全 文 ：浙 江
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农 业 大 学 学 报 。 ( ; ) : 3。一 4 6 . ; 。 , 3
Ag r ie u l t u r a e U n i v e r s i t a t i s Z h e ji
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杭州郊区油青菜上一个车前草
花叶病毒的分离物 `
盛方镜 陆关成 李德葆
`浙江农业大学植物保护系 )
提 要
1 9 7 7年底 , 于杭州郊区四季青公社青春大队油青菜花叶病株上分 离到一个病毒浓度高、 传染力强的 31 号分离
物 . 特别是接种大白菜 , 叶片上出现大块灰白色不规则坏死区 . 接种农特 40 号、 黄苗榆 、 三生烟、 三十八号烟 ,
造成系统蚀纹斑和蚀纹点刻坏 死 . 在心叶烟 、 白兰烟 、 曼陀罗 、 辣椒、 就豆上引起接种叶局部坏死斑 , 在览色蔡
上引起局部黄斑 . 接种千日红 , 起初在接种叶上产生坏死斑 , 以后发展成系统花叶 。 不侵染番茄、 四 季豆 . 分离
物稀释终点 1 .0 一 105 , 致死温度 95 ’ C , 体外保毒期2 个月 . 电镜检查为密集排列整齐的棒 状 粒 子 , 制 备得到具
有一定效价的抗血清 . 因此 , 初步认为 31 号分离物为车前草花叶病毒株系之一
近年来十字花科作物病毒病日趋严重 , 杭州郊区引起大 白菜灰斑和坏死 , 叶片僵硬而不
能食用 ; 油青菜生长亦受到严重影响 。本文对侵染油青菜的 31 号分离物进行研究 , 结果如下 。
一 、 材料与方法
( 一 ) 毒源 31 号分离物 , 采 自严重矮化 、 畸形 、 叶肉增厚的油青菜病株 。
所用的鉴别寄主为十字花科 、 茄科 、 豆科 、 觉科 、 黎科等 28 种 植 物 , 均在防虫温室培
育 , 接种苗龄 3一 5叶期 , 分离物在青菜 、 大 白菜等十字花科作物上繁殖 , 并定期接种至心叶
烟或曼陀罗 、 大白菜 , 观察特异性坏死斑情况 , 保证毒源纯净 。
按常规方法测定离体稳定性 , 用枯斑反应的心叶烟 、 曼陀罗 、 菊作测定寄主 。
传染性接种试验 , 汁液摩擦接种按常规方法 。 土传试验 , 分别直播和移栽健白菜苗于病
土中 , 或采病株周围土壤加水 1 : 1 ( 体积之比 ) 浸渍后接种心叶烟 , 测定土中遗留病株的传
染性 。 蚜虫接种传播试验 , 用萝 卜蚜 、 桃蚜 。
初提汁液电镜检查 , 取具 白色坏死典型病状的白菜叶片 50 克 , 经 冰冻 , 加 O . 6M磷酸缓
冲液 ( p H 6 . 8 ) 10 0毫升 , 捣碎弃渣 , 上清液经 20 %氯仿处理 , 1 0 0 0 0印 m 离心 15 分钟 , 沉淀
洗涤后取上清 , 由复旦大学电镜室镜检 , 同时用沾附法检查 。
为了解大白菜感染 31 号分离物后不同部位病毒的分布 , 于开花期分别采用同病株的单个
花瓣 、 雄蕊 、 雌蕊和须根 、 茎髓的组织 , 研磨后用半叶法接种于心叶烟 , 统计病斑数 , 比较
测定病毒相对浓度 。
本文于 1 98 2年 7月 24 日收到 。
份 承复旦大学生物系进行 电镜观察 , 特此致谢 .
浙 江 农 业 大 学 学 报 9卷
( 二 ) 抗血清制备及杭血清反应
. ]抗原制备 : 取病状明显的白菜叶片 4 0 0克 , 冰冻 , 剪碎加 O . I M · p H 7 . 2磷酸缓冲液 4 0 0毫
升 , 在匀浆器 中捣碎
静止分层后 , 取上层奔集蠢氛镖增息孺黑黯髻笙氰翼黔黔舅笙竺蘸甲E G 分子鼻6 。。“ ’ , 2%氯化琳 于遨军冲终州之_待户E G轨分溶解后 , 离心 ` 2” “ ”印 m
1小时 , 弃上清 , 沉淀悬浮在 7毫升生理盐水中 , 然后低速离心 8 0 0 0印 m s分钟 , 除去不溶物 。
上清液为粗提纯的病毒 , 用作免疫原注射 。
2
或用 O
抗血清制备 : 提纯抗原 1毫升加福氏不完全佐剂 1毫升 ,
2毫升病毒汁液注射脚趾 ( 以上抗原为注射 1只兔子量
乳化后注射于家兔后腿肌 肉 ,
往射完后的第三周放血 。所得抗血清加 0
散测定抗血清效价 。
。
0 2 %叠氮钠 , 低温保存 。
每周 1次 , 连续 3次 。在第 3次
用试管沉淀反应和琼脂双扩
3
·血清反应 : 取待测植物叶片5克 , 加 .0 IM p H 7 · 2磷酸缓冲液 10 毫升 , 研磨后低速离心
Z o OQr p o 15 分钟 , 弃沉淀后加 4%聚乙二醇 , 2 %氯化钠在 4℃下待完全 溶~解后 …, 4 0 00r p m 离
心 15 分钟 , 取沉淀 、 _ · 洗涤一次 , 把沉淀溶于 .0 5毫升磷酸缓冲液中 , 即为待测抗原 。
二 、 结 果
( 一 ) 奋主反应 31 号分离物在 Z a种植物上的反应见表 1。
表 1 31 号分离物的寄主 范围和病状反应
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甜 菜
二 本地油莱
胜不吐油菜
大叶芥 菜
大 白 菜
甘 蓝
油 青 菜
本 刀 豆
辣 椒
芡 色 黎
昆诺阿冀
曼 陀 罗
石 竹
千 日 红
番 茄
假酸浆 (大千生 )
J合 叶 烟
三 生 烟
黄苗榆烟
白 兰 烟
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不侵染 `
花 叶
花 叶
褪绿斑驳 , 叶脉红、 花叶 、 皱缩
叶片大块不规则白色坏死 , 花叶
隐 症
花 叶
不侵染 。
局部褐黑色斑
局部黄一褐斑
褪绿黄斑
局部枯斑
褪绿斑驳
局部枯斑一系统花叶
不侵染 .
花 叶
局部枯斑
蚀纹花叶
蚀纹花叶
蚀纹花叶 , 高温时坏死 .
1 期 盛方镜等 杭州郊区油青菜上一个车前草花叶病毒的分离物
续上表
名一一一思甲一植物名称农特 4 0 烟3 8 号 烟
黄 烟
矮 牵 牛
北京饭 豆
四 季 豆
证 豆
萝 卜
病 状
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, 蚀纹花叶
一 褪绿黄斑
一 蚀 纹花叶
花 叶
接种叶紫斑
不侵染 ’
按种叶枯斑
阶 症
, 经回接心叶烟证明时号分离物不能侵染 .
( 二 ) 离体稳定性测定 致死温度在 95 ℃ 以上 ,稀释终点为 : O书一 1 0 “ ,体 外保毒期 2 个月
( 三 ) 蚜虫传播试验 用萝 卜蚜 、 桃蚜接种不能传毒 。
( 四 ) 土壤传播为害 遗留于土壤的残根 、 残叶 , 传播胜很强 。 在约 1O尺 “ 自勺病土中移
栽大白菜 14 株 , 有 10 株呈现病状 。 回接至大白菜 , 造成坏死 、 花升 ; }司接至心叶烟 , 造成局
部坏死 。 重复数次 , 得类似结果 。 病土浸溃液用常规法摩擦接种心 !叶烟 、 曼陀罗 、 黎 , 均能
引起局部坏死斑 。
( 五 ) 大白菜病株各器官病毒的分布最 采病株各器官 ,用手指分 别挤压 , 直接接种于心
叶烟叶片 。每器官均重复 3次 , 即 3个半叶 , 统计半叶平均枯斑数 ,结果如 下: 单个花瓣 5 1 . 5个 ,
单个雄蕊 58 个 ,单个雌蕊 2 4 . 4个 ,大小约 o . sc m “的叶片组织 9 4个 。 用茎髓 、 根磨汁液接种的结
果显示 , 茎髓含病毒量较多 , 以根部稍少 。 由此说 明病株各器官所含有的病毒浓度是很高的 。
( 六 ) 电镜观察 此病毒颗粒为杆状 , 分布 极为稠 密 , 排列整齐 。 ( 图飞一 2 )
图 1 显示 密集状病毒拉 子
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图 2 显示杆状病毒拉子
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4 2 浙 江 农 』 大 学 学 报 8 巷
( 七 ) 杭血清效价
1
. 试管沉淀反应 : 如表 2
3 1 # 抗血清的效价
T a b ]e 2 T h e t i t r e
表 2 * 翁
o f a n t is e r um t o N o
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3 1 is o la t e
( 试管沉淀反应 )
( T e s t t u b e p er e i p it a t e t e s t )
抗 血 清 稀 释 倍 数
1 0 X 2 0 X 4 0 X 8 0 X 16 0 X 3 2 0 X 64 0 X 1 28 0 K 2 5 6 0 X 5 6 2 0 X 10 2 4 0 X
、
十 十十 + 十 十 十 + + 十 + + 十 十 十 十 + } 十 十 +
+ + + + + 十 十 + + + 十 + + + 十 + + …十 + +
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一X一巨
所用抗原为大白菜病株粗提抗原 , 稀释 5倍 。 结果说明抗血清效价可达 1 2 8 0一 2 56 0 。
2
. 琼脂双扩散反应 , 如表 3 。
表 3 3 1 # 杭血 清的效价 ( 琼脂双扩散反应 )
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一 ’一 ’ ““ ” ’ 一 ’ ” .丁一 抗 血 清 稀 释 倍 数放 血 时 间二
3 2 QX 6 4 0 X 12 8 0 X
+十++十++十3 周
4 周
+ +
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+ 十
+ +
+ +
十 +
+ +
周
周7一匕
注 , . 1 + + 反应明显 十阳性反应
, 指住射完到放血的时间 .
抗原稀释 4倍 ( 大 白菜病株 )
士反应不明显 , 阴性反应
琼脂浓度 1%抗血清效价约方弓的倍 ,比试誉沉旋反应低了许
多 。 在注射抗原后的第三周 , 即可得一定效价的负血清 , 并长时间地保特稳定 。
三 、 讨 论
根据表 1资料 , 结合电镜观察 , 认为 31 号分离物属 T M v 组 , 但对十字花科植物有很强烈
的侵染力 , 能引起大白菜叶片大块坏死 ( 图版 3一日 ) 。 侵染千 日红 , 引起接种叶局部枯斑 ,
后转变为系统坏死和花叶症状 , 侵染普通烟引起不规则坏死蚀纹和花叶 ( 图版 7一 9 ) 。 但不
侵染四季豆 、 本刀豆和番茄 , 这些都和典型 T M V 株不同 ,而更相似于烟草花叶病毒组的车前
草花叶病毒 。 所不同的是 , 典型车前草花叶病毒可侵染番茄 , 并可 引起果实 “ 乌心 ” , 而 31 号
1 期 盛方镜等 杭 州郊区油青菜上一个车前草花叶病毒的分离物 4 3
奋
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图 3 大白 菜大块坏死斑 图 4 大 白菜大块坏死叶脉仍绿 色
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扮 图 5 大白莱小块坏死 , 叶 面皱 缩不平
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浙 江 农 业 大 学 学 报 9 卷
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分离 物 不 能 侵 染 番 茄 。 这 些 都 类 似 于
周家炽 ( 1 9 6 2 ) 、 裴美云 ( 1 9 6 2 ) 所报导的
来自油菜的 Y M V 、 5 。 O s h i m a ( 1 9 7 5 )认为 ,
Y M V
、 。 显然和车前草株系极为 相 似 。 郁操
国等 ( 1 9 8 0) 根据病毒质粒大小 、 亚基分子量 、
紫外吸收光谱 、 核酸碱基克分子百分比和寄
主反应等认为 , 上海郊区侵染油青菜的病毒
属长叶车前草花叶病毒的一个新分离物 。 结
合上述材料 , 我们初步认为 31 号分离物属于
车前草花叶病毒的一个新分离物 。
魏景超 ( 1 9 5 9 ) 、 周家炽 ( 19 6 2 ) 、 李
德葆 ( 1 96 4 ) 、 王拱辰 ( 19 7 5 ) 等 , 均把侵染
十字花科 , 在心 叶 烟 上 引 起 枯 斑 归属于
T M V
, 惜未作进一步分析比较 ,这些分离物
可能都和 31 号相似 , 属于车前草花叶病毒 ,
也许是不同株系 。
在所采集 18 个大 白菜病株中 , 类似于上述 31 号的 1 4个 , 占总数的 7 % 。 在 1 9 7 7一 1 9 8 1年
所鉴定的 1 81 个 十字花科作物 ( 油菜 、 大 白菜 、 黄芽菜 、 萝 卜等 ) 病株中 ,此类病毒达 31 个 ,
为总数的 1 7 一 % 。 与李德葆 ( 1 9 6 4 ) 、 王拱辰 ( 1 9 7 5 ) 报导相 比 , 比重 显著增加 。 从所采病
株田间症状分析 , 这些分离物多来 自病状严重的病株 , 其致病性远远超过芜蓄花叶病毒 , 黄
瓜花叶病毒 。 长叶车前草花叶病毒对十字花科作物的为害 , 值得注意 。
盛方镜等 杭州郊区油青菜上一个车前草花叶病毒的分离物
参 考 文 献
〕周 家炽 : 1 9 6 2, 关于油菜花叶病毒的类型 , 微生物学报 , 8 ( 4 ) : 41 4一 41 了 .
」裴美云 : 1 9 6 2 , 从不 同植物上来 的几个烟草花叶病毒分离物的初步比较研究 , 微生物学报 , 8 ( 4 ) : 4 2。一4 2 8 .
」李德葆 : 19 6 4 , 萝 卜花叶的病毒类群和复合侵染 的研究初报 , 植物保护学报 , 3 ( 2 ) : 1 5 一 16 4 .
〕李德葆 : 1 9 6 4 , 浙江油菜花叶病毒类型初报 , 植物保护学报 , 3 ( 2 ) : 19 8 .
〕王拱辰 : 1 9 7 8 , 浙江油菜花叶病毒类型研究 , 微生物学报 , 18 ( 4 ) : 39 8一 3 09 .
〕复旦大学生物系: 1 9 8 。 , 蔬菜病毒研究 , 侵染青菜的烟草花叶病毒群 , 上海农业科技 。 N o . 3 : 28 .
」郁操国 、 王鸣岐 、 孙玉昆 : 1 9 80 , 病毒集刊 , 工 , 29 一 1 35 .
〕 O s h i o a : 10 7 5 , R i b g r a s s m o s a i e v i r u s . i n D e s c r i P t io n o f p l a n t v i r u s e s , N o . 1 5 2 .
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4 6浙 江 农 业 大 学 学 报 9卷
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D a t u r a s t r a m o n i u m
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l e s i o n s o n t h e i n o e u l a t e d l e a v e s
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