全 文 ：※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.13 79
流动注射化学发光法测定飞龙掌血多糖清除
羟自由基的能力
田春莲1，康炼常2，王 鹏1，龚竹琼3
(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；
3.张家界市产商品质量监督检验所，湖南 张家界 427000)
摘 要：研究飞龙掌血多糖对羟自由基(·OH)的清除作用，以评价其抗氧化活性。以VC、茶多酚(TP)为阳性对照，
采用流动注射化学发光法通过测定飞龙掌血多糖与鲁米诺-H2O2体系反应后的发光强度来评价飞龙掌血多糖对·OH
的清除能力；考察不同质量浓度、时间、光照及加热处理等因素对·OH清除率的影响程度。结果表明：TP作为一种
强抗氧化剂清除·OH的能力明显强于飞龙掌血多糖和VC。在0.1～500μg/mL质量浓度范围内，飞龙掌血多糖对·OH
的清除能力与其质量浓度呈正相关，在质量浓度为500μg/mL时，对·OH清除率高达94%；强光照射116h后，VC
对·OH的清除率明显下降，飞龙掌血多糖稳定性较好。因此，飞龙掌血是一种良好的天然抗氧化剂来源。
关键词：飞龙掌血多糖；流动注射化学发光法；·OH；清除率
Determination of Hydroxyl Radical Scavenging Capacity of Polysaccharides from Roots of Toddalia asiatica
by Flow Injection Chemiluminescence Method
TIAN Chun-lian1，KANG Lian-chang2，WANG Peng1，GONG Zhu-qiong3
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China；
2. College of Chemical Technology, Huaqiao University, Xiamen 361021, China；3. Zhangjiajie Institute of Product Quality
Supervision and Inspection, Zhangjiajie 427000, China)
Abstract：The hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Toddalia asiatica roots was investigated by flow
injection chemiluminescence method and the effects of polysaccharide concentration, time, light and heat treatment on this
antioxidant activity were studied. Vitamin C and tea polyphenol (TP) were used as positive controls. The results showed that
the hydroxyl radical scavenging activity of TP as a potent antioxidant was significantly higher than that of Toddalia asiatica
polysaccharides and VC. The hydroxyl radical scavenging activity of of Toddalia asiatica polysaccharides showed a positive
concentration dependence over the range of 0.1 to 500 μg/mL and the scavenging rate at 500 μg/mL was as high as 94%. The
scavenging activity of VC was reduced substantially when exposed to strong light while Toddalia asiatica polysaccharides had
good light stability. Our results indicate that Toddalia asiatica is a promising natural source of antioxidants.
Key words：Toddalia asiatica polysaccharides；flow injection chemiluminescence method；hydroxy radical；
scavenging rate
中图分类号：Q946.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)13-0079-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201313017
收稿日期：2012-04-02
基金项目：湖南省高校科技创新团队支持计划资助项目(湘教通(2010) 212号)；湖南省科技计划资助项目(2010TP4007-1)
作者简介：田春莲(1970—)，女，副教授，硕士，研究方向为资源植物保护与利用。E-mail：tianchunlian1970@163.com
飞龙掌血(Todda l ia a s ia t i ca (L . )Lam)为芸香科
(Rutacea)飞龙掌血属木质藤本植物，又名簕钩、三百棒
等。主产湖南、四川、贵州等地。具有散瘀止血，祛风
除湿，消肿解毒等功效[1]。
近年来，对飞龙掌血化学成分的研究，多见于香豆素
类、生物碱、挥发油成分、三萜类化合物及多糖的报道[2-5]。
大量的药理和临床研究发现，多糖在清除自由基、增强免
疫、抗病毒、抗辐射等方面都有一定的作用[6]。活性氧自
由基是一些处于激发态的含氧基团。在正常情况下，体
内自由基的产生和清除是平衡的，一旦失衡就会导致细
胞损伤，引起心脏病、癌症和衰老等严重疾病[7]。羟自由
基(·OH)作为已知活性氧中对生物体毒性最强的一种自
由基，与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有很大关
系，·OH清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标[8]，
80 2013, Vol.34, No.13 食品科学 ※基础研究
目前检测方法有：电子自旋共振法、电化学法、毛细管
电泳法、荧光法等[9-10]，均存在仪器昂贵、操作复杂，检
测方法缺乏专一性或灵敏度低等缺点。而化学发光分
析具有灵敏度高(检出限常达10-12～10-18mol)，线性范
围宽(3～6个数量级)，分析速度快以及仪器设备简单、
便宜等优点 [11]，常用于抗氧化剂的筛选。因此，本实
验采用鲁米诺-H2O2-FeSO4发光体系，探讨飞龙掌血多
糖清除自由基活性，为深度开发飞龙掌血资源提供理
论依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
飞龙掌血(Toddalia asiatica(L.)Lam)于2009年采于
张家界，采集后经吉首大学城乡资源与规划学院廖博
儒研究员鉴定，取其根洗净，60℃烘干，粉碎，过40
目筛，干燥保存备用。
鲁米诺(纯度＞98%) 苏州工业园区亚科化学试剂
有限公司；茶多酚(纯度98%) 安徽红星药业有限责任
公司；VC、FeSO4·7H2O、30% H2O2、无水Na2CO3、
NaHCO3、无水乙醇(均为分析纯) 长沙明瑞化学试剂有
限公司。
IFFM-E型流动注射化学发光分析仪 西安瑞迈分
析仪器有限责任公司；LRH-250-GS人工气候箱 广东
省医疗器械厂；KQ-250E型超声波清洗器 昆山市超声
仪器有限公司；HH-6电子恒温水浴锅 苏州威尔实验
用品有限公司；DF-42鼓风干燥箱 日本Yamato公司；
AEL-200电子天平 日本岛津公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水
式真空泵 巩义市子华仪器有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 飞龙掌血粗多糖的提取
参照文献[5]中的多糖提取方法，称取一定量的飞龙掌
血粉末，按料水比为1:20(m/V)，在60℃条件下浸提2h，过
滤，浓缩，加乙醇，沉淀，烘干得粗多糖。
1.2.2 鲁米诺溶液的配制
参照文献[12]并改进：称取7.42g无水Na2CO3，加
700mL蒸馏水配成0.1mol/L的Na2CO3溶液，同时称取
2.52g NaHCO3，加300mL蒸馏水配成0.1mol/L NaHCO3
溶液，按照Na2CO3、NaHCO3体积比为7:3的比例加入
17.7mg鲁米诺，配成0.1mmol/L的鲁米诺溶液1000mL，
放置待用。Fenton·OH产生体系的配制[13]：称取0.0139g
FeSO4·7H2O，配成0.2mmol/L储备液，实验时稀释为
4×10-8mol/L；量取22.5mL 30%的H2O2于250mL的容量
瓶内，配成3% H2O2储备液，实验时稀释成0.15%。将
4×10-8mol/L的FeSO4溶液与0.15%的H2O2按体积比1:1的
比例混合，即产生·OH的体系。
1.2.3 飞龙掌血多糖清除·OH能力的测定
1.2.3.1 流动注射化学发光体系的建立
流动注射化学发光法主要用于·OH清除作用的测定[14]。
副蠕动泵将分别载流Fenton ·OH产生体系试剂和pH 10.28
的碳酸盐缓冲溶液(含0.1mmol/L的鲁米诺)输入分析系统。
待基线稳定后，主蠕动泵分别将飞龙掌血多糖、VC、茶
多酚(TP)溶液注入载流中，与其混合。按图1和表1的参数
进行流动注射化学发光分析，以500V、50Hz，扩增1倍信
号值条件，进行20次/s不自动归零数据采集[15]。
FV
HV
PC
PMT
W
R1 P1
P2
R2
R3
R1.测试样品；R2. ·OH体系；R3.碳酸盐缓冲溶液；P1.主
蠕动泵；P2.副蠕动泵；V.三通汇合；F.流通池；PMT.
光电倍增管；HV.负高压；PC.电脑控制；W.废液。
图 1 流动注射化学发光系统示意图
Fig.1 Schematic diagram of the fl ow injection chemiluminescence
system
表 1 流动注射化学发光仪运行程序参数
Table 1 Working parameters of the fl ow injection chemiluminescence
system
步号 泵运行时间/s
主泵速率/
(r/min)
副泵速率/
(r/min)
重复
次数 阀位
数据
读取
主泵
方向
副泵
方向 跳转
1 5 20 30 1 L Y F B 2
2 5 10 30 1 R Y F B 3
5 15 5 20 6 L Y F B 1
1.2.3.2 飞龙掌血多糖对·OH清除能力的测定
飞龙掌血多糖不同质量浓度对·OH清除能力的影
响：称取0.025g飞龙掌血粗多糖，加适量蒸馏水进行溶
解，抽滤装置真空泵滤去残渣，取滤液定容至50mL，质
量浓度为500μg/mL，用蒸馏水稀释成0.1、1、6、10、
100、500μg/mL不同的质量浓度，测定·OH的清除率。
光照对抗氧化剂稳定性的影响：分别配制100μg/mL
的飞龙掌血多糖、VC、TP溶液，在其他存放条件相同条
件下，分别放置在室内自然光、避光及132W的光照环境
中，然后分别在放置30、45、55、93、103、116、126、
142h后取出，测定·OH的清除率。
加热对·OH清除率的影响：配制100μg/mL的飞龙掌
血多糖溶液、VC溶液、TP溶液100℃水浴加热，以未处
理组为100%，定时测定其清除·OH的能力，并计算相对
清除率。
Ⳍᇍ⏙䰸⥛/% = h100
⛁໘⧚ৢḋકᇍgOHⱘ⏙䰸⥛
᳾໘⧚ḋકᇍgOHⱘ⏙䰸⥛
(1)
·OH清除率的测定及计算：运用1.2.3.1节建立的流
动注射化学发光体系，测定飞龙掌血多糖、VC、TP经各
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.13 81
种处理后的发光强度，取发光强度平均值进行计算。以
鲁米诺-H2O2-FeSO4-蒸馏水发光体系的发光强度为空白，
计算出加入不同质量浓度的飞龙掌血多糖、VC、TP后清
除·OH的能力。
⏙䰸⥛/%= h100
Fa－Fb
Fa
(2)
式中：Fa为鲁米诺-H2O2-FeSO4-蒸馏水的发光强度/cd；
Fb为鲁米诺-H2O2-FeSO4-样品的发光强度/cd。
2 结果与分析
2.1 飞龙掌血多糖质量浓度对清除·OH能力的影响
亲啭ᥠ㸔໮㊪
ᡫണ㸔䝌
㤊໮䜮
100
80
60
40
20
0
1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
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a
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ᡫണ㸔䝌
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80
60
40
20
0
1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
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b
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80
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1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
⏙
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⥛
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c
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㤊໮䜮
100
110
80
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60
70
40
20
30
50
10
0
1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
⏙
䰸
⥛
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d
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㤊໮䜮
100
80
60
40
20
0
1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
⏙
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e
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90
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40
20
30
50
10
0
1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
⏙
䰸
⥛
/%
lgρ
f
a～f.放置时间分别为0、6、12、18、24、48h。
图 2 不同质量浓度飞龙掌血多糖对清除·OH能力的影响
Fig.2 Effect of polysaccharide concentration and storage time on the
hydroxyl radical scavenging activity of Toddalia asiatica polysaccharides
由图2可知，在0.1～500μg/mL质量浓度范围内，
飞龙掌血多糖、VC、TP对·OH的清除率均与质量浓度
呈剂量关系，当飞龙掌血多糖质量浓度达到500μg/mL
时，清除率高达94%。飞龙掌血多糖、VC、TP的半数
抑制质量浓度(IC50)值依次为5.69、2.19、0.745μg/mL。
所得结论与文献[16]相似，但IC50值比紫外分光光度法
测定的(飞龙掌血多糖328.8μg/mL、VC 22μg/mL、TP
5μg/mL)均低，可能由于原材料中多糖类物质相互的协
同或拮抗作用，使得不同测定方法中样品液的极性不
同，也说明流动注射化学发光法灵敏度高于紫外分光
光度法。依次为通过对将不同质量浓度的飞龙掌血多
糖分别放置0、6、12、18、24、48h后评价清除·OH
的能力，以VC、TP为对照。放置时间对飞龙掌血多糖
清除·OH的影响程度较小。但飞龙掌血多糖和VC在质
量浓度为0.1～1μg/mL时，短时间内清除·OH的能力较
弱，而TP对·OH的清除能力随质量浓度的升高、放置
时间的延长明显上升。
2.2 光照对抗氧化剂稳定性的影响
亲啭ᥠ㸔໮㊪
ᡫണ㸔䝌
㤊໮䜮
100
80
90
60
50
70
40
20 40 60 80 100 120 140 160
⏙
䰸
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ᯊ䯈/h
a
82 2013, Vol.34, No.13 食品科学 ※基础研究
亲啭ᥠ㸔໮㊪
ᡫണ㸔䝌
㤊໮䜮
100
90
95
80
75
85
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20 40 60 80 100 120 140 160
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b
亲啭ᥠ㸔໮㊪
ᡫണ㸔䝌
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100
60
80
20
0
40
20 40 60 80 100 120 140 160
⏙
䰸
⥛
/%
ᯊ䯈/h
c
a.自然光照射；b.避光；c. 132W光照射。
图 3 光照条件对不同质量浓度飞龙掌血多糖清除·OH能力的影响
Fig.3 Effect of illumination time on the the hydroxyl radical
scavenging activity of Toddalia asiatica polysaccharides
飞龙掌血多糖作为抗氧化剂对·OH清除效果较稳
定。由图3可知，VC不耐光，经132W光照射116h后·OH
清除率明显下降，到至142h后为13.18%；而飞龙掌血多
糖和TP的抗氧化性相对稳定，在不同的光照类型和持续
一定时间后对·OH的清除率变化不明显。
2.3 加热对抗氧化剂稳定性的影响
亲啭ᥠ㸔໮㊪ᡫണ㸔䝌 㤊໮䜮
100
98
97
96
99
94
93
95
920 2 4 6 8 10
⏙
䰸
⥛
/%
ࡴ⛁ᯊ䯈/h
图 4 加热条件对不同质量浓度飞龙掌血多糖清除·OH能力的影响
Fig.4 Effect of heating on the hydroxyl radical scavenging activity of
Toddalia asiatica polysaccharides
飞龙掌血多糖、VC、TP这3种物质热稳定性均较强，
在加热条件下，对·OH的清除率相对稳定，结果见图4。
相对而言，VC的耐热性较弱，在加热到7h后，对·OH的
清除率开始下降，9h后清除率减弱程度较为明显。
3 结 论
3.1 飞龙掌血多糖对·OH的半清除率IC50虽大于VC、
TP，但光稳定性较VC强，热稳定性强于VC、TP，抗氧
化剂耐热性能的大小直接决定抗氧化剂的使用范围和使
用效果，尤其对于天然抗氧化剂而言，其耐热性能更具
有重要性，因为其可能会在某一温度以上活性降低甚至
失活，从而失去其功能效用，因此，飞龙掌血多糖可开
发成良好的天然抗氧化剂。
3.2 作为外源性抗氧化剂，多糖在生物体内的作用机理
可能是直接清除O2－·和·OH等诱发的自由基，如SOD、
过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等[17]。多糖类物质在
体外和体内都具有较强的抗氧化活性，不同的多糖类化
合物对不同体系的抗氧化作用可能不同，对不同自由基
存在一定的选择性[18-20]。对·OH的清除能力可能与多糖
含有大量·OH有关[21]。飞龙掌血多糖经加热煮沸后，其
对·OH的清除率反而上升，可能是多糖分解，增加了游
离羟基的数量，增强了清除效果。
3.3 选择0.1μg/mL为飞龙掌血多糖清除·OH的起始质
量浓度，说明流动注射化学发光法的高灵敏度，此外，
流动注射化学发光法测定快速、操作简单、重现性好，
因此流动注射化学发光法测定飞龙掌血多糖清除超氧阴
离子能力的研究有待进一步研究。
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