全 文 ：第 5 卷第 1 期
1 9 89年 2 月
生 物 化 学 杂 志
C h i ne se B ie oe m h ie a l Jo ur na l
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.
5
,
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.
1
F e b
. ,
198 9
九里香多糖和蛋白多糖的分离 、 纯化和分析
刘京丽带 王淑如 陈琼华
( 中国药科大学生化研究室 , 南京 )
摘要 九里香 ( M u r r a y a P a n i e u l a t a L . J a e k ) 皮部经热水提取 、 乙醉沉沈 、 s e Ph a d e x
G一 1 0 柱层析令离 、 碑酸氮钙吸附 、 酸忿 ,再通过 s “ P h a d e x G一2 0 柱层析纯化 ,得到灰
白色粉末状九里香蛋 白多格 。 总格含量为52 . 1% (其中荀苟格醛酸含蚤为 1 0 . 9% ) ,蛋
白质含量为 2 0 . 0% 。九里香蛋白多格去蛋白后 , 即得九里香多糖 , 总格含贵为 8 . 2%
(其中荀苟糖醛酸含量为2 0 . 。% ) , 经纸层析和采丙烯 耽 胺凝胶园盘电泳鉴定为单
一斑点和单一区带。 平均令予量约为 1 . 7 x 10 . 5 。 组成单格的摩尔比为菊苟箱 : 零甘
格 : 木糖 : 阿拉伯糖 : 岩藻糖 : 荀萄糖醛酸 = 1 . 0 : 0 . 4 0 : 0 . 1 6 : 0 . 1 7 : 0 . 2 0 : 0 . 4 .8
关锥词 : 九里香 、 多糖 、 蛋白多糖
芸香科植物九里香 , 又名月桔 , 具有抗炎 、 抗 ’ :.I 育和治疗跌打损伤等功效 .lt 2 ] 。 国内外
对其化学成分的研究已见报道的有香豆素类 、 叫噪类生物碱和菇类化合物等 .8[ ` · “〕 。 我国福建
民间以九里香根煎剂用于中期妊娠 引产 , 有良好效果 6[] 。 本文报告九里香多糖和蛋白多的糖
提取 、 分离 、 纯化及理化分析。 有关抗生育和其它生物活性将 另题报告。
材 料 和 仪
一 、 原料
J
a e k s
。
二 、 仪器
三 、 试剂
九里香取 自广西产芸香科植物九 里 香 ,
器
经 鉴定为 M u r r a y a P a n i e u l a t a ( L . )
岛津 u v 一 30 0 , 岛津 I R一 4 0 0 , 岛津 G C一 R IA 气相色谱仪 。
D e x t r a n 标矛佳品 、 s e Ph a d e x G一 1 0 0 和 G一 2 0 0 为 Ph a r m a c i a 公司产品 , 岩藻搪
为 C o l n b r o o k B e r k s E n g l a n d 产品 , 葡萄搪为 S i g m a 产品 ,木糖 为 E . M e r e k D a r m s t a d t 产品 ,
半乳糖 、 甘露糖 、 阿拉伯糖 、 葡萄糖醛酸均为上海试剂二厂产品 。
方 法 和 结 果
一 、 提取 、 分离和纯化
以 自行设计的方法对九里香多糖和蛋白多糖进行提取 、 分离和纯化 。 取广西产九里香皮
* 8 3级硕士研究生。
落9 a 7年 8 月 2 1 日收到初 稿 , 1 9 8 7年 12月 14 日收到修改稿 , -
冬3
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1989. 01. 007
部千燥品 , 切成小片 , 用沸水提取 2一 3 次 , 合井提取液 , 浓缩 、 过滤 、 透析 48 小时 , 加三
倍量 95 %乙醇 , 离心 , 沉淀相继以 95 %乙醇 、 丙酮洗涤 , 其空干燥 , 得九里香蛋白多糖粗制
品 , 将粗制品溶于少量蒸馏水 , 离心 , 上清液加人 se Ph o d o x C一 1 0 层析柱 , 用蒸馏水洗脱 ,
分部收集蕙酮法多糖阳性反应的高峰部分 , 水浴浓缩 , 加入磷酸氢钙搅拌吸 附 3 小 时 , 离
心 ,沉淀用稀酸解析 , 再离心 , 上清液透析至中性 , 用 S e va g法 l7] 去蛋白 ,加 3 倍量 95 %乙醇 、
离心 , 上清液经 SeP h o d e x G一2 0 层析柱 进 一步纯化 , 用蒸馏水洗脱 , 如上述分部收集多精
反应阳性的高峰部分 (见 F i g l ) , 水浴 浓 缩 , 加三倍量 95 %乙醇 , 离心 ,沉淀相继以 95 % 乙
醇 、 丙酮洗涤 , 其空干燥得灰白色粉末状九里香多搪 (简称 P )S 精制品 。 上述步骤 , 如果未
去蛋白 , 则得九里香蛋白多糖 (简称 P P s) 精制品 。
即 40 自 即 l的
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F 19
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1 P u r i f i c a t i o n o f P S w i七h
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P u r i t y o f P S b y p a P e r
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D e v e lo P
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a e e七i e a e i d : w a t e r ( 4 : 1: 1 )
F 19
.
3 Id e n t i f i e a 乞i o n o f
p u r i t y o f P S b y p o l y a
-
c r y l a m i n d e g e l e l e e t r o
-
P h o r e s i s
.
二 、 分析 、 鉴定
1
. 九里香多糖纯度鉴定 以新华中速层析滤纸检查纯度 , 溶剂系统为乙酸乙醋 : 醋
酸 : 水 (4 : 1 : 1 ) , 0 . 5% 甲苯胺蓝乙醇溶液染色 81[ , 0 . 5%醋酸溶液漂洗至背景退色 , 结果呈
现单一斑点 (见 iF g Z ) 。 以聚丙烯酞胺凝胶园盘电泳 , 阿利新蓝染色 9[] 进行纯度检查 , 结果
呈现单一区带 (见 iF g 3 ) 。
2
. 含量测定 九里香多糖和蛋白多糖均易溶于水 , 以蕙酮法 lt0 ]测定糖含量 , 硫酸一
咔哇法 l[ ’ ] 测定葡萄搪醛酸含量 , 微 量双缩腮法测定蛋 白质含量 12[ 1 , 中 华人民共和国药典
( 1 9 8 5 年版 ) 规定方法测定水分和灰分含量 , 结果如 T o b le l。
T a b l e
.
1 C o n t e n t o f e o m p o n e n t s o f e r u d e P P S
, P P S a n d P S
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3
. 紫外 、 红外分析 九里香多糖紫外扫描 , 在 2 6 0n m 和 2 8 0n lu 处未见到蛋白质 、 核
数的特征吸收峰 : 红外扫描在 4。。o o m 一 `一 6 5 0 0 nI 一 ’ 区间具有多精类物质的一般特征。 结果见
F i g
.
4和 F i g . 5。
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F i g一 U V a b s o r p七i o n s p e c t r a o f P S Fl g . 5 T h e I R a p e e t r u m o f P S
1
.
P S , 2
.
s t a n d a r d 日o lu t i o n o f P r o 七e i n a n d n u e l e i e a e i d
4
. 组成单精的分析
( 一) 纸层析 [ , 8 1取样品 l o m g , 加 l m o l / L H : 5 0 。 , 封管 , 于 2 0 0℃水解 6 小时 , 碳酸钡中
和 , 浓缩后点样于新华中速层析滤纸 。 展开剂 A 为乙酸乙酉尔毗吮 :水 = 10 : 4 : 3 ; 展 开剂 B 为
正丁醇 :冰醋酸 :水 = 4 : 1 : 5 , 并与相应的标准品对照 , 苯胺一邻苯二甲酸试剂显色 l[’ 1 , 结果
发现九里香多搪的组成单糖为葡萄糖 、 甘露糖 、 阿拉伯糖 、 岩藻糖和葡萄糖醛酸 (见 F ig . a6 和
F i g
。
6 b )
。
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: a e e t i c a c i d : w a t e r ( 4 : 1 : 5 )
(2 ) 气相层 析 〔“ · ’ 。 ,采用岛津 G C一 R I A 气相色谱仪 , 旗充柱 : 5 % o v 一 2 2 5 / A W一 D M C S -
e h r o m o s o r bw 5 0一 10 0目 , 1 . o o x o . 3m tn i d , 柱温 : 2一。℃ , 检测器 : F I D , 载气 : N : , 载气
流速 : 4 o m l / m i n 。
取样 品 1 s m g , 加 Zm ol / L三氟醋酸封管 , 于 12 1℃ 水解 2 小时 , 玻璃棉过滤 , 用 70 %乙
醇洗涤残渣三次 , 合拜滤液和洗泽液 , 用 1“ ol / L氨水调 P H 至中性后 , 再加 0 . 5耐 氨水 ,
然后加入 5 至 1 0“ 移四氢硼钠 , 于室垠下还原 1 小时 , 滴加冰醋酸至不冒气泡为止 。 加入少
最无水甲醇 , 抽干 , 如此反复加无水甲醇处理五次 , 抽千后 , 加入醋醉 : 毗吮 (1 : 1) 2 , l , 封
管 , 于 1 0 ℃ 乙酚化 l 小时 , 抽干 , 溶于氮仿 , 即可按上述条件进行气相层析。 按同法制畜
标准品还原乙酞化衍生物 , 同样条件进行气相层析 , 结果见 iF g . 7和 T 。 b l eZ 。
T a b l e
.
2 R e d u e e d a l d i t o l a e e t a t e d e r i v a七i v e s o f s t a n d a r d s u g a r s a n d
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.
综合气相色谱分析 、 纸层析和硫酸 一咔 哇
法鉴定结果 , 九里香多搪的单糖组成 为 岩 藻
糖 、 阿拉伯搪 、 木糖、 甘露糖 、 葡萄糖和葡 萄
精醛酸 。
5
. 组成单糖的摩尔比测定
l( ) 葡萄搪醛酸的含量测定 取九里香
多精 Zm g , 用蒸馏水配成 20 0井g / m l 溶液 , 以
硫酸一咔哇法测定葡萄糖醛酸含量 为 2 0 . 0 % 。
(2 ) 其它组成单糖的摩尔比测定 以木
精为内标准 ,先测定 L 一岩藻糖 、 L 一阿拉伯糖 、
D 一甘露糖和 D 一葡萄糖的定量校正因子 。 精密
称取上述各标准单搪 , 使其与内标木搪的重量
此在 0 . 3 一 3 . 25 之间五个不同浓度 , 按前法制
备还原乙酸化衍生物 ,拜进行气相层析 ,求出各
` . ` .二 * 、 。 。 。 二 , , 国 , 了; _ W i/ W , 、单糖的斜率 b ,即定量校正因子 【f 二 共二升半一 】,’ 一 ” 一 ~ 一 ’~ 一 ~ ` \ A i / A s / ’
结果见 T a b l e s 。
样品的摩尔比测定条件与校正因子测定条
件相同 , 同样以木糖为内标准 , 将测得的样品
F `9 . 了 R e d u e e d a l d i t o l a e e七a t e d e r i v a 七i v e s
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4: D
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m a n n o 国 e s : D 一 g a la 。 七o . e 6: D 一 g l u e o s e
中各个组成单糖的峰面积和内标的峰面积之此乘以 f / M (定量校正因子 /分子量 ) 所得 之 值
即为靡尔比 。 但因样品本身含有少量木精 , 故在实际计算时 , 需要用追加法求出实际加人的
内标木搪所产生的峰面积与各个组成单糖的摩尔比 。 结果测得九里香多糖组成单糖的摩尔比
为葡萄搪 : 甘露楷 :木糖 :岩藻糖 :阿拉伯搪 :葡萄搪 醛 酸 二 1 . 。 : 0 . 4 0 : 。 . 1 6 : 。 . 2 0 : 0 . 1 7 : 。 . 48 。
6
. 分子量的测定 采 用 S e Ph a d e x G一2 0 0 层析柱 ( 2 . 0 x 2 1 c “ ) , 以 0 . 9% N a C I (流速
6“ l/ 小时 )平衡三天 。 取四种已知分子量的 eD xt ar 。 标准品 (分子量分别为 1 0 , 0 0 0 、 40 , 0 0 0 、
3 6
夕。 , 00 0 ` 90 , 00 0 )各 15m g ,溶于最小体积的 0 . 9% N a C I中 , 先后相继上柱 ,洗脱液为 0 . 9%N a CI ,
按 1二 l/ 管分部收巢 , 以 截酮 比色决测定错含量 , 求封高峰洗挽体积 分 别 为 52 m l 、 4 7 0 1、
43 m l
、
40 m l
。 用蓝色葡聚搪 (分子量 20 0 万以上 ) 测得外水体积为 25 m l 。 取样品 20 m g , 溶
T a b l e 3 W
e i g h七 r a七1 0 a n d p e a k a r e a r a 七10 o f s t a n d a r d
s u g a r s a n d i n t e r n a l s 七a n d a r d ( n 二 5 )
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。
2 8
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。
3 9 2
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。
9 2 8 9
.
9 9 7 2
1
。
0 7 8 4
0
.
9 9 8 2
于最小体积的 0 . 9% N aC I中 , 按上远方法上柱 , 结果发现九里香多糖为单一洗脱峰 , 高峰洗
脱体积为 29 m l 。 用标准曲线法测得九里香多糖的平均分子量约为 1 70 , 0 0 0 。
讨 论
从九里香植物分离 、 纯化而制得的九里香蛋 白多糖或九里香多糖 , 其单搪组成中含葡萄
糖醛酸 , · 表明它是一种酸性杂多搪 。
九里香多糖或蛋白多搪均呈灰白色 , 用活性炭吸附 , 以及其它物理方法均未能除 尽 色
素 。 用过氧化氢氧化 , 虽可变成白色 , 但生物活性破坏 , 说明色素与多糖结合牢固 , 不易除
去 。
在组成单糖分析中 , 气相层析结果比纸层析多检出一个木糖 , 这可能是由于木糖在多搪
中含量较小 , 纸层析灵敏度和分离效果较差所致 。
在纸层析和硫酸一咔哇反应中 , 均确证组分中富含葡萄糖醛酸 ,而气相层析中未能检出 。
主要是 由于披基在一般条件下不易被化学还原剂还原 。 因此 , 葡萄搪醛酸的还原乙耽化产物
仍含有梭基 , 极性大 , 在本实验条件下不易气化而未能出峰 。 如采用强还原剂 , 葡萄搪醛酸
则成还原葡萄搪 , 气相层析结果也只团现还原乙酸化葡萄搪的色谱峰 。 所以 , 搪的还原乙酸
化衍生物的气相层析通常不能检出葡萄糖醛酸 。
九里香多糖和蛋 白多糖具有抗生育 、 增强机体免疫功能 , 对机体受内外因素所致的损伤
也有一定的保护和修复作用 。 此外还有抗凝血作用等 (见另题报告 ) 。 因此 , 对九里香多糖或
蛋白多糖的研究具有重要意义 。
参 考 文 献
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a n d P r o t e i n P o l y s a e c h a r i d e o f M u r r a y a P a n i e u l a t a
L i u
,
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,
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( D落, ` s 注。 , o f B ` o c h e o i s t , 夕, 已 h`。 a
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r o t e i n P o l y s a e e h a r i d e h a d b e e n o b t a i n e d f r o m t h e e o r t e x o f M u r r a y a
P a n i e u l a t a b y e x t r a e t i o n w i t h h o t w a t e r
, i s o l a t i o n w i t h C a H P O一 a d s o r P t i o n a n d P u r i f i e a t i o n
w i t h e o l u m n e h r o m a t o g r a Ph y o n S e Ph a d e x G一 1 0 0 a n d G一 2 0 0 r e s P e e t i v e l y
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.
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