全 文 ：第 27卷第 12期
2 0 1 0年 1 2月
精 细 化 工
FINECHEMICALS
Vol.27, No.12
Dec. 2 0 1 0
中药现代化技术
收稿日期:2010-07 -30;定用日期:2010 -09-30
基金项目:广西自然科学基金项目(2010GXNSFA013050)
作者简介:苏秀芳(1971 -),女 ,壮族 ,广西扶绥县人 ,副教授 ,硕士 ,研究方向:天然产物活性成分的提取 、分离 、鉴定及药理活性研究 , E-
mail:suxiufang 88@sina.com。
微波辅助法提取细叶黄皮果仁总黄酮及其
清除羟自由基活性的测定
苏秀芳 ,甘海妹 ,黄智想
(广西民族师范学院 化学与生物工程系 , 广西 崇左　532200)
摘要:对微波法提取细叶黄皮果仁中总黄酮类物质进行了研究 , 通过单因素及 L9(34)正交实验 , 得到提取最佳
工艺为:温度 70℃, 微波功率 440W, φ(EtOH)=60%, m(细叶黄皮果仁)∶m(EtOH)=1∶16,提取时间 10 min, 该
条件下细叶黄皮果仁总黄酮提取率为 1.343%。在设置的 5个质量浓度梯度下 , 总黄酮提取液对羟自由基的清
除效果与其质量浓度呈正相关 , 当样品质量浓度为 0.442 g/L时 ,其清除率达 81.4%。
关键词:细叶黄皮;总黄酮;微波辅助提取;羟自由基;中药现代化技术
中图分类号:TS201.2　　文献标识码:A　　文章编号:1003-5214(2010)12-1184-04
MicrowaveAssistedExtractionTechnologyandHydroxyRadicalScavenging
ActivityofTotalFlavonoidsfromtheNutletsofClausenaanisum-olens
SUXiu-fang, GANHai-mei, HUANGZhi-xiang
(DepartmentofChemistryandBiologicalEngineering, GuangxiNormalUniverstyforNationalities, Chongzuo532200, Guangxi, China)
Abstract:ThispaperstudiedtheextractionofflavonoidsinthenutletsofClausenaanisum-olenswith
microwaveassistedextraction(MAE).ThesinglefactorandorthogonaldesignmethodsL9(34)were
appliedfortheoptimaltechnologicalconditions:70 ℃, φ(EtOH)=60%, m(thenutletsofClausena
anisum-olens)∶m(EtOH)=1∶16, 440 W, 10 min.Undertheoptimizedconditions, theextraction
percentoftotalflavonoidsisabout1.343% fromthenutletsofClausenaanisum-olens.Therewasa
positivecorelationbetweenthehydroxylradicalscavengingactivityandtheconcentrationoftotal
flavonoidsfromthenutletsofClausenaanisum-olens.Observingatfiveexperimentallevels, thehydroxyl
radicalscavengingratesattheconcentrationlevelof0.442 g/Lwere81.4%.
Keywords:Clausenaanisum-olens;totalflavonoids;microwaveassistedextraction;hydroxyradical;
modernizationtechnologyoftraditionalChinesemedicines
Foundationitem:SupportedbyNaturalScienceFoundationofGuangxiZhuangAutonomousRegion
(2010GXNSFA013050)
　　细叶黄皮 ,学名 Clausenaanisum-olens(Blanco.)
Merr,为芸香科柑橘亚科黄皮属多年生常绿大灌木
或小乔木 ,我国广西西南部 、云南南部 、广东有分布 ,
国外主要分布于菲律宾 [ 1] 。细叶黄皮是我国西南
地区的 “药食同源 ”经济树种 ,枝叶可作草药 ,祛风
除湿[ 1] 。果皮 、果肉 、果仁均可食用 ,果实可消积去
滞 、祛痰化气 、疏通肠胃 ,民间用其果仁治疗胃胀气 。
细叶黄皮是广西崇左市近年来大力推广种植的
经济树种 ,市区加工厂有 10余家 ,其主要是把果实
加工成腌制品 ,用于烹饪调料 ,加工时大都是把果仁
DOI :10.13550/j.jxhg.2010.12.007
挤出 ,作为废弃物丢掉。
国内外有关细叶黄皮药理活性 、有效成分提取
工艺研究的报道极少 ,有关化学成分的研究有一些
报道 。WangYS[ 2]等从细叶黄皮中提取到 7个化合
物 ,分别为异莨菪亭 、伞形花内酯 、葡萄内酯 、 7-
[ (E)-7′-羟基-3′, 7′-二甲基-2′, 5-二烯氨基 ]香豆
酰 、anisumarin、anisocoumarinH及 capnolactone;汪云
松[ 3]等从细叶黄皮中提取分离了 5个化合物 ,分别
为 4-(3-甲氧苯基 -4-O-β-D-吡喃葡萄糖甙)-2-丁酮 、
3-(4-羟基苯)-2-丙烯酸 、3-(3-甲氧苯基-4-羟基)-2-
丙烯酸 、3-(3, 4-二羟苯基)-2-丙烯酸甲酯及 3-羟基 -
4-甲氧基苯甲酸。
苏秀芳[ 4-5]等研究表明 ,细叶黄皮各个部位均
含有丰富的挥发油 ,其主要成分为:芳香类 、烯类及
酸类 。作者初步实验表明 ,细叶黄皮果仁还含有黄
酮类成分 。黄酮类化合物是植物光合作用产生的一
大类化合物 ,具有抗癌抗肿瘤 、抗心脑血管疾病 、抗
炎镇痛 、免疫调节 、降血糖 、治疗骨质疏松 、抑菌抗病
毒 、抗氧化抗衰老 、抗辐射等作用[ 6] 。近年来 ,微波
技术应用于黄酮类提取的报道较多 ,其具有提取时
间短 、耗能低 、效率高 、不破坏有效成分等特点。本
文对细叶黄皮果仁中的总黄酮进行微波提取工艺研
究 ,并进行清除自由基(·OH)的实验研究。
1　实验部分
1.1　材料和仪器
仪器:UV-1601型紫外可见分光光度计(北京
瑞利分析仪器公司);JA1003N电子天平(上海精密
科学仪器有限公司);XH-200A型电脑微波固液相
合成 /萃取工作站(北京详鹄科技发展有限公司)。
试剂与药品:芦丁(生化试剂 ,上海晶纯试剂有
限公司);乙醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、过氧
化氢 、水杨酸及硫酸亚铁等化学试剂均为 AR。
样品:单因素及正交实验部分所用的细叶黄皮
果仁来自广西龙州县城 ,总黄酮提取液清除自由基
实验所用的样品购于崇左市菜市 ,实验所用的样品
均经该院植物分类学黄秋婵副教授鉴定为 Clausena
anisum-olens。
1.2　测定方法
1.2.1　标准品溶液的配制
准确称取芦丁标准品 25.00 mg于 100 mL容量
瓶中 ,加入少量 φ(EtOH)=60%的乙醇 ,溶解 ,定容
至刻度 ,摇匀 ,得芦丁标准液 , ρ(芦丁)=0.250 0 g/L。
1.2.2　测定波长选择
精密量取芦丁对照液 1 mL,置于 10 mL比色皿
中 ,加入 w(NaNO2)=5%的水溶液 0.4 mL,摇匀 ,放
置 6 min,加 w〔Al(NO3)3〕=10%的水溶液 0.4 mL,
摇匀 ,放置 6 min,加 w(NaOH)=4%的水溶液 4
mL,再加水至刻度 ,摇匀 ,放置 15 min,在波长 300 ～
600 nm测定吸光度 ,确定最大吸收波长为 510 nm。
1.2.3　标准曲线的绘制
精确量取芦丁标准品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0
mL分别置于 10 mL比色管中 ,其余步骤如 1.2.2
节 ,以试剂空白为参比 ,在 510 nm处测吸光度 ,测得
结果作芦丁质量浓度 -吸光度标准曲线 ,得回归方
程:A=9.48ρ-0.0028, R2 =0.999 7,在考察范围内
呈良好的线性关系。
1.2.4　总黄酮的测定及提取率的计算
将各实验滤液用蒸馏水定容于 50 mL容量瓶
中 ,移取 1 mL按照标准芦丁吸光度测定法 ,在 510
nm处的波长下测定其吸光度 A,并从芦丁质量浓度
与吸光度关系式中得出提取液质量浓度 ,经过换算
求出总黄酮的提取率(%),即:
总黄酮提取率 /% =提取液质量浓度 ×体积 ×稀释倍数原料质量 ×100
1.2.5　细叶黄皮果仁总黄酮提取液清除羟自由基
(·OH)实验
在比色皿中依次加入 0.5 mLc(水杨酸 -乙醇
溶液)=9.0 mmol/L, 0.5 mL总黄酮提取液 , 0.5 mL
c(Fe2+)=9 mmol/L, 3.5 mL蒸馏水 ,再加入 5.0 mL
c(H2O2)=88 mmol/L,摇匀后放置一定时间 ,在 510
nm处测定吸光度 A1;取 0.5 mL蒸馏水代替 Fe2+溶
液所测得的吸光度为 A2 ,取 0.5 mL蒸馏水代替总
黄酮提取液所测得的吸光度为 A3 ,测定 3次 ,按以
下公式计算羟自由基(· OH)的清除率 P(%)[ 7] ,
并计算平均值。
P/%=(1 -A1 -A2A3 )×100
1.3　提取方法
细叶黄皮果仁※烘干※粉碎※微波作用提取※
过滤※定容(50 mL)※吸取 1 mL,测定吸光度 ,计算
黄酮提取率 。本实验主要讨论乙醇体积分数 、微波
功率 、料液比 〔m(细叶黄皮果仁)∶m(EtOH)〕、温度
及提取时间等对细叶黄皮果仁中黄酮提取率的影
响 。
2　结果
2.1　正交实验
2.1.1　正交实验因素
根据黄酮提取的影响因素 [ 8 -9] ,经单因素实验 ,
选取了四因素三水平的正交实验 ,因素水平设计见
表 1。以下各个实验均在最佳温度 70 ℃下进行。
·1185·　第 12期 苏秀芳 , 等:微波辅助法提取细叶黄皮果仁总黄酮及其清除羟自由基活性的测定
表 1　因素水平表
Table1　Factorslevels
水平 Aφ(EtOH)/%
B微波功率/W
Cm(细叶黄皮果仁)∶m(EtOH)
D提取时间/min
1 50 440 1∶12 6
2 60 480 1∶16 8
3 70 520 1∶20 10
2.1.2　正交实验结果
通过正交实验对细叶黄皮果仁总黄酮的提取工
艺参数进行优化 ,实验结果见表 2,方差分析结果见
表 3。
表 2　实验结果与极差分析
Table2　Testresultandrangeanalysis
实验号 因素A B C D 吸光值 提取率 /%
1 1 1 1 1 0.201 1.075
2 1 2 2 2 0.232 1.238
3 1 3 3 3 0.192 1.027
4 2 1 2 3 0.251 1.339
5 2 2 3 1 0.201 1.075
6 2 3 1 2 0.186 0.996
7 3 1 3 2 0.187 1.00
8 3 2 1 3 0.178 0.954
9 3 3 2 1 0.208 1.112
K1 3.341 3.415 3.024 3.262
K2 3.409 3.267 3.689 3.235
K3 3.066 3.135 3.103 3.320
k1 1.114 1.138 1.008 1.087
k2 1.136 1.089 1.230 1.078
k3 1.022 1.045 1.034 1.107
R 0.114 0.093 0.222 0.029
表 3　方差分析结果
Table3　Resultsofvarianceanalysis
变异来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 显著水平
A 0.0219 2 0.011 18.3333 ＊
B 0.013 2 0.0065 10.8333 ＊
C 0.0878 2 0.0439 73.1667 ＊＊
D 0.0012 2 0.0006 1
　　注:＊为显著性因素 , F0.1(2, 2)=9.00, F0.05(2, 2)=19.00, F0.01(2,
2)=99.00。
由 L9(34)正交实验及极差分析结果表明 ,影响
细叶黄皮果仁总黄酮得率的主次因素为 C>A>B
>D,即料液比 >乙醇体积分数 >微波功率 >提取
时间;方差分析表明 ,料液比 、乙醇体积分数及微波
功率对总黄酮得率具有显著性影响;而提取时间在
考察范围内影响不显著 。最佳提取工艺条件为
A2B1C2D3 ,即:温度 70 ℃, φ(EtOH)=60%,微波功
率 440 W, m(细叶黄皮果仁)∶m(EtOH)=1∶16,提
取时间 10 min。
2.2　重复性实验
取 3份试样 ,按最佳提取工艺进行提取 ,总黄酮
提取率分别为:1.340%、1.342%、1.396%。
2.3　回收率的测定
精密吸取 1.0 mL提取液 5份 ,分别置于 10 mL
比色皿中 ,加入芦丁对照品 1.0 mL,按 1.2.3节处
理 ,平均回收率为 100%, RSD为 0.04%。
2.4　不同产地细叶黄皮果仁总黄酮含量的测定
称取不同产地的细叶黄皮果仁 1.000 g,按最佳
提取工艺进行提取 ,按 1.2.3节测定 ,结果见表 4。
表 4　不同产地细叶黄皮果仁总黄酮的质量分数
Table4　Contentofthetotalflavonoidsindiferentareas
产地
广西龙州县 广西扶绥县 广西扶绥县 广西崇左市区 广西大新县
成熟度 成熟 半成熟 成熟 成熟 成熟
吸光度 A 0.252 0.161 0.180 0.610 0.510
w(总黄酮)/% 1.343 0.864 0.964 3.274 2.705
2.5　回流法提取细叶黄皮果仁总黄酮及含量测定
称取龙州县细叶黄皮果仁 1.000 g,加入 50 mL
φ(EtOH)=60%的乙醇 ,加热回流 2 h,过滤定容 ,按
1.2.3节步骤测定吸光度 ,吸光度为 0.213,提取率
为 1.138%,比微波辅助法提取率低 。
2.6　细叶黄皮总黄酮提取液清除羟自由基(·
OH)实验
按 1.2.5节操作 ,结果表明 ,细叶黄皮果仁总黄
酮提取液对羟自由基(· OH)的清除率随着样品液
质量浓度的增加 ,清除能力增强。当 ρ(样品)=
0.442 g/L时 ,其清除率达 81.4%,表明细叶黄皮果
仁总黄酮提取液具有很强的清除羟自由基的能力 ,
实验结果见表 5。
表 5　总黄酮提取液质量浓度与羟自由基(·OH)清除率关系
Table5　Relationshipsbetweenhydroxylfreeradicalscavenging
rateand concentrationoftotalflavonoidsfrom the
nutletsofClausenaanisum-olens
总黄酮提取液质量浓度 /(g/L)
0.442 0.221 0.111 0.074 0.055
P/% 81.4 43.9 17.3 13.5 7.8
3　结论
通过 L9(34)正交实验 ,用微波法提取细叶黄皮
果仁总黄酮的最佳提取工艺条件为:温度 70 ℃, φ
(EtOH)=60%,功率 440 W, m(细叶黄皮果仁)∶m
(EtOH)=1∶16,提取时间 10 min,此条件下广西龙州
县细叶黄皮果仁总黄酮提取率为 1.343%,崇左市区
细叶黄皮果仁总黄酮提取液质量分数达 3.274%,说
明总黄酮含量与产地有关。 (下转第 1212页)
·1186· 精 细化 工　FINECHEMICALS　　　　　　　　　　　　第 27卷　
价廉的甲基化试剂二氯甲烷及高沸点溶剂二甲基亚
砜(189 ℃),提高了回流反应温度。采用分批加入二
氯甲烷的方法 ,将二甲基亚砜使用量减少了 40%。
(2)1, 2-亚甲二氧基-4-溴苯(Ⅳ)的合成过程
中 ,采用控制反应温度在 20 ℃以下和使用等物质的
量的液溴控制二溴代副产物生成 ,以 80%的收率得
到目标产物。
(3)羟基酪醇(Ⅰ )的合成过程中选取三溴化硼
作为脱保护试剂 , -20 ℃反应 ,反应条件温和 ,避免
羟基酪醇被氧化变质 ,以 78%的收率得到 HPLC纯
度 98%以上的羟基酪醇。
(4)本文设计了一条合成羟基酪醇的工艺路
线 ,以 5步反应 24%的总收率得到高纯度的羟基酪
醇。
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(上接第 1186页)
　　不同产地的细叶黄皮果仁总黄酮含量差异较
大 ,半成熟与成熟果实总黄酮含量差异较小 。
细叶黄皮果仁总黄酮提取液具有很强的清除羟
自由基的能力 ,可作为一种抗氧化保健品的原料 ,具
有较大的开发价值 ,应提高综合利用。
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