全 文 ：收稿日期:2013-06-05 接受日期:2013-11-06
基金项目:兰州市社会发展科技计划(2012-1-57)
* 通讯作者 Tel:86-931-8765459;E-mail:jm@ gszy． edu． cn
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:2054-2057
文章编号:1001-6880(2014)12-2054-04
藏药熏倒牛提取物的抑菌杀虫活性研究
张艳霞1，2，景 明1，2
*
，王晶晶1，李 炀1，张银川3
1甘肃中医学院;2 甘肃省中药药理学与毒理学重点实验室，兰州 730000;3 定西市妇幼保健院，定西 742000
摘 要:为了探讨藏药熏倒牛乙醇提取物不同极性溶剂萃取部位的抑菌杀虫活性，将熏倒牛乙醇提取物依次用
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得各萃取部位及水余液部位通过抑菌圈法测定抑菌活性部位，对活性部位采
用二倍稀释法测定最低抑菌浓度，采用改良任氏法测定杀灭滴虫活性部位及最低有效杀虫浓度。结果表明熏
倒牛乙醇提取物的乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌有强抑制作用，最低抑菌浓度
为 0． 125 mg /mL，对变形杆菌、粪肠球菌和白色念珠菌的抑制作用也比较强，最低抑菌浓度为 0． 25 mg /mL。石
油醚部位和乙酸乙酯部位对阴道滴虫有明显抑制作用，最低有效杀虫浓度分别为 0． 5、0． 25 mg /mL。说明熏倒
牛乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位有较强的抑菌杀虫作用，是熏倒牛的抑菌杀虫活性部位。
关键词:熏倒牛;活性部位;抑菌杀虫
中图分类号:Ｒ962 文献标识码:A
Study on the Anti-bacterial and Anthelminthic effects of
Biebersteinia heterostemon Maxim
ZHANG Yan-xia1，2，JING Ming1，2* ，WANG Jing-jing1，LI Yang1，ZHAGN Yin-chuan3
1Gansu College of Traditional Chinese Medicine;2 The Key Laboratory of Traditional Chinese
Medicine Pharmacology and Toxicology，Lanzhou 730000，China;3 Dingxi Hospital of Maternal and Child Health，Dingxi 742000，China
Abstract:The aim of this study was to investigate the anti-bacterial and anthelminthic effects of different fractions of eth-
anol extract of Biebersteinia heterostemon Maxim． The B． heterostemon sample was firstly extracted by ethanol． The ethanol
extract was then fractionated using petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol sequentially． The anti-bacterial effects of
different extracts of B． heterostemon were tested using the bacteriostatic cycle method． The minimal inhibitory concentra-
tions (MICs)were determined by double dilution method． The modified Ｒen’s method was used to determine the active
fraction with anthelminthic effect and its respective minimal effective concentration (MEC)． The results showed that the
ethyl acetate fraction of B． heterostemon ethanol extract had strong inhibitory effect on Staphylococcus aureus，Pseudo-
monas aeruginosa and Enterobacter cloacae，with MIC of 0． 125 mg /mL． Its inhibitory effect on Bacillus proteus，Entero-
coccus faecalis and Blastomyces albicans were also strong with MIC of 0． 25 mg /mL． Both petroleum ether fraction and
ethyl acetate fraction had obviously inhibitory effect on Trichomonas vaginalis with MICs of 0． 5 mg /mL and 0． 25 mg /
mL，respectively． Based on these experimental results，it was concluded that the ethyl acetate fraction of B． heterostemon
ethanol extract had strong anti-bacterial and anthelminthic effects．
Key words:Biebersteinia heterostemon Maxim;active fraction;anti-bacterial and anthelminthic
藏药熏倒牛(Biebersteinia heterostemon Maxim)
是一种常用的藏药，为蔷薇纲牻牛儿苗亚纲熏倒牛
科熏倒牛属植物，主要分布于甘肃、宁夏及四川，生
于海拔 1000 ～ 3200 m 的山坡、河滩地和杂草坡
地［1，2］。本品味辛、苦，性寒。具有清热解毒，散肿
止痛，清血热，祛风毒之功效。用于治疗各种炎症、
结核症、丹毒、疟疾、咽喉肿痛等。有报道采用平板
法对熏倒牛水提浸膏进行了体外抑菌试验，但对熏
倒牛不同极性溶剂提取部位抑菌杀虫活性的研究尚
未见报道。笔者采用极性萃取法将熏倒牛乙醇提取
物分离成不同极性部位，采用抑菌环法及二倍稀释
法测定抑菌杀虫活性部位，并对活性部位的最低抑
菌浓度和最低有效杀虫浓度进行了测试，为藏药熏
倒牛抑菌、抗炎、杀虫作用在临床应用和深入研究提
DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.12.031
供参考。
1 材料与仪器
1． 1 试药
藏药熏倒牛药材于 2009 年 8 月采自甘肃省天
祝藏族自治县华藏寺镇，经甘肃农业大学农学院陈
垣教授鉴定为熏倒牛科植物 B． heterostemon 的干燥
地上部分;营养琼脂(HM，杭州微生物试剂厂);肉
汤培养基(杭州微生物试剂厂);平板菌落计数琼脂
(水解酪蛋白琼脂，杭州微生物试剂厂);改良任氏
液(杭州微生物试剂厂);庆大霉素片(哈药集团制
药总厂);其余试剂均为分析纯。
1． 2 菌种与滴虫
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿
假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌
(Escherichia coli)、变形杆菌(Bacillus proteus)、腐生
葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、阴沟肠杆菌
(Enterobacter cloacae)、粪肠球菌(Enterococcus faeca-
lis)、产气夹膜杆菌(Clostridium perfringens)、淋病奈
瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和白色念珠菌(Blasto-
myces albicans)均由卫生部药品生物制品检定所和
卫生部临床检验中心提供;滴虫采自定西市妇幼保
健院妇科门诊阴道滴虫急性未治患者。
1． 3 仪器
CJ-2S型洁净工作台(天津市泰斯特仪器有限
公司);DHP-9272 电热恒温培养箱(上海一恒科学
仪器有限公司);HＲ/T16M 台式高速冷冻离心机
(湖南赫西仪器装备有限公司);ASV-3023 高压灭
菌器(日本 SAKUＲA公司);纸片(杭州微生物试剂
厂)。
2 方法与结果
2． 1 熏倒牛不同提取部位的制备
取熏倒牛药材粉末，用 95% 乙醇回流提取 3
次，每次 l h，合并提取液，滤过，滤液减压回收溶剂
至无醇味，用蒸馏水稀释(1 ∶ 1，生药 mg /mL)，将稀
释液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取(每
份溶剂与稀释液等体积连续萃取 4 次)，分别得到
石油醚部位(A)、乙酸乙酯部位(B)、正丁醇部位
(C)、水余液部位(D)，分别回收溶剂，备用。临用
前配成所需浓度。
2． 2 熏倒牛不同提取部位的抑菌作用
取各菌分别接种于 MH 琼脂平板培养基中，30
℃培养 14 h，用 MH液体培养基制备菌悬液，菌液浓
度约为 1 × 106cfu /mL，4 ℃冰箱保存(不超过 12 h)。
将熏倒牛各萃取部位的溶液分别灭菌，备用。每张
纸片(直径 6 mm)分别加熏倒牛各萃取部位(50
mg /mL)溶液各 10 μL，每个样品设 3 个平行组，空
白对照(E)为无菌蒸馏水，阳性对照(F)为庆大霉
素溶液。K-B法取浓度为 1 × 106cfu /mL的菌液 0． 2
mL，均匀涂布整块 MH琼脂培养基表面，置室温 3 ～
5 min后贴含药纸片，细菌 30 ℃培养 24 h，真菌 27
℃培养 72 h后观察结果，记录抑菌圈大小来表示抑
菌活性。熏倒牛不同萃取部位的抑菌作用见表 1。
表 1 熏倒牛不同提取部位的抑菌活性(n = 3)
Table 1 The anti-bacterial effects of different fractions of ethanol extract of B． heterostemon(n = 3)
组别
Group
抑菌圈直径
Diameter of bacteriostatic circle (mm)
A B C D EF
浓度 Concentration(mg /mL) 9 6 3 9 6 3 9 6 3 9 6 3 － 0． 02
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 12． 3 9． 4 3． 8 23． 1 9． 4 3． 8 5． 3 2． 7 0． 5 0 0 0 0 25． 8
铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 8． 7 6． 1 2． 4 21． 2 7． 4 2． 4 3． 8 1． 5 0 7． 1 3． 4 1． 2 0 26． 4
大肠杆菌 Escherichia coli 3． 6 2 1． 3 138 4． 2 1． 3 3． 2 1． 2 0 0 0 0 0 20． 9
变形杆菌 Bacillus proteus 5． 3 3． 1 1． 7 19． 2 9． 1 1． 7 1 0． 5 0 0 0 0 0 22． 1
腐生葡萄球菌 Staphylococcus saprophyticus 7． 1 4． 2 2 11． 3 4． 2 2 2． 3 1 0． 5 4． 8 2． 5 1． 3 0 21． 8
阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae 6． 4 2． 7 0． 8 22． 7 11． 7 4． 3 0． 5 0 0 0 0 0 0 18． 3
粪肠球菌 Enterococcus faecalis 10． 3 7． 1 3． 4 18． 6 7． 1 3． 4 5． 1 3． 2 1． 2 5． 2 2． 7 1． 5 0 22． 6
产气夹膜杆菌 Clostridium perfringens 5． 5 3． 1 1． 7 9． 7 4 1． 5 11． 7 4． 9 2． 1 0 0 0 0 19． 7
淋病奈瑟氏菌 Neisseria gonorrhoeae 7． 2 4． 9 2． 1 8． 3 3． 4 1． 2 9． 7 3． 8 2． 3 0 0 0 0 15． 6
白色念珠菌 Blastomyces albicans 8． 2 6． 4 3． 2 18． 3 6． 4 3． 2 4． 4 2． 5 0． 5 0 0 0 0 21． 4
5502Vol. 26 张艳霞等:藏药熏倒牛提取物的抑菌杀虫活性研究
由表 1 可知，熏倒牛乙酸乙酯部位对金黄色葡
萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠
球菌和白色念珠菌有强抑制作用，且随着浓度降低
抑制作用明显降低;熏倒牛石油醚部位和正丁醇部
位对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、阴
沟肠杆菌、粪肠球菌和白色念珠菌抑制作用较弱;熏
倒牛水余液部位对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阴沟
肠杆菌和白色念珠菌没有抑制作用，对铜绿假单胞
菌和粪肠球菌的抑制作用很弱。
2． 3 熏倒牛乙酸乙酯部位 MIC的测定
取乙酸乙酯活性部位适量，采用二倍稀释法［3］
用培养基将药物稀释成不同浓度的供试溶液，分别
加入 0． 1 mL 菌液(0． 5 麦氏比浊度，100 倍稀释)，
将其置于培养箱中，37 ℃培养 18 h后接种于 MH平
板培养过夜，观察结果。未见细菌生长的为 MIC，每
个样品设 3 个平行组，结果以平均值计。熏倒牛乙
酸乙酯提取部位的 MIC见表 2。
表 2 熏倒牛乙酸乙酯提取部位的最低抑菌浓度(n = 3)
Table 2 The MICs of the ethyl acetate fraction of ethanol extract of B． heterostemon(n = 3)
菌种
Tested bacteria
熏倒牛乙酸乙酯提取部位浓度(mg /mL)
Concentration (mg /mL)
8 4 2 1 0． 5 0． 25 0． 125 0． 0625 0． 03125
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus － － － － － － － + +
铜绿假单胞菌
Pseudomonas aeruginosa － － － － － － － + +
变形杆菌
Bacillus proteus － － － － － － ± + +
阴沟肠杆菌
Enterobacter cloacae － － － － － － － + +
粪肠球菌
Enterococcus faecalis － － － － － － ± + +
白色念珠菌
Blastomyces albicans － － － － － － ± + +
注:“-”表示无菌生长;“ +”表示有菌生长;“ ±”表示有少量菌生长。
Note:“-”indicates no bacteria growth;“ +”indicates bacteria growth;“ ±”indicates a small amount of bacteria growth．
表 2 的结果进一步证实了熏倒牛乙酸乙酯提取
部位对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆
菌有强抑制作用，最低抑菌浓度为 0． 125 mg /mL，对
变形杆菌、粪肠球菌和白色念珠菌的抑制作用也比
较强，最低抑菌浓度为 0． 25 mg /mL。
2． 4 抑制滴虫试验
虫种在改良任氏液中以无菌培养传代 1 个多
月，试验时，建立虫株两株，定为 a 株和 b 株，将 a、b
株在试管内培养 48 h，滴虫生长良好，生命力旺盛，
管内培养液中虫密度达到一定数量(2． 3 × 105 ～ 2． 7
× 105 /mm3)后，进行试验。经预试后设定药物浓度
为 10 mg /mL，用所需培养基将各提取部位稀释成浓
度为 0． 5、0． 25 mg /mL，各提取部位的每一浓度设两
支平行管，将各管放入 37 ℃孵箱中继续培养，分别
用药 2、4、8、12、24 h后取出，滴片，镜检，光镜计数，
计算抑虫率。并将滴虫死亡率为 100%及作用 24 h
后达此标准的虫液再转种培养 7 h，观察有无滴虫生
长，一次判断药物对滴虫的作用效果。结果见表 3。
表 3 熏倒牛提取物对阴道滴虫的体外抑制试验结果
Table 3 Anthelminthic effects of different fractions of ethanol extract of B． heterostemon on Trichomonas vaginalis
药物
Sample
虫株
Strain
用药后滴虫死亡率
Mortality rates of Trichomonas vaginalis after medication (%)
2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h
石油醚部位
Petroleum ether fraction a 51 67 84 100 100 +
b 48 65 81 100 100 +
乙酸乙酯部位
Ethyl acetate fraction a 100 100 100 100 100 +
6502 天然产物研究与开发 Vol. 26
b 100 100 100 100 100 +
正丁醇部位
n-butanol fraction a 0 3 10 18 40 +
b 0 2 7 13 27 +
水余液部位
Water residue a 0 5 12 15 34 +
b 0 4 11 16 39 +
表 3 结果显示，熏倒牛石油醚部位和乙酸乙酯
部位对滴虫有明显抑制作用，其杀灭滴虫的最低有
效浓度分别为 0． 5、0． 25 mg /mL。虽然正丁醇部位、
水余液部位对滴虫的抑制作用较弱，但随药物作用
时间的延长滴虫死亡率逐渐升高。
3 讨论
由于抗生素的不合理使用导致了耐药菌株的增
加，降低了现有抗生素的效率。中藏药在预防和控
制细菌性感染疾病方面发挥着积极作用。而且由于
中藏药的特殊性，细菌较少对中药产生耐药，研究和
开发抗菌中藏药对解决耐药菌株的产生和减少抗生
素副作用具有重要意义。
熏倒牛水提浸膏具有解热、镇痛、镇静和解痉作
用，体外抑菌试验表明熏倒牛浸膏对金黄色葡萄球
菌、枯草杆菌、乙型溶血性链球菌、肺炎双球菌有明
显的抑制作用(药物浓度 0． 5 g /mL)，且随浓度增加
抑菌作用加强。对大肠杆菌、伤寒杆菌、富氏痢疾杆
菌、宋内氏痢疾杆菌无抑菌作用［4］，这与熏倒牛醇
提物不同极性溶剂萃取后的水余液部位对金黄色葡
萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌没有抑制作用相吻
合。虽然熏倒牛在民间的药用价值较大，但有关熏
倒牛的抑菌、抗炎研究报道并不多。本研究发现，熏
倒牛乙醇提物的乙酸乙酯部位抑菌杀虫活性最强，
是熏倒牛的抑菌杀虫活性部位，从中寻找熏倒牛抑
菌杀虫活性成分是今后研究的方向。
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