全 文 ：收稿日期:2012-03-05; 修订日期:2012-05-28
基金项目:吉林省发改委资助项目( No．［2010］362) ;
吉林省教育厅资助项目( No．［2012］225)
作者简介:时东方( 1978-) ，男( 汉族) ，山东济宁人，现任长春师范学院讲
师，硕士学位，主要从事天然药物化学研究工作．
* 通讯作者简介:刘春明( 1964-) ，女( 汉族) ，吉林长春人，现任长春师范
学院教授，博士学位，主要从事天然药物化学研究工作．
高速逆流色谱法分离白鲜皮中化学成分条件的优化
时东方1，张红晶2，郑梅竹1，刘春明1*
(1．长春师范学院，吉林 长春 130032; 2．吉林农业大学，吉林 长春 130118)
摘要:目的 优化高速逆流色谱分离白鲜皮中的化学成分。方法 选择正己烷 －醋酸乙酯 －乙醇 －水( 1∶ 1∶ 1∶ 1，V /V)
系统对白鲜皮 85%乙醇提取物进行分离，上相作为固定相，下相作为流动相，流速为 1． 3 ml /min，仪器转速 1 200 r /min。
结果 分离得到两个单体化合物白鲜碱和黄柏酮，经高效液相( HPLC) 检测纯度均达到 99%以上。结论 该方法简单、快
速、容易操作，可为提纯制备高纯度的化学对照品提供新途径。
关键词:高速逆流色谱; 白鲜皮; 分离; 白鲜碱; 黄柏酮
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 09． 030
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2012) 09-2182-02
高速逆流色谱(HPCPC)技术是较新型的液 －液分配色谱
技术，在 20 世纪 80 年代，由美国国立健康研究院 Ito博士最先研
制开发，它是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数不
同，从而实现分离的色谱技术。高速逆流色谱法不需要对样品进
行复杂处理，与传统柱层析法相比，它具有分离速度快、样品吸附
低、分离重现性好、无污染且回收率高等优点［1］。根据紫外吸收
色谱图可重复收集样品，若与制备液相色谱结合，则可快速、大量
的制得相应纯度的标准品［2］。高速逆流色谱已经在生物碱、黄
酮、酚类、醌类、苷类、脂肪酸、多肽等化合物分离中得到了广泛的
应用［3，4］。目前，此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天
然产物化学、有机合成、环境分析等领域［5］。
白鲜皮(Dictamnus dasycarpus Turcz．)为芸香科白鲜属植物
白鲜(Dictamnus dasycarpus Turcz．)和狭叶白鲜(D． angus tifoli-
usG． Doc)的干燥根皮，味苦，性寒，有祛风燥湿，清热解毒等功
效［6］。常用于治疗急慢性湿疹，银屑病，脓胞疮［7］，皮肤瘙痒症，
黄疸和急慢性肝炎［8］等病。现代药理学研究表明，白鲜皮具有
抗氧化、抗病毒、抗细菌、抗炎、抗肿瘤等多种活性。白鲜皮的根
和地上部分含有多种化学成分，已分离鉴定出的包括生物碱类、
柠檬苦素类、香豆素和黄酮类、甾体类、倍半萜和倍半萜苷类及多
糖类化合物等成分［9］。其中，梣酮、白鲜碱、黄柏酮为白鲜皮的
主要活性成分，具有多种较强的生物活性。梣酮(fraxinellone)作
为新型的肝病治疗药物，具有良好的保肝降酶及抑制肝纤维化等
活性，并具有抑菌、杀虫等活性［10］;白鲜碱具有强心、松弛血管、
抗皮肤光损害、抗血小板聚集、抗真菌和昆虫拒食等作用［11，12］;
黄柏酮具有降低血糖，抗癌等活性［13，14］。
目前，国内外有关从白鲜皮中分离纯化单体化合物工艺优化
过程的研究报道较少，纯化的方法还基本停留在溶剂提取和常压
柱色谱的水平上［15］，未见利用高速逆流色谱分离纯化白鲜皮单
体化合物的报道。本文采用 HPCPC从药用植物白鲜皮提取物中
成功分离、纯化出纯度较高的白鲜碱和黄柏酮单体，以期为制备
白鲜皮有效成分的化学对照品提供一种简捷实用的新方法。
1 器材
1． 1 材料与试剂 白鲜皮，购于北京同仁堂药店(长春分店) ;白
鲜碱标准品(中国药品生物制品检定所) ;黄柏酮标准品(天津马
克生物制品有限公司) ;正己烷、醋酸乙酯、无水乙醇及 95%乙醇
(分析纯，北京化工厂) ;甲醇 (色谱纯，美国 Fisher 公司) ;超纯
水为实验室自制(18． 2ΩPa)。
1． 2 仪器与设备 HPCPC － 80 型高速逆流色谱仪(日本) ，UV检
测器;Waters 2695 － 2998 型高效液相色谱仪(美国) ，PDA 检测
器，C18色谱柱(150 mm × 4． 6 mm，5 μm)和 C18保护柱;S180H 超
声波提取仪(德国 Elma 公司) ;Sanorius BSl10S 分析天平 (北京
赛多利斯有限公司，十万分之一) ;HS － Z11 －Ⅱ电热蒸馏水器
(上海跃进医疗器械厂) ;纯水器(法国 Milli Q公司)。
2 方法
2． 1 白鲜皮粗提物的制备 白鲜皮药材粉碎后过 40 目筛，精确
称取 50． 002 g，用 85%乙醇溶液，料液比 1∶ 20，在 80℃水浴中回
流提取两次，每次提取 1 h，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至
干，置真空干燥器中干燥，保存备用。
2． 2 HPCPC和 HPLC条件
2． 2． 1 高速逆流色谱 溶剂系统为正己烷 －醋酸乙酯 －乙醇 －
水(1∶ 1∶ 1∶ 1，V /V) ，上相作为固定相，下相作为流动相，检测
波长为 228 nm，流速为 1． 3 ml /min，仪器转速 1 200 r /min，运行时
间为 180 min;
2． 2． 2 高效液相色谱 Waters 2695 Sun FireTM C18色谱柱(150
mm ×4． 6 mm，5 μm，美国Waters公司 ) ;柱温 25℃;等度洗脱:流
动相为甲醇 －水(58∶ 42，V /V) ，流速 0． 8 ml·min －1;进样量 10
μl;检测波长 228 nm。
3 结果
3． 1 应用 HPCPC分离白鲜皮中的单体成分 取正己烷，醋酸乙
酯，乙醇，水各 250 ml 置 1 000 ml 分液漏斗中，摇匀，充分振荡，
分层后静置 20 min，振荡 3 次，由下口放出下层;再向上层溶剂中
加入乙醇和水各 250 ml，振荡摇匀，分层后静置 20 min，振荡 3
次，再由下口放出下层，合并下层溶剂。用 0． 45 μm 滤膜分别过
滤上层和下层溶液，室温下超声脱气 30 min。上层溶液和下层溶
液分别作为固定相和流动相，备用。
将上相(固定相)以 3． 0 ml /min的流速泵入并确定充满分离
螺线管后暂停泵的工作，同时按选定的转速启动主机、开启检测
器，在 228 nm波长下进行检测。等待主机转动稳定后将下相(流
动相)以选定的流速泵入，待流动相从管柱出口流出且基线稳定
后将样品溶液由进样圈注入(样品为白鲜皮乙醇提取物用溶剂
系统的上下层溶剂各 1 ml 溶解)。管柱出口处的流出物经紫外
检测器检测，根据 HPCPC 色谱峰接收每段流份，蒸干，待测。
HPCPC条件见“2． 2”项。色谱图如图 1。
3． 2 单体成分的纯度检测 按图 1 中 HPCPC色谱峰接收图中的
每个流份，减压浓缩至干，再用甲醇溶解，过 0． 45 μm 微孔滤膜，
用 HPLC进行纯度检测，高效液相色谱条件见“2． 2”项，样品及各
·2812·
时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 9 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 9
分离峰液相色谱图如图 2 ～ 6 所示。
图 1 白鲜皮粗提物的高速逆流色谱分离图谱
图 2 白鲜皮样品 HPLC色谱图
图 3 分离得 1 号峰接收液 HPLC 色谱图
图 4 黄柏酮标准品 HPLC 色谱图
图 5 分离得 2 号峰接收液 HPLC 色谱图
图 6 白鲜碱标准品 HPLC 色谱图
白鲜皮粗提物经 HPCPC分离得到两个单体化合物，经 HPLC
检测，用峰面积归一法测得峰 1、峰 2 接收液纯度达到 99%以上。
4 讨论
在使用高速逆流色谱进行分离之前，选择合适的溶剂系统至
关重要。既要保证溶剂混合后能够较为快速、清晰的分层，还要
保证样品在上下两相有合适的分配系数，同时固定相能实现较高
的保留［16，17］。本文采用高效液相色谱对多种溶剂系统进行初
选［18，19］，然后再在高速逆流色谱上进一步对经过初选的系统进
行实验，最终得到的较优溶剂系统为正己烷 －醋酸乙酯 －乙醇 －
水(1∶ 1∶ 1∶ 1，V /V) ，检测波长为 228 nm，流速为 1． 3 ml /min，
仪器转速 1 200 r /min，60 min内就可以从白鲜皮粗提物中纯化得
到白鲜碱和黄柏酮的单体，经高效液相色谱检测纯度均高于
99%，足见该方法比传统的柱色谱分离方法具有较大的优势。采
用 HPCPC 制备白鲜碱和黄柏酮单体，具有分离时间短、纯度高等
优势，为白鲜皮中单体成分的高效分离制备提供了一条新的技术
路线。同时，高速逆流色谱在天然药物化学领域的应用，将推动
和加快传统中药现代化研究的步伐。
参考文献:
［1］ 张天佑．逆流色谱技术［M］． 北京:北京科学技术出版社，2001:
171．
［2］ 戴德舜，王义明，罗国安． 高速逆流色谱研究进展［J］． 分析化学，
2001，29(8) :586．
［3］ 祝顺琴，谈 锋．高速逆流色谱在天然产物分离中的应用［J］．中国
医药工业杂志，2005，36(12) :788．
［4］ 陈爱华，杨 坚．高速逆流色谱(HSCCC)在食品色素制备中的应用
［J］．中国食品添加剂，2005，1:83．
［5］ 袁黎明，傅若农，张天佑．高速逆流色谱在植物有效成分分离中的
应用［J］．药物分析杂志，1998，18(1) :60．
［6］ 中国药典委员会． 中华人民共和国药典［S］． 北京:化学工业出版
社，2005．
［7］ 肖培根．新编中药志［M］．北京:化学工业出版社，2002．
［8］ 江苏新医学院． 中药大辞典(上册) ［M］． 上海:上海人民出版社，
1977:738．
［9］ 武海燕．药用植物白鲜皮的化学成分及药理作用综述［J］． 内蒙古
石油化工，2007，3:50．
［10］ 徐 强，吴斐华，朱丹妮．梣酮作为肝病治疗药物的应用［P］．中国
专刊:CN2005 － 1004087 8． 2005 － 10 － 04．
［11］ Chou H C，Chen J J，Duh C Y，et al． Cytotoxic and antiplatelet aggrega-
tion constituent from the root wood of Melicope semecarpifolia［J］． Plan-
ta Media，2005，71(11) :1078．
［12］ Zhao W，WolfenderJ L，Hostettmann K，et al． Antifungal alkaloids and
limonoid derivatives from Dictamnus dasycarpus Switz［J］． Phytochemis-
try，1997，47(1) :7．
［13］ Miller E G，PorterJ L，Binnie W H，et al． Further studies on the antican-
cer activity of citrus limonoids［J］． Journal of Agricultural and Food
Chemistry，2004，52(15) :4908．
［14］ JungH J，Sok D E，Kim Y H． Potentiating effect of obacunone from Dict-
amnus dasycarpus on cytotoxicity of microtubule inhibitors，vincristine
vinblastine，and taxol［J］． Planta Medica，2000，66(1) :74．
［15］ 李翔等．从白鲜皮中同时制备梣酮、白鲜碱、黄柏酮单体的方法
［J］．四川大学学报，2007，39(4) :68．
［16］ 李 艳，肖凯军，郭祀远，等．高效逆流色谱研究进展 －在天然产物
有效成分分离方面的应用［J］． 现代食品与药品杂志，2006，16
(4) :78．
［17］ 褚建军，颜继忠，童胜强．高速逆流色谱在生物碱分离当中的应用
［J］．浙江化工，2003，34(8) :30．
［18］ Yao S，Li Y，Kong LY． Preparative isolation and purification of chemi-
cal constituents from the root of Polygonum multiflorum by high － speed
counter － current chromatography［J］． J ChromatogrA，2006，1115(1 －
2) :64．
［19］ Liu RM，KongLY． Preparative Isolation and purification of saponin and
flavone glycoside compounds from Clinopodium chinensis(Benth)O．
Kuntze by high － speed countercurrent Chromatography［J］． J L iq
Chromatogr Relat Technol，2007，30 (4) :521．
·3812·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL ． 23 NO． 9 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 9 期