全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 19 食品科学 ※基础研究88
茶枝柑皮多糖的分离纯化及单糖组成分析
陈 思 1 ,2，黄庆华 1 ,*，李娆玲 1，甘伟发 1，源翰祺 1
(1. 广东药学院药科学院，广东 广州 510006；
2. 健康元药业集团股份有限公司，广东 深圳 518057)
摘 要：采用酸水法从茶枝柑皮中提取多糖，经D-201阴离子交换树脂脱色、Sevag法脱蛋白，透析、冻干后得
茶枝柑皮多糖，再用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析及Sephadex G-100凝胶柱层析分离得到组分CPA-Ⅰ。
单糖经 1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后采用高效液相色谱法对多糖组成进行研究，凝胶分子排阻色谱法
鉴定其纯度并测定其相对分子质量，紫外、红外光谱法对结构进行初步分析。结果表明：茶枝柑皮多糖 CPA-Ⅰ
不含蛋白，重均相对分子质量为 7.96× 104，主要由半乳糖醛酸和阿拉伯糖组成，是羧酸酯化的半乳糖醛酸多聚糖。
关键词：茶枝柑皮；多糖；分离纯化；单糖组成
Isolation, Purification and Monosaccharide Composition Analysis of Citus reticulata Peel Polysaccharides
CHEN Si1,2，HUANG Qing-hua1,*，LI Rao-ling1，GAN Wei-fa1，YUAN Han-qi1
(1. College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China；
2. Joincare Pharmaceutical Industry Group Co. Ltd., Shenzhen 518057, China)
Abstract ：Polysaccharides were extracted from dried powder of Citus reticulata peel with acidic water, followed by pigment
removal on D-201 ion exchange resin, protein removal by Sevag, s method, dialysis and freeze-drying. The CPA-I fraction was
achieved by sequential column chromatographies on DEAE-sepharose fast flow and Sephadex G-100. Monosaccharide compo-
sition analysis of CPA-I was carried out by HPLC based on pre-column derivatization with 1-phenyl-3-methy1-5-pyrazolone
(PMP). High performance size exclusion chromatography (HPSEC) was used for purity analysis and relative molecular weight
determination. UV-visible and infrared (IR) spectral analyses were conducted for structural characterization. The results showed
that the molecular weight of CPA-I with high purity was 7.96×104, and the monosaccharide composition of the polysaccharide
was composed of galacturonic acid and arabinose. The IR spectrum indicated that CPA-I was a galacturonic acid polysaccharide
esterified by carboxylic acid.
Key words：Citus reticulata peel；polysaccharide；isolation and purification；monosaccharide composition
中图分类号：TQ929.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)19-0088-04
收稿日期：2011-06-30
基金项目：广东省教育厅大学生创新实验项目(1057310008)
作者简介：陈思(1984—)，女，实验员，硕士，主要从事药品质量研究。E-mail：py_simone @163.com
*通信作者：黄庆华(1954—)，女，教授，学士，主要从事中药保健食品的提取开发与质量控制研究。E-mail：hqh1003@tom.com
茶枝柑皮是茶枝柑(Citrus reticulata Chachi)的成熟
果皮，是广东道地药材广陈皮的来源，也是国家卫生
部确定的药食两用的中药品种。茶枝柑皮的主要成分除
了含有挥发油、黄酮类化合物外，还含有丰富的果胶多
糖。多糖有广泛的生理活性作用，如抗氧化、抗衰老[1 ]、
抗肿瘤[2]等，现代药理研究表明柑橘果胶多糖能够调节
血脂(影响机体对胆固醇的吸收、胆汁酸的分泌) [3 ]，预
防肿瘤的生长及转移[4 ]、抑制癌细胞的生长[5 ]，且对脂
多糖 LPS诱导的炎症反应有抑制作用[6]。多糖的生理活
性与结构紧密相关[7]，而其结构和相对分子质量与其植
物来源、组织部位、成熟度及提取方法等有关。已有
文献报道茶枝柑皮多糖的体外抗氧化作用[8]，但对其组
成的研究未见报道，本研究从茶枝柑皮中提取果胶多
糖，经脱色、脱蛋白后再分离得到一种酸性多糖，用
凝胶色谱、高效液相柱前衍生化、紫外及红外光谱法
对其组成进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶枝柑皮(果实于 2009年 12月采自广东省翁源县坝
仔镇溪江村)，经广东药学院药用植物与中药鉴定学系
李书渊教授鉴定为茶枝柑(Citri reticulata Chachi)的干燥
89※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 19
成熟果皮。茶枝柑皮多切成基部相连的 3瓣，瓣片边缘
常反卷，表面可见密布细密而均匀的凹孔状油室，对
光照射可见油室孔眼清晰透亮，质柔软，不易折断，
气清香，味甘微辛 [ 9 ]。
DEAE-Sepharose Fast Flow填料、Sephadex G-100
填料 美国GE公司；对照单糖 上海源聚生物科技有
限公司；8000～12000 D透析袋 广州市齐云生物技术有
限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯 Dikma公司；1-苯
基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮(PMP) 阿拉丁试剂公司；其余
试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1200 Series高效液相色谱仪 美国Agilent公
司；PHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂；GLZ-0.2B冷
冻干燥机 上海浦东冷冻干燥设备有限公司；傅里叶变
换红外光谱仪 美国 PerkinElmer公司；UV-2500紫外 -
可见分光光度计 日本 Shimadzu公司。
1.3 茶枝柑皮多糖的提取[10]
称取干燥过 60目筛的茶枝柑皮粉 2.5kg，加入 25L
无水乙醇 60℃水浴回流提取 2次，每次 2h，滤渣挥干
后加 30倍量(m/V)pH4的盐酸水溶液于 90℃水浴中提取 2
次，每次 90min，合并提取液，旋蒸浓缩至 1/3体积左
右，加入 3 倍量 9 5% 乙醇，4℃静置过夜，离心分离
得多糖沉淀，真空干燥得茶枝柑皮粗多糖(CCP)。
1.4 茶枝柑皮粗多糖的分离纯化
1.4.1 离子交换树脂脱色[11]
称取茶枝柑皮粗多糖(CCP)适量，配成 2mg/mL溶
液，加入 8g/100mL D-201阴离子交换树脂，于 75r/min
的恒温振荡器中 40℃脱色 2h，过滤，取滤液得脱色多
糖溶液。
1.4.2 Sevag法除蛋白[12]
在脱色多糖溶液中加入1/3体积的氯仿 -正丁醇(体积
比 4:1)混合液，充分振荡 30min后分液漏斗静置分层，
中间层为变性蛋白层，下层为氯仿 -正丁醇混合液，收
集上清多糖溶液层，重复操作 6 次，上清液透析、浓
缩、冷冻干燥，得茶枝柑皮纯化多糖( C P )。
1.4.3 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的分离纯化
称茶枝柑皮纯化多糖(CP)1.0g，加入 50mL 0.05mol/L
的 Tris-HCl溶液溶解，上样于平衡好的DEAE-Sepharose
Fast Flow(2.6cm× 60cm)层析柱，依次用 0.05mol/L Tris-
HCl、0.075mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl和0.125mol/L NaCl
洗脱，流速 1.0mL/min，分步收集，每管 15mL。用苯
酚 - 硫酸法检测，分别对应收集得到 4 个组分，为 A、
B、C、D。将B组分上 Sephadex G-100(2.0cm× 100cm)
柱纯化，流速为 0.5mL/min，收集多糖组分，蒸馏水透
析 2 4 h，浓缩、冻干得 C P A -Ⅰ。
1.5 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的单糖组成分析
茶枝柑皮多糖的水解：精密称取茶枝柑皮多糖组分
CPA-Ⅰ25mg于安瓿瓶中，加入 4.0mL 2mol/L三氟乙酸
(TFA)溶液，氮气封管后于 120℃水解 2h，加甲醇旋干，
重复 3～4次，加水溶解并稀释定容到 10.0mL。
单糖衍生物制备：PM P使用前用纯甲醇重蒸。参
考Honda等[13]的衍生化方法并作适当改进：取各对照单
糖适量、多糖水解液各 500μL于具塞试管中，依次加
入500μLPMP-甲醇溶液(0.5mol/L)和NaOH溶液(0.3mol/L)，
混匀，70℃水浴反应 40min，取出放置 10min冷却至室
温，再加入 500μL 0.3mol/L HCl中和，混匀后再加入
500μL氯仿涡旋萃取、离心，重复 3 次，弃下层有机
相，上层水相经 0.45μm 微孔滤膜过滤，
色谱分析条件：色谱柱：Phenomenex Luna C 18
(250mm× 4.60mm，5μm)；流动相：20%乙腈 -0.05mol/L
磷酸盐缓冲溶液(pH7.1)；流速：1.0mL/min；检测波
长：2 4 5 n m；柱温：30℃；进样体积：2 0μL。
1.6 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的相对分子质量测定
将已知相对分子质量的葡聚糖标准品分别用流动相
配制成 1.0mg/mL溶液，进样量为 20μL，将标准葡聚
糖相对分子质量的对数(lgMw)对洗脱体积进行回归处理，
得到葡聚糖标准曲线。将茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)配制成
1.0mg/mL 的溶液，进样 20μL，测定多糖样品的保留时
间，利用标准曲线求出多糖相对分子质量。
色谱条件：多糖标准为Dextran系列 (Mw5200～
1482000)；色谱柱为 TSK G-5000 PWxL 凝胶柱和 TSK
G-3000 PWxL凝胶柱(串联)；流动相为 0.02mol/L KH2PO4
溶液；流速 0.6mL/min；柱压 518psi；柱温 35℃；进
样量 20μL；Waters 2414示差折光检测器。
1.7 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的紫外、红外光谱测定
将茶枝柑皮多糖CPA-Ⅰ配成 0.1mg/mL的溶液，用
紫外 -可见分光光度计在波长 200～600nm范围内进行紫
外扫描。多糖在红外干燥箱中去除水分后，与 K Br 混
合压片，于 4000～400cm-1范围内采用傅里叶变换红外光
谱仪进行红外光谱检测。
2 结果与分析
2.1 茶枝柑皮多糖的分离纯化
经脱色、脱蛋白后的茶枝柑皮多糖为淡黄色丝状固
体，极易溶于缓冲溶液，不溶于乙醇、乙醚等有机溶
剂。考察DEAE-Sepharose F.F柱层析 0～0.5mol/L NaCl
线性洗脱浓度，再根据线性洗脱曲线尝试进行分步洗
脱。图 1线性洗脱曲线表明茶枝柑皮多糖CP 在NaCl浓
度低于 0.5mol/L时已完全洗脱下来。由图 2可知，分步
梯度洗脱 Tris-HCl和 0.075、0.1、0.125mol/L NaCl则分
离得到 4个组分，其中 0.075mol/L NaCl洗脱组分B的量
2011, Vol. 32, No. 19 食品科学 ※基础研究90
最多，再将B组分按相对分子质量大小进行凝胶柱层析
纯化，得到茶枝柑皮多糖CPA-Ⅰ，洗脱曲线如图 3所示。
2.2 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的相对分子质量
以标准葡聚糖相对分子质量的对数 lgMw对洗脱体积进
行回归，标准曲线方程为 lgMw＝ 61.5－ 10.1V＋ 0.61V2－
0.01V3，r＝ 0.9997。由标准曲线求得CPA-Ⅰ的相对分
子质量分别为Mn＝ 39853、Mw＝ 79587、Mp＝ 46163、
Mn/Mw＝ 2.0。由图 4可知，洗脱峰为单一对称峰，表
明组分 CPA-Ⅰ纯度高。
2.3 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的单糖组成分析
PMP柱前衍生化法是以 PMP作为衍生化试剂，与
还原糖进行定量反应，反应条件温和，生成的衍生化
产物在 245nm波长处有强烈的紫外吸收，产物不易裂
解，且分析时不产生异构峰，不论是对中性糖还是酸
性糖、碱性糖均有响应。经 P M P 衍生化后，糖链带
上疏水基团，样品疏水性提高，用常规的紫外检测器
和 C 18烷基键合柱，可进行多糖单糖组成测定的高效液
相色谱分析。
由图 5可知，CPA-Ⅰ主要由半乳糖醛酸和阿拉伯糖
组成，还有一些半乳糖及极少量的甘露糖、鼠李糖。
各单糖物质的量比是Man: Rib: Rha: GalUA: Glc: Gal: Ara =
1.1: 0.17: 0.60: 127.8: 1: 12.3: 26.86。
2.4 茶枝柑皮多糖(CPA-Ⅰ)的紫外和红外光谱分析
由图 6可知，由于在波长为 260、280nm附近的吸
收曲线平坦，没有蛋白质的吸收峰，说明纯度较高，
几乎不含蛋白质成分。
图 1 茶枝柑皮多糖线性梯度洗脱
Fig.1 Elution profile of crude Citus reticulata peel polysaccharides on
DEAE-sepharose fast flow column in the linear gradient mode
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
－0.5
A4
89
nm
试管数
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
－0.1
N
aC
l浓
度
/(m
ol/L
))
图 2 茶枝柑皮多糖分步梯度洗脱
Fig.2 Elution profile of crude Citus reticulata peel polysaccharides
on DEAE-sepharose fast flow column using 0, 0.075, 0.1 mol/L and
0.125 mol/L NaCl as elution solvent
4
3
2
1
0
A4
89
nm
试管数
0 40 80 120 160 200
0.20
0.15
0.10
0.50
0
N
aC
l浓
度
/(m
ol/L
))
0.075
0.1
0.125
图 3 组分 B的 Sephadex G-100洗脱曲线图
Fig.3 Elution profile of fraction B on Sephadex G-100
4
3
2
1
0
A4
89
nm
试管数
0 10 20 30 40 50 60 70
图 4 茶枝柑皮多糖 CPA-Ⅰ的高效凝胶色谱图
Fig.4 HPSEC chromatogram of CPA-Ⅰ
1.5
1.0
0.5
0.0
－0.5
m
V
试管数
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
46
16
3
5 10 15 20
A
1
2
3 4
5
6 7 8
A.对照单糖的 PMP衍生物图；B.茶枝柑皮多糖CPA-Ⅰ
的 P M P 衍生物图；1 .甘露糖( M a n)；2.核糖(Rib)；
3.鼠李糖(Rha)；4.半乳糖醛酸(GalUA)；5.葡萄糖(Glc)；
6.半乳糖(Gal )；7 .木糖( Xy l )；8 .阿拉伯糖 ( A r a)。
图 5 对照单糖与 CPA-Ⅰ的 PMP衍生物高效液相色谱图
Fig.5 HPLC chromatogram of PMP-derivatized standard monosaccha-
rides and CPA-Ⅰ
4
5 10 15 20 25
B
1 2 3 5
6 8
91※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 19
由图 7 可知，C P A -Ⅰ具有多糖典型的吸收峰，
3401.03cm-1的宽峰是多糖游离氢键上的O－H伸缩振动；
2952.68cm-1肩峰为C－H键的伸缩振动。1745.90cm-1则
是糖醛酸的甲酯化的C＝O伸缩振动吸收峰；1618.18cm-1
是游离－COO－的C＝O非对称伸缩振动，1058.57cm-1
则为吡喃环脂肪醚键 C － O － C 的 C － O 伸缩振动，
1372.54、1330.72cm-1是C＝O对称伸缩振动；1440.68cm-1
是－COOH的C－O伸缩振动；913.54、763.42cm-1吸收峰
提示CPA-Ⅰ的单糖是以吡喃环糖的形式存在，833.35cm-1则
是吡喃糖α端基差向异构的C－H变角振动引起。综上
所述，推测CPA-Ⅰ是羧酸酯化的半乳糖醛酸多聚糖，结
构中存在α-构型糖苷键。
3 结 论
本研究利用酸水提醇沉法从经无水乙醇脱脂后的茶
枝柑皮粉中提取粗多糖，经D-201阴离子交换树脂脱色
及 Sevag 法脱蛋白后得到纯化多糖 CP，通过 D EA E-
Sepharose Fast Flow离子交换柱层析及Sephadex G-100凝
胶柱层析分离得到组分 CPA-Ⅰ。经高效凝胶色谱鉴定其
为纯度较高的组分，重均相对分子质量为 7.96× 10 4，
单糖组成分析表明主要由半乳糖醛酸和阿拉伯糖组成，
还有一些半乳糖及极少量的甘露糖、鼠李糖，各单糖
物质的量比是Man: Rib: Rha: GalUA: Glc: Gal: Ara＝1.1:
0.17: 0.60: 127.8: 1: 12.3: 26.86。紫外光谱及红外光谱分析
则表明CPA-Ⅰ不含蛋白，并且是羧酸酯化的半乳糖醛酸
多聚糖，结构中存在α- 构型糖苷键，推测茶枝柑皮多
糖CPA-Ⅰ的主链骨架结构是多聚半乳糖醛酸，支链部位
存在阿拉伯糖残基[3]，这一结果与日本学者[14]报道的金
橘果胶多糖接近。
参 考 文 献 ：
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图 6 茶枝柑皮多糖组分 CPA-Ⅰ紫外光谱图
Fig.6 UV-visible absorption spectrum of CPA-Ⅰ
3.721
1.707
－0.307
A
波长 /nm
200 400 600
图 7 茶枝柑皮多糖 CPA-Ⅰ的红外光谱图
Fig.7 IR spectrum of CPA-Ⅰ
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
透
光
率
/%
波数 /cm－ 1
4000 3200 2400 1800 1400 1000 600
17.1
34
01
.0
3
20
65
.5
5
29
52
.6
8
17
45
.9
0
16
18
.1
8
14
40
.6
8
15
08
.5
7
13
30
.7
2
12
63
.3
0
10
14
.8
4
83
3.
35
68
9.
86
53
5.
66
13
72
.5
4
11
46
.2
2
12
38
.7
8
11
03
.1
1
10
51
.0
3
91
3.
54
96
2.
67
76
3.
42
63
9.
78