全 文 ：细菌的存在是龋病发生的先决条件， 变异链
球菌（变链菌）凭借其强大的产酸能力、耐酸能力
和附着能力，被公认为是最主要的致龋菌 ［1］。因此，
使用抗菌制剂抑制其生长、 降低其致龋能力已成
为龋病预防的重要环节。 人工合成抗菌剂效果比
较肯定，但长期使用会产生耐药性、菌群失调等缺
点， 不良反应相对较少的天然植物抗菌剂逐渐进
入人们的视野。
葡萄柚提取物（grapefruit seed extract，GSE）作
为一种新型抗菌制剂，近来备受各界关注。 实验研
究显示，GSE 可有效对抗的细菌和病毒达 800 株
以上，真菌达 100 株以上，并且对大量单细胞和多
细胞的寄生虫也有切实的抑制作用 ［2－4］，前期研究
亦显示葡萄柚提取物漱口液能有效抑制体内菌斑
的形成 ［5］。本研究拟采用体外实验观察葡萄柚漱口
液对变链菌的抗菌效果， 同时扫描电镜下观察其
作用后细菌的变化， 进一步探索葡萄柚漱口液可
能的抗菌机制。
葡萄柚漱口液对变异链球菌抗菌机制的研究
钟 声，刘建党，黄晓晶*，江 山，卢国英
（福建医科大学附属口腔医院牙体牙髓科，福建 福州 350002）
［摘 要］ 目的：研究葡萄柚漱口液对变异链球菌的抗菌活性，初步探讨其抗菌机制。 方法：采用液体稀释法测定葡萄柚漱口
液对变异链球菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）；同时扫描电镜下观察葡萄柚漱口液对变异链球菌细胞壁的影
响。 结果：葡萄柚漱口液对变异链球菌的 MIC 为 46．875 mg ／ L，MBC 为 93．75 mg ／ L。 扫描电镜观察显示，葡萄柚漱口液处理后的
变异链球菌出现细胞壁破裂，内容物溢出。 结论：葡萄柚漱口液对体外培养的变异链球菌有明显的抑制和杀灭作用，其抑制机
制可能与葡萄柚提取物破坏细胞壁结构的完整性有关。
［关键词］ 龋病；变异链球菌；葡萄柚提取物；漱口液；细胞壁
［中图分类号］ R780.1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1007-4368（2011）04-503-04
In vitro study of antibacterial activity and mechanism of grapefruit seed extract mouth-
wash on Streptococcus mutans
ZHONG Sheng，LIU Jian-dang，HUANG Xiao-jing*，JIANG Shan，LU Guo-ying
（Department of Endodontology，Affiliated Stomatological Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350002，
China）
［Abstract］ Objective：To investigate the antibacterial activity of grapefruit seed extract mouthwash against Streptococcus mutans and
explore the potential mechanism． Methods：The minimal inhibitory concentration（MIC） and the minimal bactericidal concentration
（MBC） of the grapefruit seed extract mouthwash against S．mutans were detected using double dilution． And the cell wall alteration of S．
mutans treated with grapefruit seed extract mouthwash was observed by using a scanning electron microscope（SEM）． Results：The MIC
and MBC determined for grapefruit seed extract mouthwash were 46．875 mg ／ L and 93．75 mg ／ L． Both rupture of the cell wall and re-
lease of the intracellular components were observed in the grapefruit seed extract mouthwash-treated group by SEM． Conclusion：The
grapefruit seed extract mouthwash can inhibit the growth of S．mutans and kill them in vitro，this suggests that grapefruit seed extract
mouthwash has an antibacterial action on the S．mutans by affecting the normal structure and function of the cell wall of S．mutans．
［Key words］ caries；Streptococcus mutans；grapefruit seed extract；mouthwash；cell wall
［Acta Univ Med Nanjing， 2011， 31（4）: 503-506］
［基金项目］ 福建省自然科学基金（2008J0281）；福建省
医学创新课题资助（2009-CXB-36）
*通讯作者，E-mail：hxiaoj＠163．com
第 31 卷第 4 期
2011 年 4 月
南京医科大学学报（自然科学版）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING（Natural Science） 503· ·
南 京 医 科 大 学 学 报
第 31 卷第 4 期
2011 年 4 月
图 1 不同浓度葡萄柚漱口液作用 48 h 变链菌生长情况
Fig 1 Effect of grapefruit seed extract mouthwash on the growth
of S．mutans after 48 h
1 材料和方法
1．1 材料
变链菌国际参考标准株（ATCC 25175）由四川
大学华西口腔医学院龋病研究室惠赠。 TPY液体培
养基（1．5％胰蛋白胨、0．4％酵母提取物、1％葡萄糖、
0．6％ KH2PO4、0．2％ K2HPO4·3H2O、0．2％ Na2CO3、
0．2％ NaCl，pH7．0）；TPY 固体培养基（含 1．25％琼脂
的 TPY 液体培养基）；PBS 缓冲液（pH7．4～7．6，福州
迈 新 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司 ， 产 品 批 号 ：
09031901）；康漱洁葡萄柚漱口液（福建福泽医药器
械科技有限公司， 含 GSE 1500 mg ／ L， 产品批号：
10012301）；西吡氯铵漱口液（南京恒生制药厂，含
西吡氯铵 1000 mg ／ L，产品批号：090707）；超净工作
台（上海力申科学仪器有限公司）；厌氧培养箱（上
海新苗医疗器械制造有限公司）； 聚苯乙烯培养皿
（Dow Corning，德国）；全自动酶联免疫测定仪（Hu-
man，德国）；扫描电镜（XL30ESM，FEI Co，荷兰）。
1．2 方法
1．2．1 细菌培养
将－20℃甘油保存的标准菌株接种于 TPY 固体
培养基上复苏， 厌氧培养 （37℃，80％N2、10％CO2、
10％H2）24 h 后传代，涂片检查为纯培养后，用湿无
菌棉签收集平板菌落于 PBS 液中，紫外分光光度法
调节菌浓度为 A630＝1．0左右，制成菌悬液备用。
1．2．2 抑菌实验和杀菌实验
实验组 ： 采用二倍稀释法 ， 用 37℃预热的
TPY 液体培养基将滤膜除菌的葡萄柚漱口液倍比
配 置 成 750．00000、375．00000、187．50000、93．75000、
46．87500、23．43750、11．71875 mg ／L 共 7 个浓度组 ，
各取 1 ml，分别加入 50 μl配置好的菌悬液。阳性对
照组： 用 37℃预热的 TPY 液体培养基 1 ml 和滤膜
除菌的西吡氯铵漱口液原液 1 ml 充分混匀后，吸出
1 ml 后加入 50 μl 菌液。 阴性对照：加入 TPY 液体
培养基 1 ml 和菌液 50 μl。 空白对照：含 TPY 液体
培养基 1．05 ml，每组各浓度均设置 5个重复管。
上述各实验组和对照组厌氧培养 48 h，比浊法
观察细菌生长情况，细菌不生长的最小浓度为对变
链菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentra-
tion，MIC）。测量各个试管 630 nm波长处的 A值，绘
制细菌生长曲线并计算抑菌率。 抑菌率计算公式＝
（A 阳性－A 样本） ／ （A 阳性－A 空白）×100％。
将肉眼观察未见细菌生长的各管培养物混匀
后各吸取 10 μl 滴于 TPY 固体培养基上，用无菌三
角形玻棒均匀涂布接种，每管培养物涂布 3 个固体
培养基，厌氧培养 48 h 观察结果，平板上的菌落少
于 5 个的最小稀释度的药物浓度即最小杀菌浓度
（minimal bactericidal concentration，MBC）。测定重复
3次，取均值。
1．2．3 扫描电镜观察
在直径 100 mm 的培养皿内放入 1 cm×1 cm 灭
菌盖玻片，实验分空白组和实验组。 空白组在 37℃
预热的含 1％蔗糖的 TPY 培养基 20 ml 中加入菌液
500 μl，实验组将菌液 500 μl 加至添加 93．75 mg ／ L
葡萄柚漱口液的含 1％蔗糖的 TPY 培养基 20 ml
中，厌氧培养 24 h 后，小心取出盖玻片，用 1 ml PBS
轻洗去除黏附松散细菌，重复 2次；立即放入 2．5％戊
二醛溶液中，4℃下固定 2 h，脱水，临界点干燥真空喷
金，置于扫描电镜下观察。每组培养 4个标本，每个标
本均分 4个象限观察，每个象限随机观察 3个视野。
2 结 果
2．1 葡萄柚漱口液对变链菌 MIC 和 MBC 的测定
结果
由图 1 可见， 当葡萄柚漱口液的浓度≥46．875
mg ／ L时，曲线低平，细菌生长被抑制；当葡萄柚漱口
液的浓度＜46．875 mg ／ L 时，随着葡萄柚漱口液浓度
的降低，对细菌的抑制作用逐渐减弱，生长曲线逐
渐上升，曲线的拐点在 46．875 mg ／ L。 培养 48 h，浓
度 为 187．5000、93．7500、46．8750、23．4375 mg ／ L 的
葡萄柚漱口液对变异链球菌的抑制率分别为
99．78％、96．76％、86．82％、16．27％。
孵育 48 h后，葡萄柚漱口液的浓度≥93．75 mg ／ L
的培养板上未观察到菌落的生长；葡萄柚漱口液浓
度＜93．75 mg ／ L时可见大量针点大小的菌落生长。
结合图 1可知， 葡萄柚漱口液对变链菌的 MIC
为 46．875 mg ／ L，MBC为 93．75 mg ／ L。
1．6
1．4
1．2
1．0
0．8
0．6
0．4
0．2
0
变
链
菌
培
养
48
h
后
A
值
750 375 187．5 93．75 46．875 23．4375 11．71875
葡萄柚漱口液浓度（mg ／ L）
0
504· ·
图 2 扫描电镜观察葡萄柚漱口液作用变链菌 24h后的形态
Fig 2 SEM micrographs of S．mutan cultured with grapefruit
seed extract mouthwash for 24 h
2．2 葡萄柚漱口液对变链菌影响的扫描电镜观察
阴性对照组在扫描电镜下可见菌细胞外形清
晰，细菌表面光滑，无任何缺损。 而实验组可见细菌
明显变形，失去原有形态；部分细菌细胞壁表面变
粗糙，出现空洞；部分细菌细胞壁和细胞膜已破裂，
内容物溢出（图 2）。
3 讨 论
葡萄柚漱口液的主要成分为 GSE，是由橘掾植
物水果葡萄柚肉和仁提取而成。 研究表明，GSE 在
极低浓度时就可取得明显的杀菌效果，它不仅可以
抑制多种 G＋和 G－细菌 ［2，6］、真菌［7］、病毒与寄生虫［7］，
而且可降低肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、 核因子-κB
（NF-κB）和一氧化氮（NO）水平，保护胃肠道以抵抗
机械压力，还具有抗过敏和其他抗氧化作用 ［8－10］，在
世界各地得到广泛应用。
本实验采用试管液体稀释法 （二倍稀释法）测
定了葡萄柚漱口液对变链菌的抗菌能力， 结果显
示， 当葡萄柚漱口液的浓度≥46．875 mg ／ L 时试管
内液体完全清亮，摇匀后仍清亮，未见细菌生长，显
示对变链菌明显抑制作用； 当其浓度≥93．75 mg ／ L
时显示出杀菌作用。
为进一步明确 GSE 的抗菌机制，本实验通过扫
描电镜观察了变链菌的形态学变化， 结果显示：经
葡萄柚漱口液作用后， 变链菌表面结构被破坏，表
现为细菌明显变形； 部分细菌细胞壁表面变粗糙，
凹陷，出现空洞；部分细菌细胞壁和细胞膜已破裂，内
容物溢出。 Heggers 等［2］在实验中将稀释至 1∶512的
GSE作用于表皮葡萄球菌和绿脓假单胞菌 15 min，即
出现了胞膜的破坏和胞内成分的外泄。 Brorson等［3］
的研究亦表明，GSE 对莱姆疏螺旋体的杀灭作用表
现为高浓度时使细菌和包囊完全破坏，仅剩下一小
部分不典型的碎片；低浓度时，包膜肿胀膨大和破
裂，内容物泄漏。 这些都证实了 GSE 的抗菌机制是
由于其破坏了微生物细胞壁和细胞膜的结构，胞内
成分外泻，致使细菌无法存活。
但目前，有关葡萄柚提取物中究竟何种活性成
分在发挥作用仍存在争议。
一些学者认为 GSE中的多酚类物质特别是其中
的类黄酮发挥了主要作用。 化学分析发现，GSE含有
类黄酮［3－4，7，11－12］（如橙皮苷、白藜芦醇、柚皮苷等）、维生
素 C、维生素 E、柠檬酸、柠檬苦素、甾醇和矿物质等［4］，
类黄酮及其复合物含量可达 50％以上［12］。而酚在非离
子状态下，能穿透菌细胞壁的脂性成分，致膜结构破
坏，通透性增加，达到抑菌和杀菌的效果；另外，由于
多酚可与蛋白和多糖形成复合物，因此聚合的多酚可
与细菌表面成分结合，抑制胞外酶或胞联酶，如膜转
运蛋白等，使这些与细菌代谢有关的酶失活；此外，
多酚还可结合金属离子，通过多酚与金属离子的络
合，金属离子减少，也可能会抑制细菌的生长［13］。
另一些学者则认为，GSE 中发挥作用的主要活
性成分是季铵类化合物。 这些季铵化合物可能由
GSE 中不稳定的多酚类物质经化学转化而成 ［12］，也
可能由商品制造过程添加的防腐剂残留所致 ［14－15］。
作为阳离子表面活性剂，它们可以静电方式结合到
细菌表面，待吸附于细菌表面后，使细菌细胞壁的
通透性增加，胞浆逸出，达到抑菌和杀菌作用［16］。
通过本研究证实，葡萄柚漱口液可通过破坏细
胞膜和胞壁达到确切的抑制和杀灭变异链球菌的
效果，因而应当能够在防龋中发挥一定的效果。 但
其中具体是哪一种或多种活性成分起作用目前尚
不得而知，仍需进一步深入研究。
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空白组（×50 000）
实验组（×50 000）
钟 声等：葡萄柚漱口液对变异链球菌抗菌机制的研究
第 31 卷第 4 期
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南 京 医 科 大 学 学 报
第 31 卷第 4 期
2011 年 4 月
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