀释至适当的倍数 ,用生理盐水作基准 ,再用
紫外光谱仪测出 280nm处的吸光度 ,求出提取率 。
1.4　功能泡塑合成
1.4.1　合成操作　将一定量的聚丙烯酰胺与稍
737第 17卷　　　　　　　　　　　　　　　　化 学 研 究 与 应 用
微过量的乙二胺混合 , 加热搅拌溶解成稠糊状 ,
60℃保温反应 3 h ,然后水浴旋转蒸发掉未作用的
乙二胺 ,得到改性聚丙烯酰胺。
称取一定量改性聚丙烯酰胺 ,用溶剂溶解 ,然
后按比例分别加入水 、聚醚多元醇 、二丁基二月桂
酸锡 、三乙烯二胺和稳定剂硅油 ,用搅拌器搅拌 ,
使之混合均匀 ,再加入甲苯二异氰酸酯 ,并强烈进
行搅拌 ,使之能很快混合均匀 ,当看到有气泡产生
立刻停止搅动 ,使之在室温 (20℃ ～ 25℃)发泡固
化成型 ,再置于烘箱中熟化 4h。
将制成的泡沫塑料粉碎至微粒状 ,用量筒量
取一定量的微粒泡沫塑料 ,置于有塞子的磨口锥
形瓶中 ,加入适量的甲醇作溶胀剂 ,在振荡器上溶
胀 4h ～ 5 h。然后加入一定量的乙二胺 , 反应在
30℃的恒温振荡仪中进行 ,反应 24h。反应结束
后 ,抽滤 ,并用水多次冲洗除去残余的胺化剂 ,即
得到改性树脂。
1.4.2红外测定　将 1克经过胺化处理的功能泡
塑经真空干燥 8h后 ,用 KB r压片法做红外光谱 ,
得到图谱。
1.5柱层析分离蛋白质
1.5.1标准混合蛋白质分离　称取牛血清蛋白
0.1g、溶菌酶 0.2g, 溶解在 50mL、 pH =6.8的
0.05mol L - 1磷酸盐缓冲溶液中。将功能泡塑剪
成细块 ,用干法装柱法将功能泡沫塑料填充到一
支 (10mm ×500mm)层析柱中 ,用空白缓冲液平衡
1 h,流速控制在 5mL m in- 1。将配制好的标准蛋
白质混合溶液吸取 2.5mL上柱 ,然后用 pH =6.8
的 0.05mol L - 1的磷酸盐缓冲溶液洗脱 ,用试管
每 5m in接收一次洗脱液。接收的洗脱液在紫外
分光光度计上 280nm处检测其吸光度。
1.5.2从麻风树种子的蛋白提取液中分离毒蛋白
　操作与 1.5.1相同。
1.6毒性测试
1.6.1　杀虫性能测试　分别将新鲜青菜叶和枯
黄的青菜叶几片切成小块 ,置到毒蛋白溶液中浸
泡 15h后 ,取出放于烧杯中 ,将菜青虫放入菜叶
上;作为对比 ,在另一烧杯中放入未浸泡的新鲜青
菜叶 ,观察其死亡情况。
1.6.2　杀菌性能测试
杀菌消毒:将所要用的烧杯 、玻璃棒 、培养皿 、
接种针等在高压灭菌锅消毒(0.15兆帕 )2h。
制牛肉蛋白胨培养基:其配方为 (牛肉膏
0.3g,蛋白胨 1g, NaC I 0.5g,琼脂 2g,水 100mL, pH
=7.4 ～ 7.6),将其放入烧杯中于电热炉上加热熬
制 ,趁热将培养基溶液分别倒入两个已准备好的
培养皿中 ,然后将其放入无菌箱中进行紫外杀菌
消毒 30m in。
接种:待牛肉蛋白胨培养基固定成型后开始
接种 。用接种针挑取少量大肠杆菌菌种于两个培
养基的正中间 ,标号为 1、2。然后在 2号培养皿的
中间滴几滴毒蛋白提取液 。
培养:将培养皿放入培养箱中 。恒温 37℃,培
养 24h。
2　结果与讨论
2.1　蛋白质的提取
实验结果见表 1。
表 1　蛋白质提取的配料比及其提取率
Tab. 1 The ex tractan t p ropo rtion and ex trac tion ra te o f pro tein
项 目编 号
缓冲溶液
(m o l /L)
pH
值
缓冲液体积
(mL)
抽滤液体积 V
(mL)
稀释倍率
N
紫外吸光度
A(nm)
抽提率
(%)
1 0.02 7. 2 60 41 25 0.138 13.26
2 0.02 7. 2 80 75 25 1.700 11.95
3 0.02 7. 2 100 82 25 2.135 16.41
4 0.02 7. 2 120 113 25 1.657 17.49
5 0.05 7. 2 60 43 25 2.494 9.75
6 0.05 7. 2 80 78 25 1.917 14.02
7 0.05 7. 2 100 92 25 1.635 14.10
8 0.05 7. 2 120 112 25 1.417 14.87
9 0.02 6 8 60 45 25 0.143 15.08
10 0.02 6 8 80 59 25 2.180 12.06
11 0.02 6 8 100 92 25 2.049 17.67
12 0.02 6 8 120 112 25 1.024 1075
13 0.05 6 8 60 48 25 0.118 13.28
14 0.05 6 8 80 59 25 2.251 12.45
15 0.05 6 8 100 95 25 1.227 10.93
16 0.05 6 8 120 114 25 0.923 9.86
注:每次实验所用种仁量均为 2. 0克。为防止毒蛋白变性 ,实验均在冰水浴进行 , 且每次实验均加入 2. 0mL巯基乙醇。
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表 1中的抽提率是用如下公式 [ 4]计算的:
抽提率 =〔(0.75A N V×0.001) /2.0〕×100%
以上公式计算的值实际上是指从每克 (或每
100克 )种仁中提取出的蛋白质的百分率 。从表 1
中的数据可知 , 编号为 11的配料比的抽提率最
高 ,因此可定为最佳配料比。此外 ,若根据 [ 1]麻风
树种子中所含蛋白质总量为 18.0%,则在本实验
最佳配料比条件下可得到蛋白质最高提取率为:
蛋白质最高提取率 =(17.67 /18.0)×100%=98.2%
2.2功能泡塑的合成
根据条件选择实验 , 得到最佳配料用量见
表 2。
表 2　泡塑合成配料比
Tab. 2 Th em aterial p roport ion for syn thesizing polyu rethane foam
配料 聚醚 TDI PAGE 丙酮 TEDA DBTDL硅油 水
份数(g) 100 150 25 20 0. 6 0. 4 1 0. 1
注:TDI—甲苯二异氰酸酯 , PAGE—胺化聚丙烯酰胺 ,
TEDA—三乙烯二胺 , DBTDL—二月桂酸二丁基
从泡塑的红外光谱图可以看出一些特征吸收
(见表 3)。
表 3　红外光谱图特征吸收峰
Tab. 3 IR Ch aracteristic peak s of th e polyu rethane foam
泡塑的红外光谱特征吸收(cm - 1) 基团的可能归属
3386.00 N -H伸缩振动
1654.04, 1605. 28 -CO -伸缩振动
2971.17, 2927. 88 烃基的 C -H伸缩振动
1102.45 -O -键
1224.19, 2870. 16 — C— N键
从表 3中可以看出 ,该树脂上具有胺基 、羰
基 、醚键等基团 。这是树脂对蛋白质产生吸附的
结构基础。
2.2　柱层析分离蛋白质
2.2.1　柱层析分离标准混合蛋白质　实验结果
如图 1所示 。
图 1　柱层析分离标准混合蛋白质
F ig. 1　Separa ting the standard m ixed pro teins by
the co lum n ch rom a tog raphy
从图中可知功能泡塑对标准蛋白质具有分离
能力。
2.2.2麻风树种子中的毒蛋白分离　实验结果如
图 2所示。
从图 1和图 2可知:功能泡塑分离出 3种蛋
白 ,证明合成的功能泡塑对麻风树蛋白具有分离
能力 。从杀虫及杀菌实验证明流出液体积为 75
mL ～ 150mL收集的蛋白有毒。从文献 [ 5]可知麻
风树种子中确有三种蛋白质 ,其分子量约为 9800、
28000、36000道尔顿 ,等电点的 pH值依次为 8.1、
8.8和 8.8。功能泡塑对混合蛋白提取液的分离
作用机理可推测如下:功能聚氨酯泡塑骨架中具
有许多亲水基 ,内外泡孔在缓冲洗脱液中能很好
地溶剂化而充分溶胀 ,流体 (溶有蛋白质 )可在内
外泡孔中渗透并产生有效的吸附 ,这种吸附作用
可能是蛋白质链中每个结构单元的酰胺键与功能
聚氨酯泡塑骨架中的酰胺键产生偶极作用。虽然
每个单元作用力很小 ,但蛋白质和聚氨酯泡塑均
属高分子 ,故相互作用的单元有成百上千个 ,累计
效应便会产生很强的吸附作用。蛋白质的分子量
越大 ,则作用单元越多 ,蛋白质与聚氨酯泡塑的吸
附作用就越大 ,在柱子中停留的时间越长 ,随洗脱
液淋出柱子就越滞后。而分子量小的蛋白质则在
柱子中停留时间短而先出柱子。为了使蛋白质不
会因为吸附作用太强而难以洗脱下来 ,对聚氨酯
泡塑进行胺化处理后 ,在 pH =6.8的缓冲溶液中 ,
部分电离而带正电;此时蛋白质的末端氨基或肽
链中少量的碱性基团也带正电 ,同性电性的相斥
作用可部分减弱蛋白质与聚氨酯泡塑的吸附
作用 。
图 2　柱层析分离从麻风树种子中抽提的毒蛋白
F ig. 2　Separating the po isonou s pro te ins from the seed
o f Ja tropha by the co lum n ch rom a tog raphy
2.3　毒性测试
2.3.1　杀虫性能测试　麻风树的种子油也是有
毒的 [ 7] ,口服麻风树油对大鼠的半致死剂量 LD50
为 6mL /kg,而麻风树油的毒性是由于种子中少量
毒蛋白进入油中引起的 。将分离得到的毒蛋白进
行定性毒性实验 ,结果见表 4。
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表 4　毒蛋白杀虫性能的测试
Tab. 4　The insec t proper ty o f po isonous pro teins
类 型条 件 新鲜菜叶(未浸药)新鲜菜叶(浸药)
菜青虫数 6条 6条
2h后 1只菜青虫死亡 4只菜青虫死亡
12h后 同上 5只菜青虫死亡
22h后 同上 同上
死亡率 16. 7% 83. 3%
从表中可知麻风树种中的毒蛋白具有较高的
杀虫能力。
2.3.2　杀菌性能测试　5h后对实验中的两个培
养皿进行观察 ,发现 1号培养皿 (未滴入提取蛋白
液)中出现直径约为 1cm 的白斑 (为生长的菌
斑);2号培养皿 (滴有提取蛋白液 )中也出现白
斑;直径大约为 1号的一半 。 24h后观察的现象:1
号培养皿中整个长满了菌斑 ,而且很密集;2号培
养皿中的菌斑很稀疏 。将 1、2号培养皿中的细菌
分别进行制片 ,并用结果晶紫染色 ,在显微镜下观
察到弯曲成杆状的大肠杆菌。通过实验证明抽提
出的毒蛋白具有一定的杀菌(大肠杆菌 )能力 。
参考文献:
[ 1] 林娟 , 周选围。麻疯树植物资源研究概况 [ J] .热带亚
热带植物学报 , 2004, 12(3):286— 290.
[ 2] Gaydou, V ege tab le ene rgy source[ J] . O leagineux, 1982,
37(3):135 - 141.
[ 3] S tirpe　F. B ilchem J, 1976, 156(1):1 -6.
[ 4] 周先碗 , 胡晓倩. 生物化学仪器分析与实验技术 , 北
京:科学出版社 , 1998:118 -121.
[ 5] 黄德如 , 黄东宏. 麻风树毒素的分离及其某些性质
[ J] . 生物化学与生物物理进展 , 1991, 18(2):149
- 151.
[ 6] Ba rbieri, Ribosom e L. inactiva ting pro te ins from plants
[ J] . B iochim B ilphys. Acta. 1993, 1154:237 -282.
[ 7] 孙备. 麻风树提取物可引起大鼠贫血 [ J] . 国外医学中
医中药分册 , 1998, 20(5):41.
Study on extracting the poisonous prote in
from the seed of Jatropha
Qu liang, Shu yi - yan, Yu li, K ang sheng - chen,Wen qiong - he, Li li - he
(ChengDu University of Techno logy, Chengdu　610059, China)
Abstrac t:The process of extracting the po isonous p ro te in from the seed o f Ja trophaw as studied. In o rder to avo id dena turation o f the
poisonous prote in, the expe rim ent was carried out under the cond ition o f icew ater and pro tec tion by thioe thano l, w ith the diffe rent
concentra tions of cush ioning so lu tion and the various pH values. The highest ex tracting propo rtion was a tta ined(98%). The func-
tional po ly ethe r po lyu re thane foam w as synthe sized bym ix ing the po lyacry lam ide and to luene 2, 4 - diisocyana te, e tc. The po isonous
prote in w as separated from them ixed prote ins by u sing the syn thetic func tiona l foam and the good separa ting resultw as achieved. A t
last the tox ic ity o f po isonou s pro te in w as te sted. The re su lt indicated tha t it had good p rope rty o f insec ticide and ste rilization.
K ey words:Jatropha;po isonous pro tein;the func tiona l foam
(责任编辑　李　方 )
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