全 文 ：※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.15 81
茶枝柑皮提取物中多糖的分子质量分布及
抗氧化活性
甘伟发1，周 林2，黄庆华1,*，张小英1，源瀚祺1，周子雄1
(1.广东药学院药科学院，广东 广州 510006；2.广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)
摘 要：目的：研究茶枝柑皮提取物中不同乙醇体积分数沉淀多糖的分子质量分布以及其对大鼠嗜铬瘤细胞株
(PC12)氧化损伤的保护作用。方法：采用不同体积分数乙醇分步醇沉的方法提取茶枝柑皮提取物中的多糖，通过分
离纯化、凝胶渗透色谱(GPC)表征多糖分子质量；建立以H2O2诱导细胞氧化损伤模型，测定细胞存活率分析提取物中
各醇沉多糖对细胞氧化损伤的保护作用。结果：分步醇沉多糖分子质量随着乙醇体积分数的增加而减小，乙醇体积分
数分别为50%、70%和90%所得多糖的重均分子质量(Mw)分别为72059、47433u和18743u。粗多糖和透析处理后的多糖
都具有一定的抗氧化活性，但脱色和脱蛋白处理后的多糖基本失去抗氧化活性。结论：茶枝柑皮提取物中多糖的分子
质量分布对抗氧化活性有一定影响；多糖的分子组成(例如含有色素和蛋白质)与抗氧化活性存在密切关系。
关键词：茶枝柑皮提取物；多糖；分子质量分布；抗氧化活性
Molecular Weight Distribution and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Citrus reticulate Chachi Peel Extract
GAN Wei-fa1，ZHOU Lin2，HUANG Qing-hua1,*，ZHANG Xiao-ying1，YUAN Han-qi1，ZHOU Zi-xiong1
(1. College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China；
2. College of Life Science and Bio-pharmaceutical, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)
Abstract：Objective: To explore the molecular weight of polysaccharides from Citrus reticulate Chachi peel extract and the
protective effect of crude and purifi ed polysaccharides against oxidative injury in pheochromocytoma cells (PC12). Methods:
Polysaccharide was extracted from Citrus reticulate Chachi peel by different ethanol concentration gradients. The molecular
weight of purifi ed polysaccharide fractions was measured. The protective effect on PC12 cells was explored with H2O2-
induced cellular oxidative damage model by the survival rate of the cells. Results: Polysaccharides with smaller molecular
weights were obtained by increasing the ethanol concentration and the average molecular weights (Mw) of polysaccharides
obtained at ethanol concentrations of 50%, 70% and 90% were 70259, 47433 u and 18743 u, respectively. Both crude
polysaccharides and purifi ed polysaccharides after dialysis had antioxidant activity. Conclusion: The antioxidant activity of
Citrus reticulate Chachi peel extract shows obvious relationships with the molecular weight distribution of polysaccharides
or the presence of other molecules such as pigment and protein.
Key words：Citrus reticulate chachi peel extract；polysaccharide；molecular weight distribution；antioxidant activity
中图分类号：TQ929.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)15-0081-06
doi:10.7506/spkx1002-6630-201315017
收稿日期：2012-10-30
基金项目：珠海市科技工贸和信息化局企业技术创新项目(珠经贸字(2009)414号)
作者简介：甘伟发(1988—)，男，硕士研究生，研究方向为保健食品开发。E-mail：weifagan@gmail.com
*通信作者：黄庆华(1954—)，女，教授，学士，研究方向为中药保健食品开发与质量控制。E-mail：hqh1003@tom.com
茶枝柑皮是茶枝柑(Citrus reticulate ‘Chachi’)的干燥
成熟果皮，是广东道地药材“广陈皮”的来源，也是国
家卫生部公布的药食两用品种之一。经多抗氧化指标响
应面法优化提取工艺所得的茶枝柑皮提取物中，除了含
有黄酮类成分外，还含有多糖成分[1]。有文献报道了茶枝
柑皮粗多糖的体外抗氧化作用[2]及其中一个经分离纯化多
糖组分的组成分析[3]，但对茶枝柑皮多糖的分子质量分布
及测定未见报道。多糖具有抗衰老、抗氧化等生理活性
作用，并与其结构、相对分子质量等有关[4-5]。临床及实
验证实，与衰老相关的中枢神经退行性疾病如帕金森病
(PD)、阿尔茨默克病的发病机制和自由基密切相关，分
化后的PC12细胞在形态和功能上具有典型神经元特征，
可用于神经元损伤机制相关研究[6-7]。本实验针对茶枝柑
皮提取物中的多糖成分，通过分步醇沉、分离纯化并测
82 2013, Vol.34, No.15 食品科学 ※基础研究
定不同醇沉多糖的分子质量分布，同时考察各醇沉多糖
对PC12细胞H2O2损伤后的保护作用，为进一步明确茶枝
柑皮提取物的有效成分和多糖的生物活性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶枝柑皮2009年采自广东翁源坝仔镇溪水村，由
广东药学院药用植物与中药鉴定学教研室李书渊教授鉴
定，均符合2010版《中国药典》的规定。参照文献[1]方
法，本实验室自制成茶枝柑皮提取物。
DEAE-Sepharose Fast Flow填料、Sephadex G-100
填料 美国GE公司；8000D透析袋 广州市齐云
生物技术有限公司；AB-8型大孔吸附树脂 沧州
宝恩吸附材料科技有限公司；葡聚糖标准品系列(Mw
5200～1482000u) 美国Sigma公司；PC12大鼠嗜铬瘤
细胞 中国科学院细胞库；高糖DMEM液体培养基、
胎牛血清 美国HyClone公司；噻唑蓝(MTT)、二甲
基亚砜(DMSO)、PBS、细胞培养板 美国康龙科技有
限公司；氯化钠、浓硫酸、重蒸苯酚、无水乙醇、正丁
醇、三氯甲烷等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
AY-120电子天平、UV-2500紫外-可见分光光度计
日本Shimadzu公司；R-201旋转蒸发仪 巩义予华仪器
公司；HL-2B恒流泵、BSZ-100自动部分收集器、中低
压层析柱(2.5cm×60cm)、中低压层析柱(1.5cm×100cm)
上海沪西分析仪器厂；GLZ-0.2B冷冻干燥机 上海
浦东冷冻干燥设备有限公司；凝胶渗透色谱(GPC)系统
(Waters 1525 Binary HPLC泵、Waters 717自动进样器、
Waters 2414示差检测器) 美国Waters公司；超净工
作台 苏净集团安泰公司；CO2培养箱 日本Sanyo
公司；倒置相差显微镜 日本Olympus公司；TD3台
式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
ELX800光吸收酶标仪 美国Bio-Tek公司。
1.3 茶枝柑皮提取物中多糖分步醇沉
称取提取物200g，加入2000mL蒸馏水，80℃水浴提取
3h，分别提取3次，提取液抽滤合并，浓缩至100mL左右。
往浓缩液中加入无水乙醇使其乙醇体积分数达到50%，4℃
冰箱中静置保存12h，减压抽滤，收集沉淀并冷冻干燥，得
50%乙醇沉淀[8]。依次将上清液调节乙醇体积分数为70%和
90%，抽滤并将醇沉物收集冷冻干燥及称质量，最后得出3
个分步醇沉粗多糖CCP50、CCP70和CCP90；对醇沉粗多糖
进行透析处理后得多糖D50、D70和D90。
3个分步醇沉粗多糖的质量占所用茶枝柑皮提取物的
质量百分数即为多糖得率。取适量醇沉所得多糖复溶，
以葡萄糖为标准品，以苯酚-硫酸法检测总糖，DNS法测
定还原性糖，总糖和还原性糖之差即为多糖含量。
1.4 提取物中多糖的分离纯化
1.4.1 树脂脱色和Sevag法脱蛋白
将1.3节制备所得3个分步醇沉粗多糖脱去色素[9]和蛋
白质[10]杂质，充分透析、浓缩并冷冻干燥，分别得到3个
分步醇沉纯化多糖CP50、CP70和CP90。
1.4.2 分步醇沉多糖的柱层析分离纯化
称取 1 0 0 m g纯化多糖C P 5 0，加入 5 m L蒸馏水
充分溶解，上样于平衡好的DEAE-Sepha rose Fas t
Flow(2.5cm×60cm)层析柱，以适当浓度的NaCl溶液作为洗
脱溶剂，流速1.0mL/min，每管收集10mL，苯酚-硫酸法检测
洗脱液糖的含量。收集洗脱液，合并、透析和浓缩得到相应
组分。再将上述组分上样于Sephadex G-100(1.5cm×100cm)凝
胶柱进一步纯化，最后得到组分G-1。CP70和CP90多糖同上
方法依次分离纯化分别得到组分G-2和G-3。
1.5 凝胶渗透色谱(GPC)表征
色谱条件：色谱柱为TSK-Gel G5000 PWXL凝胶柱和
TSK-Gel G3000 PWXL凝胶柱(串联)；流动相为0.1mol/L
KH2PO4；流速0.6mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检
测器为Waters 2414示差检测器。
以标准葡聚糖分子质量的对数lgMw对流动相洗脱体积V
作图，得到葡聚糖系列标准品的GPC标准曲线图，运用Breeze
GPC软件对曲线进行回归拟合处理得到葡聚糖标准曲线方
程，再根据样品的流动相洗脱体积计算出其分子质量[11]。
1.6 细胞抗氧化实验
1.6.1 PC12细胞培养与处理
将已复苏PC12细胞于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱
中培养，取对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板，接
种密度1×105个/mL每孔100μL，培养24h后分组实验，共
分为正常组、模型组和不同剂量醇沉多糖组，每组6个复
孔。正常组：细胞不做任何处理正常培养；模型组：细
胞正常培养24h后加入100μmol/L的H2O2单独处理4h；样
品组：细胞加入系列质量浓度分步醇沉多糖样品共同培
养24h后同模型组处理[12-14]。
1.6.2 细胞存活率检测
细胞存活率检测：MTT法。细胞分组处理培养结束
后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h后吸弃上
清，每孔中加入100μL的DMSO以溶解紫色结晶，检测波
长570nm。漩涡振荡数次，在倒置显微镜下观察直到紫色
结晶全部溶解，以空白对照孔为调零孔，全自动酶标仪测
定570nm波长处每孔的光密度。计算细胞存活率[15-16]。
细胞存活率/%＝
OD实验组
OD正常组
×100
2 结果与分析
2.1 分步醇沉实验结果
提取物中粗多糖分步醇沉的得率和多糖含量测定结
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.15 83
果见图1，水提后，用低体积分数乙醇醇沉处理时所得粗
多糖的杂质较多，而用高体积分数乙醇醇沉处理所得粗
多糖含杂质较少。
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
50 60 70 80 90
໮
㊪
ᕫ
⥛
/%
໮
㊪
৿
䞣
/%
Э䝛ԧ⿃ߚ᭄/%
໮㊪৿䞣 ໮㊪ᕫ⥛
图 1 分步醇沉所得多糖的得率和含量
Fig.1 Result of stepwise ethanol precipitation
2.2 柱层析分离纯化结果
对3种分步醇沉的多糖CP50、CP70和CP90在DEAE-
Sepharose Fast Flow的离子交换作用分离过程中，首先采
用蒸馏水对其中的中性多糖组分进行洗脱。苯酚-硫酸法
的检测结果发现3种分步醇沉的多糖中均不含中性多糖组
分，说明上述3个样品中主要含有酸性多糖组分，可能连
有糖醛酸[3,17]。然后使用适当浓度的NaCl溶液对其酸性多
糖进行洗脱，结果见图2～4，CP50和CP70的主峰均出现
在40～50管处，但前者的主峰较高。CP90则只检测到单
一主峰，比CP50和CP70少一个小峰。CP90需要较高浓度
的NaCl水溶液洗脱说明其多糖分子中酸性基团比CP50和
CP70多，吸附力较强。
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 25 50 75 100
ㅵ᭄
A 4
90
nm
图 2 CP50组分DEAE-Sepharose Fast Flow 0.08mol/L NaCl洗脱曲线
Fig.2 Elution curve of CP50 on DEAE-Sepharose Fast Flow with
0.08 mol/L NaCl
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 20 40 60 80
ㅵ᭄
A 4
90
nm
图 3 CP70组分DEAE-Sepharose Fast Flow 0.08mol/L NaCl洗脱曲线
Fig.3 Elution curve of CP70 on DEAE-Sepharose Fast Flow with
0.08 mol/L NaCl
0.8
1.2
1.6
2.0
0.4
0.0
0 20 40 60 80
ㅵ᭄
A 4
90
nm
图 4 CP90组分DEAE-Sepharose Fast Flow 0.12mol/L NaCl洗脱曲线
Fig.4 Elution curve of CP90 on DEAE-Sepharose Fast Flow with
0.12 mol/L NaCl
收集上述主峰组分再通过Sephadex G-100柱层析纯
化，蒸馏水洗脱检测结果见图5～7，经Sephadex G-100柱
层析纯化后脱去部分色素等杂质，3个组分只有单一凝胶
洗脱峰，纯度较高。收集洗脱液、浓缩并冷冻干燥即分
别得到纯化多糖G-1、G-2和G-3。
1.0
1.5
2.0
2.5
0.5
0.0
0 10 20 30
ㅵ᭄
A 4
90
nm
G-1
图 5 CP50主峰组分Sephadex G-100洗脱曲线
Fig.5 Elution curve of main component in CP50 on Sephadex G-100
0.4
0.6
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50
ㅵ᭄
A 4
90
nm
G-2
图 6 CP70主峰组分Sephadex G-100洗脱曲线
Fig.6 Elution curve of main component in CP70 on Sephadex G-100
1.0
1.5
2.0
0.5
0.0
0 10 20 30
ㅵ᭄
A 4
90
nm
G-3
图 7 CP90主峰组分Sephadex G-100洗脱曲线
Fig.7 Elution curve of main component in CP90 on Sephadex G-100
84 2013, Vol.34, No.15 食品科学 ※基础研究
2.3 不同乙醇体积分数醇沉多糖分子质量分布
1
0
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
74
25
4u
ᯊ䯈/min
m
V
图 8 G-1组分高效凝胶渗透色谱图
Fig.8 GPC chromatogram of G-1
0.4
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
39
50
8u
ᯊ䯈/min
m
V
图9 G-2组分高效凝胶渗透色谱图
Fig.9 GPC chromatogram of G-2
2
1
0
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
17
55
8u
ᯊ䯈/min
m
V
图 10 G-3组分高效凝胶渗透色谱图
Fig.10 GPC chromatogram of G-3
通过GPC以标准葡聚糖分子质量对数对洗脱体积进行
回归，得到标准葡聚糖校正曲线方程lgMw=18.6－3.09V＋
2.53V2－0.19V3(r =0.9997)，式中：V为洗脱体积/mL。
由上述校正曲线求得多糖G-1、G-2、G-3的GPC数据
见表1。
表 1 纯化多糖G-1、G-2与G-3组分GPC分析结果
Table 1 GPC data of G-1, G-2 and G-3
纯化多糖样品 乙醇体积分数/% Mn/u Mw/u Mp/u Mw/Mn
G-1 50 58953 72059 74254 1.2
G-2 70 35125 47433 39508 1.4
G-3 90 16131 18743 17558 1.2
注：Mn. 数均分子质量/u，Mw. 重均分子质量/u，Mp. 黏均分子质量/u。
由 表 1 可 知 ， 随 着 乙 醇 体 积 分 数 的 升 高
(50%→70%→90%)，所得多糖的重均分子质量逐渐减小
(72059u→47433u→18743u)。这说明，多糖分子质量越
大，极性越小，水溶性差，较低体积分数的乙醇即可使
其沉淀下来；而分子质量小、水溶性更好的多糖分子需
要乙醇体积分数升高才能使其沉淀下来[18]。由分子质量
分布宽度指数Mw/Mn结果可以看出，G-2的多糖分子分散
程度比G-1和G-3大。
2.4 提取物多糖对PC12细胞氧化损伤的保护
CCP70 CCP50 CCP90
0 50
60
70
80
90
100
100 150 200 250 300 350
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
㒚
㚲
ᄬ
⌏
⥛
/%
图 11 粗多糖对PC12细胞的抗氧化作用
Fig.11 Antioxidant activity of crude polysaccharides
D70 D50 D90
0 50
55
65
75
85
100 150 200 250 300 350
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
㒚
㚲
ᄬ
⌏
⥛
/%
图 12 透析处理后粗多糖对PC12细胞的抗氧化作用
Fig.12 Antioxidant activity of dialyzed polysaccharides
CP70 CP50 CP90
0 50
55
65
75
85
100
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
㒚
㚲
ᄬ
⌏
⥛
/%
图 13 脱色脱蛋白处理后粗多糖对PC12细胞的抗氧化作用
Fig.13 Antioxidant activity of decolorized and deproteinized
polysaccharides
由图11～13可知，CCP50、CCP70和CCP90等粗多
糖对H2O2损伤的PC12细胞均有保护作用，细胞存活率
随着粗多糖质量浓度的增加而增大，且呈量效关系。
CCP50、CCP70和CCP90等粗多糖经半透膜透析除去小分
子(分子质量8000u以下)后得到的D50、D70和D90组分仍
保留抗氧化活性，但活性强度比透析处理前有所减弱。
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.15 85
经脱色脱蛋白处理后的多糖已失去抗氧化活性，未能对
H2O2损伤的PC12细胞起保护作用。
表 2 分步醇沉粗多糖对PC12细胞增殖的影响
Table 2 Effect of crude polysaccharide from stepwise ethanol
precipitation on the proliferation of PC12 cells
组别 剂量/(μg/mL) OD570nm 细胞存活率/%
正常组 1.016±0.013 100
模型组 0.700±0.054△ 68.9
CCP50保护组
40.00 0.728±0.053 71.6
80.00 0.782±0.046* 77.0
160.00 1.010±0.021** 99.2
320.00 0.929±0.045** 91.4
正常组 1.497±0.048 100
模型组 1.131±0.048△ 75.5
CCP70保护组
40.00 1.333±0.215 89.0
80.00 1.375±0.198 91.8
160.00 1.392±0.050** 93.0
320.00 1.384±0.059** 92.4
正常组 1.498±0.087 100
模型组 1.131±0.048△ 74.1
CCP90保护组
40.00 1.268±0.052 84.6
80.00 1.293±0.072 86.3
160.00 1.320±0.095 88.1
320.00 1.398±0.043* 92.7
注：Δ. 与正常组相比，有显著性差异 (P ＜ 0.05) ；*. 与模型组相比，有显
著性差异 (P ＜ 0.05)；**. 与模型组相比，有极显著性差异 (P ＜ 0.01)。下同。
表 3 透析处理后粗多糖对PC12细胞增殖的影响
Table 3 Effect of dialyzed polysaccharides on the proliferation of
PC12 cells
组别 剂量/(μg/mL) OD570nm 细胞存活率/%
正常组 1.315±0.020 100
模型组 0.827±0.011△ 62.9
D50保护组
40.00 0.865±0.003** 65.8
80.00 0.912±0.013** 69.4
160.00 0.935±0.012** 71.1
320.00 0.903±0.015** 68.7
正常组 1.479±0.010 100
模型组 0.965±0.026△ 65.2
D70保护组
40.00 1.033±0.130 69.8
80.00 1.060±0.135 71.7
160.00 1.102±0.034 74.5
320.00 1.093±0.111 73.9
正常组 1.427±0.009 100
模型组 0.976±0.009△ 68.4
D90保护组
40.00 1.022±0.043 71.6
80.00 1.073±0.074 75.2
160.00 1.081±0.077** 75.8
320.00 1.194±0.017** 83.7
表2、3显示的MTT分析结果表明，160μg/mL和
320μg/mL的CCP50和CCP70多糖极显著提高氧化损
伤的PC12细胞存活率(P＜0.01)；经透析处理后的D50
和高质量浓度D90多糖比D70多糖显著提高细胞存活
率(P＜0.01)。分步醇沉所得粗多糖经透析处理后对氧化
损伤细胞的保护作用减弱，经脱蛋白和脱色处理后基本
失去抗氧化活性。
3 讨 论
不同分子质量范围的多糖在不同体积分数的乙醇
溶液中溶解度不同 [18]，因此采用分步醇沉再进行分离
纯化的方法更便于研究茶枝柑皮提取物中多糖分子质
量的分布。
比较不同型号大孔吸附树脂在脱色过程中多糖成
分的保留率和色素去除率，最后采用AB-8型大孔吸附
树脂[19]。本实验采用Sevag法去除蛋白，有文献报道其
除蛋白的反应过程温和，防止多糖水解，保持原有空
间结构[20]。
评价抗氧化活性的体外实验方法主要为细胞模型法
和化学测定法，本实验采用细胞模型法筛选和评价茶枝
柑皮提取物多糖的抗氧化活性，能模拟真实生物机体内
部环境，更准确更接近地阐述活性物质在生物体内的抗
氧化反应机理[21]。
分步醇沉所得粗多糖经透析或脱色脱蛋白处理后对
氧化损伤细胞的保护作用减弱甚至失去抗氧化活性，而
相关文献报道某些糖蛋白、色素类物质具有较强的抗氧
化活性[22-23]，因此推测茶枝柑皮提取物多糖中的蛋白、色
素等物质可能与提取物的抗氧化活性存在密切关系，有
待进一步的研究。
多糖分子主链柔韧性和螺旋构象与其生物活性有密
切关系[24]。经纯化后多糖抗氧化活性的下降甚至消失可
能与分离纯化处理过程中使多糖的螺旋立体构型发生变
化有关，因此茶枝柑皮提取物多糖的空间立体构象对抗
氧化活性的影响尚需深入研究。
参考文献：
[1] 莫云燕, 黄庆华, 游明霞. 多抗氧化指标响应面法优化茶枝柑皮提
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