全 文 ：收稿日期:2012-01-20; 修订日期:2012-05-16
基金项目:辽宁省教育厅项目(No． 2009A498)
作者简介:许 鑫(1987-)，女(汉族)，辽宁沈阳人，现为辽宁中医药大学在
读硕士研究生，学士学位，主要从事种质资源鉴定及中药的品质评价工作．
* 通讯作者简介:尹海波(1973-) ，男(汉族) ，辽宁沈阳人，现任辽宁中医
药大学药学院副教授，博士学位，主要从事种质资源鉴定及中药的品质评
价工作．
牻牛儿苗总黄酮提取工艺优化及含量测定研究
许 鑫，涂秀文，姜海燕，朱明慧，尹海波*
(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)
摘要:目的 优化牻牛儿苗最佳提取工艺，并对不同种质来源的药材进行含量测定。方法 通过正交试验法考察不同因素
和水平对提取工艺的影响，优化提取工艺。并按照优化后的工艺对不同产地牻牛儿苗中总黄酮进行提取并进行含量测
定。结果 优化后的提取条件为 40 倍量 60%乙醇回流提取 3 次，每次 1 h。对全国 26 个不同产地牻牛儿苗总黄酮含量进
行测定，其范围为 2． 47% ～ 16． 81%。结论 该实验方法简便，准确，为工业化生产提供一定的实验依据;不同产地药材总
黄酮含量差异明显，建议入药时充分考虑产地因素。
关键词:牻牛儿苗; 总黄酮; 正交设计; 提取工艺; 含量测定
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 08． 047
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)08-1953-02
老鹳草为我国常用中药，来源于牻牛儿苗科植物牻牛儿苗
Erodium stephanianum Willd．、老鹳草 Geranium wilfordii Maxim．或
野老鹳草 Geranium carolinianum L． 的干燥地上部分［1］。牻牛儿
苗习称“长嘴老鹳草”，为中药材老鹳草的来源之一，且为主流商
品，分布较为广泛，具有祛风湿、通经络、止泻痢的功效，主要用于
风湿痹痛、麻木拘挛、筋骨酸痛、泄泻痢疾［1］。黄酮类成分为牻
牛儿苗中主要成分［2］，且黄酮类成分具有抗氧化，抗菌，抗病毒
等广泛的药理活性［3］。此前杜列勇等［4］对商品药材老鹳草总黄
酮提取工艺进行了研究，也有对老鹳草和鼠掌老鹳草的总黄酮含
量比较［5］的报道，但对作为药材老鹳草主要来源的牻牛儿苗中
总黄酮研究较少。本课题组曾对牻牛儿苗总黄酮工艺进行过研
究［6］，但为了寻找更简便，更适合工业化生产的工艺，本文以不
同的试验方法对牻牛儿苗总黄酮的提取工艺进行正交试验并对
结果进行优化;对 26 个不同产地牻牛儿苗总黄酮进行含量测定
和比较分析，为合理开发利用老鹳草药材提供依据。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 UV3010 紫外分光光度计(日本日立公司) ;KQ3200B
型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司) ;AG285、AE240 型电
子天平(瑞士 Mettler Toledo)。
1． 2 试药 芦丁对照品(中国药品生物制品检定所 100080 －
200707) ;其他试剂均为分析纯。
1． 3 材料 26 份牻牛儿苗药材采自全国 7 个省，2 个直辖市，26
个市县，经本院药用植物教研室尹海波副教授鉴定为牻牛儿苗
Erodium stephanianum Willd．的干燥地上部分，凭证标本保存于本
院药用植物教研室。
2 方法
2． 1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品 50 mg，精密称定，置 25
ml量瓶中，加 60% 乙醇适量，超声使之溶解，冷却至室温，加
60%乙醇至刻度，摇匀，得到 1． 974 mg /ml对照品溶液。
2． 2 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液(1． 974 mg /ml)
0． 00，1． 00，2． 00，3． 00，4． 00，5． 00 ml 分别置于 6 个 25 ml 量瓶
中，再分别加入 60%乙醇至 5 ml，加 5%亚硝酸钠试液 1． 0 ml，摇
匀，放置 6 min;加 10%硝酸铝试液 1． 0 ml，摇匀，放置 6 min;加
10%氢氧化钠试液 10． 0 ml，再加乙醇至刻度，摇匀，放置 15min
后，以相应试剂作空白，于波长 510 nm处测定吸光度。以芦丁浓
度(C)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。并进
行回归分析，得回归方程为:A = 1． 402C + 0． 0009，r = 0． 999 8。
结果表明，芦丁在 0． 078 96 ～ 0． 394 80 mg /ml范围内线性关系良
好。
2． 3 样品前期处理 取牻牛儿苗粉末(过 40 目筛)100 g，置索氏
提取器中用石油醚(60 ～ 90℃)脱脂，待无色时取出，弃去醚液，
药渣挥干至无醚味，将药渣混匀，得到脱脂后的牻牛儿苗粉末。
2． 4 提取方法的选择
2． 4． 1 超声法 取脱脂后的牻牛儿苗粉末 2 g，精密称定。置于
100 ml具塞锥形瓶中，加 30 ml 60%乙醇，超声 30 min 后，放冷，
过滤;再加入 30 ml 60%乙醇，共超声提取 3 次，合并滤液。
2． 4． 2 回流法 取脱脂后的牻牛儿苗粉末 2 g，精密称定。置于
150 ml圆底烧瓶中，加 30 ml 60%乙醇，回流 30 min 后，放冷，过
滤;再加入 30 ml 60%乙醇，共回流提取 3 次，合并滤液。
2． 4． 3 冷浸法 取脱脂后的牻牛儿苗粉末 2g，精密称定。置于
100 ml具塞锥形瓶中，加 90 ml 60%乙醇，摇匀，静置 24h后过滤。
将上述 3 种方法提取后的滤液蒸干，加 80%乙醇溶解并转
移至 100 ml量瓶中，并用 10%的氢氧化钠调至 pH = 9 后 4℃冷
藏过夜，取出后迅速过滤。分别精密吸取续滤液 4 ml，置于 25 ml
量瓶中，按“2． 2”项下方法显色后测定吸光度并计算总黄酮含
量。结果超声法总黄酮含量为 7． 99%，回流法为 9． 16%，冷浸法
为 6． 33%，因此选择回流法做为提取方法。
2． 5 提取溶剂的选择 取脱脂后的牻牛儿苗粉末 2 g两份，精密
称定。置于两个 150 ml圆底烧瓶中，分别加入 90 ml 60%乙醇和
90 ml 60%甲醇回流 1 h 后，放冷，过滤。将滤液蒸干，分别加
80%乙醇和 80%甲醇溶解并转移至 100 ml 量瓶中，并用 10%的
氢氧化钠调至 pH = 9 后 4℃冷藏过夜，取出后迅速过滤。分别精
密吸取续滤液 4 ml，置于 25 ml量瓶中，按“2． 2”项下方法显色后
测定吸光度并计算总黄酮含量。结果甲醇提取的总黄酮含量为
6． 58%，乙醇为 7． 89%，故选择乙醇为提取溶剂。
2． 6 测定波长的选择 精密吸取对照品溶液 1 ml，置于 25 ml量
瓶中，按“2． 2”项下显色方法进行显色，并以相应试剂做空白对
照，在 400 ～ 700 nm范围内进行全波长扫描，结果在波长 510 nm
处有最大吸收，故选择 510 nm为测定波长。
2． 7 精密度考察 精密吸取对照品溶液 4 ml，按“2． 2”项下方法
显色后测定吸光度，平行做 6 次，结果 RSD 为 0． 13%，表明仪器
的精密度良好。
2． 8 稳定性考察 精密吸取供试品溶液 4 ml，按“2． 2”项下方法
显色后在 0，5，10，20，40，60 min 时测定吸光度，结果 RSD 为
0． 54%，表明供试品溶液在显色后 0 ～ 60 min内稳定性良好。
2． 9 重复性考察 取脱脂后的牻牛儿苗粉末 2 g，精密称定，按
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“3． 5”项下方法制备后，按“2． 2”项下方法显色并测定吸光度。
平行做 6 份，结果 RSD为 0． 70%，表明本实验重复性良好。
2． 10 加样回收率考察 称取已知含量牻牛儿苗粉末 1 g(总黄酮
含量 24． 73 mg /g) ，精密称定。加入芦丁对照品适量，按“3． 5”项
下方法制备后，按“2． 2”项下方法显色并测定吸光度。平行做 6
份，结果平均回收率为 97． 40%，RSD为 1． 84%，表明本实验回收
率较高。
3 结果
3． 1 单因素考察
3． 1． 1 乙醇浓度的考察 分别用 30%，45%，60%，75%，90%五
种不同浓度乙醇各 100 ml，回流提取 1 h，提取 1 次。结果见图 1。
图 1 不同浓度乙醇对总黄酮含量的影响
由图 1 可见，随着乙醇浓度的升高，总黄酮含量不断增加，但
当浓度超过 60%时，含量反而降低。由此可认为 60%乙醇为最
适浓度。
3． 1． 2 溶剂用量的考察 分别用 15，20，30，40，50 倍 60%乙醇回
流提取 1 h，提取 1 次。结果见图 2。
图 2 不同溶剂用量对总黄酮含量的影响
由图 2可见，随着溶剂用量的增加，总黄酮含量不断增加，当溶
剂量在 30 ～50倍之间时总黄酮含量变化不大，且当溶剂量超过 40
倍时，含量反而降低。由此可认为 40倍量乙醇为最适溶剂用量。
3． 1． 3 提取时间的考察 用 100 ml 60%乙醇回流提取 1 次，分
别提取 1，2，3，4，5 h。结果见图 3。
图 3 不同提取时间对总黄酮含量的影响
由图 3 可见，不同提取时间对总黄酮含量影响不大，仅在
3 mg /g范围内变化。随着提取时间延长，总黄酮含量不断增
加，但当时间超过 3 h 时，含量反而降低。由此可认为 3h 为
最适提取时间。
3． 1． 4 提取次数的考察 用 60%乙醇回流提取 1 h，每次 100 ml，
分别提取 1 次，2 次，3 次，4 次，5 次。结果见图 4。
由图 4 可见，提取次数在 1 ～ 3 次范围内时，总黄酮含量不断
增加，提取 3 次时含量最大，在 3 ～ 5 次范围内总黄酮含量稍有降
低。由此可认为 3 次为最适提取次数。
图 4 不同提取次数对总黄酮含量的影响
3． 2 正交实验设计 根据单因素实验的结果，以总黄酮含量为考
察指标，以乙醇浓度(A) ，溶剂用量(B) ，提取时间(C) ，提取次数
(D)为考察因素，每个因素设计 3 个水平，采用 L9(3
4)正交表进
行正交实验设计。因素水平表见表 1。
表 1 正交实验的因素及水平
水平
A
乙醇浓度(%)
B
溶剂用量 /倍
C
提取时间 t /h
D
提取次数
1 45 15 1 1
2 60 22． 5 2 2
3 75 40 3 3
3． 3 总黄酮含量测定 取脱脂后牻牛儿苗粉末 2 g，精密称定。
按正交实验设计表中的条件进行提取，过滤后合并滤液，蒸干，用
80%乙醇溶解并转移至 100 ml 量瓶中，并用 10%的氢氧化钠调
至 pH = 9 后 4℃冷藏过夜，取出后迅速过滤。精密吸取滤液 4
ml，置于 25 ml容量瓶中，按“2． 2”项下方法显色后测定吸光度。
计算总黄酮含量，并进行方差分析。结果见表 2 ～ 3。
表 2 正交实验结果
实验号 A B C D 总黄酮含量(%)
1 1 1 1 1 9． 384
2 1 2 2 2 15． 065
3 1 3 3 3 15． 098
4 2 1 2 3 16． 150
5 2 2 3 1 14． 019
6 2 3 1 2 16． 697
7 3 1 3 2 14． 832
8 3 2 1 3 16． 805
9 3 3 2 1 14． 124
K1 13． 182 13． 455 14． 295 12． 509
K2 15． 622 15． 296 15． 113 15． 531
K3 15． 254 15． 306 14． 650 16． 018
R 2． 440 1． 851 0． 818 3． 509
表 3 方差分析结果
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F值 显著性
A 10． 378 2 10． 285 19． 000
B 6． 816 2 6． 755 19． 000
C 1． 009 2 1． 000 19． 000
D 21． 682 2 21． 489 19． 000 *
误差 1． 01 2
* P0． 05(2，2)= 19． 00
从直观分析和方差分析可看出，影响总黄酮提取过程因素的
主次顺序为:提取次数 D ＞乙醇浓度 A ＞溶剂用量 B ＞提取时间
C。其中提取次数(D)为主要影响因素，其他因素为次要影响因
素。最佳提取条件为 A2B3C2D3，即 40 倍 60%乙醇回流提取 3
次，每次 2 h。由于提取时间对提取效率的影响最小，从降低成
本，节约资源角度考虑，将条件优化为 A2B3C1D3，即 40 倍 60%乙
醇回流提取 3 次，每次 1 h。
3． 4 验证性实验 按优化后的提取条件 A2B3C1D3 进行提取。
取牻牛儿苗粉末 3 份，每份约 2 g，精密称定。加入 40 倍 60%乙
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醇回流提取 3 次，每次 1 h。得总黄酮平均值为 16． 938%(n =
3) ，为最高得率。
3． 5 不同产地牻牛儿苗中总黄酮的含量测定 取每个产地脱脂
后的牻牛儿苗粉末各 2 g，精密称定。置 150 ml 圆底烧瓶中，加
40倍(80 ml)60%乙醇回流提取 1 h，过滤后再加入 40 倍 60%乙
醇回流提取，共提取 3 次。合并滤液，蒸干，用 80%乙醇溶解并
转移至 100 ml量瓶中，并用 10%的氢氧化钠调至 pH = 9 后 4℃
冷藏过夜，取出后迅速过滤。精密吸取滤液 4 ml，置于 25 ml 量
瓶中，按“2． 2”项下方法显色后测定吸光度，并计算总黄酮含量。
结果见表 4。
表 4 26 个产地牻牛儿苗总黄酮含量测定结果 %
编号 产地 总黄酮含量 编号 产地 总黄酮含量
1 辽宁大连 16． 81 14 河北易县 4． 81
2 辽宁葫芦岛 2． 54 15 河北兴隆 6． 76
3 辽宁锦州 4． 51 16 河北沽原 4． 42
4 辽宁熊岳 5． 87 17 内蒙科尔沁 2． 57
5 辽宁沈阳 7． 98 18 内蒙通辽 2． 47
6 辽宁彰武 8． 44 19 天津蓟县 4． 30
7 吉林松原 3． 39 20 陕西乾县 6． 10
8 吉林通榆 9． 11 21 山东青岛 5． 59
9 吉林白城 7． 65 22 山东潍坊 5． 79
10 黑龙江齐齐哈尔 7． 02 23 山东济南 8． 88
11 黑龙江杜尔伯特 3． 57 24 北京密云 9． 78
12 黑龙江大庆 7． 52 25 北京延庆 10． 12
13 黑龙江泰来 5． 95 26 北京鹫峰 8． 89
4 讨论与结论
4． 1 提取方法和溶剂的选择 本实验比较了超声法，回流法，冷
浸法三种提取方法，甲醇和乙醇两种提取溶剂，根据提取后总黄
酮含量的多少，最终确定提取方法为乙醇回流法。
4． 2 除鞣质方法的选择 牻牛儿苗中存在大量鞣质，如不除去则
会影响总黄酮测定的稳定性，故在试验过程中选择操作较为简便
的明胶法，改良明胶法，碱性醇沉法［7］三种除鞣质的方法进行比
较。考虑到除鞣质的方法应该既能保证测定过程中有较好的稳
定性，同时总黄酮的损失也应该最少，而且操作简单，最终选择碱
性醇沉法作为除去鞣质的方法。即在乙醇浓度达到 80%时调整
pH值，使溶液呈碱性，4℃冷藏过夜，此时鞣质成为沉淀析出，过
滤除去鞣质。在显色后，即使存在少量未除去的鞣质也会在碱性
醇溶液条件下再次成为沉淀析出，可再次过滤后进行测定，以保
证供试品有较好的稳定性。
4． 3 测定波长的选择 将对照品溶液显色后进行全波长扫描，发
现在波长 510 nm处有最大吸收，故选择 510 nm为测定波长。
4． 4 提取工艺的选择 根据正交试验结果得到最佳提取条件为
A2B3C2D3，即 40 倍 60%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h。由于提取
时间对提取效率的影响最小，从降低成本，节约资源角度考虑，优
化后的条件为 A2B3C1D3，即 40 倍 60%乙醇回流提取 3 次，1 h /
次。且验证性试验符合要求。
本实验对 26个不同产地的牻牛儿苗样品总黄酮含量进行测
定，发现牻牛儿苗中总黄酮含量较高，在 2． 47% ～ 16． 81%范围内，
但不同产地样品中所含总黄酮含量有明显差异。其中内蒙通辽含
量最少(18 号) ，仅为 2． 47%，而辽宁大连含量最多(1 号) ，高达
16． 81%，是最少含量的 6倍之多。因此在入药时应充分考虑产地
因素，同时也说明控制药材质量的重要性。本实验在研究牻牛儿
苗总黄酮方面为进一步合理开发利用老鹳草药材提供依据。
参考文献:
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中金丝桃素的含量变化［J］．中国药业，2010，19(8) :29．
收稿日期:2011-12-04; 修订日期:2012-04-27
基金项目:陕西省科技厅自然科学基础研究项目(No． SJ08C229)
作者简介:应小平(1964-) ，女(汉族) ，陕西咸阳人，现任陕西中医学院教授，硕士研究生导师，学士学位，主要从事中医药防治恶性肿瘤研究工作．
大鼠山仙颗粒含药血清对 S － 180
肉瘤细胞 Bax基因表达的影响
应小平1，吴肖晓1，方 艳1，胥 冰1，王小平1，郭兰生1，赵延红1
(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)
摘要:目的 探讨山仙颗粒(SXG)含药血清对 S － 180 肉瘤细胞的抑制作用及对凋亡相关基因 Bax表达的影响，以揭示其
临床抗肿瘤的分子机制。方法 将 10%及 100%的 SXG含药血清作用于体外培养的 S － 180 肉瘤细胞，分别用 MTT比色
法和免疫细胞化学(SABC)法检测在 24，48，72 h后，含药血清对 S － 180 肉瘤细胞的增殖抑制和对 Bax 表达的影响。结
果 MTT法表明，与空白对照组比较，SXG含药血清能显著抑制 S － 180 肉瘤细胞的增殖(P ＜ 0． 01) ，其中 100% SXG含药
血清组在 24，48，72 h增殖抑制率分别为 31． 61%，41． 44%，46． 69%。SABC法表明，SXG含药血清可使 Bax 表达高于空
白对照组(P ＜ 0． 05) ，其中 100% SXG含药血清组在 24，48，72 h Bax表达率分别为 59． 26%，64． 28%，68． 19%，具有明显
的量 －效与时 －效关系。结论 大鼠 SXG含药血清能显著抑制体外培养的 S － 180 肉瘤细胞的增殖，其机制可能与抑制
肿瘤细胞增殖、增强 Bax基因表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡有关。
关键词:山仙颗粒; 含药血清; Bax; 细胞凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 08． 048
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)08-1955-03
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 8 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 8 期