全 文 ：论著 文章编号:1000-5404(2011)01-0058-03
茶多酚与葡萄柚提取物联合应用对变异链球菌生长 、产酸的影响
黄晓晶 ,卢国英 ,刘建党 ,江 山 ,雷丽珊 (350002福州 ,福建医科大学附属口腔医院牙体牙髓科)
[摘要 ] 目的 探讨茶多酚与葡萄柚提取物联合应用对变异链球菌生长 、产酸的影响。方法 采用棋盘稀释法测
定茶多酚葡萄柚提取物混合液对变异链球菌的最低抑菌浓度(MIC)值 , 计算分级抑制浓度(FIC)指数来判定二者的联合
效应;并测定低于 MIC浓度的茶多酚葡萄柚提取物混合液对变异链球菌产酸的影响。结果 茶多酚和 GSE单独用药时 ,
其 MIC分别为 2 mg/ml和 46.88 mg/L,联用时可降低单组分的使用浓度 ,如茶多酚 1 mg/ml联用 GSE37.5 mg/L即可达
到联合应用的 MIC, FIC=0.75。变异链球菌培养前后的■pH值随混合液浓度的降低而明显增加。结论 茶多酚与葡萄
柚提取物联合应用对变异链球菌的体外抗菌活性具有相加作用 ,较各自的单组分用药在更低浓度即可有效抑制变异链球
菌的生长 、产酸。
[关键词 ] 茶多酚;葡萄柚提取物;变异链球菌;抗菌活性;棋盘法
[中图法分类号 ] R282.71;R378.12;R965 [文献标志码 ] A
[基金项目 ] 福建省医学创新课题(2009-CXB-36)
[通信作者 ] 黄晓晶 ,电话:(0591)83736434 , E-mail:hxiaoj@163.com
Effectofcombinedapplicationofteapolyphenolsandgrapefruit-seedextracton
growthandacidproductionofStreptococcusmutans
HuangXiaojing, LuGuoying, LiuJiandang, JiangShan, LeiLishan(DepartmentofEndodonticsAfiliatedHospitalofStomatology,
FujianMedicalUniversity, Fuzhou, FujianProvince, 350002, China)
[ Abstract] Objective Toinvestigatetheefectofcombinedapplicationofteapolyphenols(TPs)and
grapefruit-seedextract(GSE)onthegrowthandacidproductionofStreptococcusmutans.Methods Minimal
inhibitoryconcentration(MIC)ofmixedsolutionofTPsandGSEonthegrowthofStreptococcusmutans(ATCC
25175)wasmeasuredbythecheckerboardmethod.Fractionalinhibitoryconcentration(FIC)wascalculated
accordinglytoevaluatethecombinedefectofTPsandGSE.TheefectofmixedsolutionsofTPsandGSE, with
concentrationslowerthanMIC, ontheacidproductionofStreptococcusmutansATCC25175wasalsoobserved.
Results ComparedwiththeapplicationofTPs(MIC=2 mg/ml)orGSE(MIC=46.88 mg/L)alone, the
combinedapplicationofTPsandGSEcouldlowertheMICsofbothcomponents.Forinstance, TPs1 mg/ml
combinedwithGSE37.5mg/LcouldreachMIC, withanFICof0.75;andthe■pHvalueofstreptococcus
mutanscanbeincreasedobviouslywhentheconcentrationdecreased.Conclusion Combinedapplicationof
TPsandGSEhasadditiveantibacterialefectonStreptococcusmutans.ComparedwiththeapplicationofTPsor
GSEalone, combinedapplicationofTPsandGSEcanefectivelyinhibitthegrowthandacidproductionof
Streptococcusmutansatlowerconcentrations.
[ Keywords] teapolyphenols;grapefruit-seedextract;streptococcusmutans;antimicrobialactivity;
checkerboardmethod
SupportedbytheInnovativeProgramofMedicalScienceofFujianProvince(2009-CXB-36).Corespondingauthor:HuangXiaojing, Tel:86-591-83736434,
E-mail:hxiaoj@ 163.com
含漱剂控制菌斑已成为患者自我菌斑控制从而达
到防龋效果的重要方法之一。以往临床普遍使用的治
疗类漱口液如洗必泰 、三氯新等抗生素类漱口液 ,由于
其存在易使牙面着色 、口感差 、黏膜刺激性以及长期使
用可能导致口腔正常菌群失调 、耐药等副作用 ,难以作
为保健类漱口液推广应用 。而天然植物提取物作为保
健类漱口液则有很大的发展空间 ,且我国民间自古就
有用茶水漱口防治口腔疾病的历史。近来的研究发现
茶叶中的茶多酚是天然防龋物质 ,具有抑菌作用及防
龋效果 。然而 ,纯品茶多酚味苦涩 ,根据以往研究报道
茶多酚对人口腔最主要致龋菌变异链球菌的最小抑制
浓 度 (minimalinhibitory concentration, MIC)为
2 mg/ml[ 1] ,因此能达到有效抑菌浓度的茶多酚溶液
具有一定的苦涩感[ 2] ,这限制了其在人群中的应用;
另一种由天然植物葡萄柚提取物 (grapefruit-seedex-
tract, GSE)配制的漱口液———GSE漱口液 ,口感好 ,在
临床研究中发现其抑菌效果与西吡氯铵相当 ,但不如
洗必泰 [ 3] 。目前 ,探讨两种或多种药物配伍应用 ,以
达到降低单组分药物的使用剂量和副作用已成为药物
学的研究新方向 ,因此 ,本实验探讨将茶多酚与 GSE
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第 三 军 医 大 学 学 报
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE
Vol.33, No.1
Jan.15 2011
DOI :10.16016/j.1000-5404.2011.01.028
联合应用后对变异链球菌的抗菌作用关系 ,及其对变
异链球菌生长和产酸的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
茶多酚由湖南金农开发有限公司提供 , 纯度在 99%以上;
康漱洁葡萄柚漱口液由福建福泽医药器械科技有限公司提供 ,
含 1 500 mg/L的 GSE;洗必泰漱口液由深圳南粤药业有限公司
提供 , 含氯已定 0.12%。
TPY液体培养基 [ 1.5%胰蛋白胨 , 0.4%酵母提取物 , 1%
葡萄糖 , 0.6% KH2PO4 , 0.2% K2HPO4 3H2O, 0.2% Na2CO3 ,
0.2% NaCl, pH7.0] ;TPY固体培养基 [含 1.25%琼脂的 TPY
液体培养基 ] 。
变异链球菌国际参考标准株(ATCC25175)由四川大学华
西口腔医学院龋病研究室惠赠。
1.2 方法
1.2.1 实验菌株及菌液制备 冻存的变异链球菌标准株经
TPY平板常规复苏 , 传代 , 厌氧培养(37 ℃, 80%N2 , 10%CO2 ,
10%H
2
)24h,经染色镜检证实为纯培养后 ,挑取 3个菌落接种
于 5 ml液体 TPY培养基 , 厌氧培养 6 h至对数期生长期 , 调节
菌液浓度为 D(630)为 1.0,约含菌量 1×108 CFU/ml。
1.2.2 确定单组分药物的 MIC值
1.2.2.1 确定茶多酚 MIC值 将 1.1中茶多酚溶于含 1%
葡萄糖的 TPY液体培养基中 , 使茶多酚稀释后的浓度分别为
4、3.2、2、 1、 0.5、0.25 mg/ml。在试管架上排列 9支试管 , 前 6
支分别加入上述不同浓度的茶多酚 2ml。每管分别加入 1.2.1
所预备好的菌液 20μl,此时菌液浓度为 1 ×106CFU/ml。并设
置阳性对照(洗必泰加菌液)、阴性对照(液体 TPY加菌液)及
空白对照(液体 TPY,不加菌液)。 37 ℃厌氧培养 24 h后 ,观察
结果 , 以肉眼观察无细菌生长为其 MIC值。实验重复 3次。
1.2.2.2 确定 GSE的 MIC值 同 1.2.2.1中方法确定 GSE
的 MIC值。
1.2.3 棋盘稀释法
1.2.3.1 方法 在试管架上横排排列 6支试管 , 纵排排列 6
支试管 , 取浓度分别为 4、 3.2、2、 1、 0.5、 0.25 mg/ml的茶多酚
1 ml从横排加入;浓度分别为 93.75、 75、46.88、 23.44、11.72、
5.86 mg/LGSE1 ml从纵排加入 , 此时茶多酚的终浓度分别为
2、1.6、1、0.5、0.25、0.125 mg/ml, GSE的终浓度分别为 46.88、
37.5、23.44、11.72、5.86、2.93mg/L。将两药液充分混匀后 ,每管分
别加入预备好的菌液 20 μl, 此时菌液浓度为 1 ×106 CFU/ml。
并设置阳性对照 、阴性对照及空白对照组。 37℃厌氧培养 24 h
后 , 观察结果 ,实验重复 3次。
1.2.3.2 联合用药效果评价 根据联合药敏管与单独药敏
管的抑菌情况 , 计算分级抑制浓度 (fractionalinhibitoryconcen-
tration, FIC)指数 [ 4] ,从而定量检测二者的抗菌作用关系。
FIC=A药联用时 MIC/A药单测时 MIC+B药联用时
MIC/B药单测时 MIC。
当 FIC≤0.5时 , 两药为协同作用;当 0.5
1.2.4 茶多酚 GSE对变异链球菌产酸能力的影响 根据茶
多酚 、GSE对变异链球菌的 MIC测定结果 , 选取联合实验中
MIC值以下的 4个浓度梯度作检测 , 利用二倍稀释法配制 4个
梯度(即 1/2、1/4、1/8、 1/16 MIC)含 1%葡萄糖的 TPY液体培
养基 , 用 ORION710A型 pH计调定初始 pH值为 7.4,按菌液与
TPY液体培养基 1∶200(体积分数)比例接种变异链球菌 , 37 ℃
厌氧培养 24h。培养结束后 , 离心 , 以 ORION710ApH计测定
上清液的pH值 ,计算培养前后 pH的变化即■pH。实验共分 5
组 , 4个不同浓度茶多酚和 GSE混合液的实验组(即以二倍稀
释法配制低于联合应用时 MIC的 1/2、1/4、1/8、1/16 MIC共 4
个浓度梯度药液)与 1个空白对照组 ,每组 3个平行管。
1.3 统计学处理
茶多酚 GSE联用对变异链球菌产酸影响的实验数据采用
SPSS13.0统计软件进行统计分析 , 选用单因素方差分析的
Dunnett检验 , 在 α=0.05的情况下比较各实验组与对照组之
间有无统计学差异。
2 结果
2.1 单组分茶多酚和 GSE的 MIC值
茶多酚和 GSE单独使用时 , 其 MIC值分别为 2 mg/ml和
46.88mg/ml。
2.2 不同浓度茶多酚和 GSE联用对变异链球菌生长
的影响
茶多酚与 GSE联用时可降低单组分的使用浓度 ,即茶多酚
1 mg/ml联用 GSE37.5 mg/L;或茶多酚 1.6 mg/ml联用 GSE
11.72mg/L均可达到联用时的 MIC。根据公式计算得知:茶多
酚与 GSE联用时的 FIC=0.75,表明茶多酚与 GSE联合应用时
存在增强作用 , 即为相加作用(表 1)。
表 1 不同浓度茶多酚和 GSE联用对变异链球菌生长的影响
茶多酚浓度(mg/ml)GSE浓度
(mg/L) 2 1.6 1 0.5 0.25 0.125
46.88 - - - - - -
37.5 - - - + + +
23.44 - - + + + +
11.72 - - + + + +
5.86 - + + + + +
2.93 - + + + + +
+:肉眼观有菌生长;-:肉眼观无菌生长
2.3 茶多酚 、GSE对变异链球菌产酸能力的影响
选用茶多酚 1 mg/ml, GSE37.5 mg/L联合应用作为两组
份联合应用时的 MIC,以二倍稀释法配制低于此的 4个浓度梯
度药液 , 变异链球菌的产酸能力(培养前后 pH值变化即■pH
表示)随药液浓度的降低而明显增加(图 1)。
a:P<0.05,与对照组比较
图 1 茶多酚和 GSE联合应用对变异链球菌产酸的影响
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3 讨论
随着对茶叶中富含的植物多酚———茶多酚认识的
不断深入 ,如何更好地利用这一绿色资源已成为一项
重要课题。茶多酚又名茶单宁 、茶鞣质 ,是茶叶的主要
成分 ,简称 TP。已有研究报道 ,茶多酚及其主要化学
成分———儿茶素可明显影响变异链球菌的生长 、产酸 、
产胞外多糖及对玻棒的黏附 [ 1, 5] 。本实验结果发现茶
多酚浓度为 2 mg/ml时即能完全抑制变异链球菌的生
长 ,与以往报道相符。其他的一些研究发现 ,茶多酚单
独使用或与木糖醇联用能在口内显著抑制菌斑的形
成 ,菌斑生物膜正是细菌致病的基础 ,因此 ,茶多酚用
于菌斑控制具有良好的前景 。然而 ,由于唾液中含有
富含脯氨酸的蛋白质 ,这种蛋白质能与多酚类物质交
联形成不溶于水的络合物 ,从而引起口腔细胞的收缩 ,
产生涩味 ,且浓度越高的茶多酚苦涩味越明显 。因此 ,
为减轻使用时的苦涩感 ,许多学者探讨将茶多酚与其
他药物联合应用 ,期望能通过多种药物联用 ,从而能降
低单种药物的使用浓度 ,即降低茶多酚的浓度来改善
其苦感 ,同时也希望能达到相当的或更强的抑菌效果。
GSE是近年来研究较多的另一种天然提取物 ,化学分
析发现其含有黄酮类 、维生素 C、生育醇 、柠檬酸 、柠檬
苦素类似物 、橘皮苷 、柑桔黄素 、甾酮和矿物质等。
GSE对革兰阳性和阴性细菌均有较高的抑菌活性;且
对真菌 、莱姆疏螺旋体等有很好的杀灭效果 [ 6-7] 。对
GSE漱口液的临床研究和问卷调查显示 , GSE漱口液
的口感较好 、无着色现象 、对黏膜刺激性小 ,大多数受
试者乐于接受 ,但其抑制菌斑的能力弱于洗必泰[ 3] 。
茶多酚与 GSE的混合液性质稳定 ,因此二者联用
无化学反应的配伍禁忌。本实验将这两种天然药物进
行配伍研究 ,希望通过二者可能潜在的相加或协同作
用来达到降低单组分药物的使用浓度 ,增强抑菌效果 ,
以弥补二者单独使用时的不足 。研究结果显示二者联
用对抑制变异链球菌的体外生长具有相加作用 。推测
可能原因有:一方面茶多酚能特异性地凝固细菌蛋白 、
与细菌遗传物质 DNA结合 ,从而改变细菌生理 ,使细
菌细胞壁破坏 ,细菌解链来抑制其生长 [ 5, 8] 。而 GSE
对细菌的抑菌机制主要是扰乱细胞膜与膜蛋白的结
构 , 破坏细菌的胞膜从而达到杀菌和抑菌的效
果 [ 9-11] 。二者对细菌胞膜的破坏作用可能具有相加
效应。另一方面茶多酚与 GSE含有某些共同的成分 ,
其共同作用于细菌达到更强的抑菌效果 ,如在抑菌中
起主要作用的黄酮类等多酚类物质。
本研究还观察了不影响细菌生长的 1/2 MIC、1/4
MIC、1/8 MIC及 1/16 MIC混合液(混合液 MIC,即联
合用药的 MIC为茶多酚 1mg/ml配伍 GSE37.5mg/L)
共 4个浓度梯度药物对变异链球菌产酸能力的影响 ,
发现茶多酚 GSE配伍后随着浓度的降低 ,变异链球菌
的■pH值增加 ,表明二者配伍对变异链球菌产酸能力
的抑制具有浓度相关性 。茶多酚 GSE联合应用能明
显抑制变异链球菌的产酸能力 ,且较以往实验报道的
单组分茶多酚的抑制能力更强[ 1, 12] 。推测二者配伍后
抑制变异链球菌产酸的机制有:①抑制 GTF活性 。②
抑制胞内多糖的产生。③抑制唾液淀粉酶活性。
本研究结果提示茶多酚与 GSE配伍使用 ,不仅可
以减小混合液中茶多酚的浓度从而改善由于浓度高所
引起的苦涩口感 ,而且还可以更有效抑制变异链球菌
的生长和产酸。由于致龋菌产生的酸是导致龋病发生
的根本原因 ,因此茶多酚与 GSE混合液在龋病的预防
中有较高的开发价值 ,但由于本实验仅是针对浮游状
态变异链球菌的体外实验 ,而龋病是多种细菌混合感
染的结果 ,且致龋菌在人体口腔内是以复杂的生物膜
形式存在 ,因此茶多酚与 GSE混合液对生物膜的抑制
作用及口内使用效果等都还需进一步的研究探讨。
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(收稿:2010-09-04;修回:2010-10-11)
(编辑 王小寒)
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