全 文 ：超高效液相色谱法快速并同时检测金柑中柠檬苦素和诺米林
孟 鹏 1，2 郑宝东 1*
（1福建农林大学食品科学学院 福州 350002 2福建省产品质量检验研究院 福州 350002）
摘要 采用超高效液相色谱（UPLC）技术，建立金柑中柠檬苦素和诺米林的快速、同时检测技术。 样品经二氯甲
烷超声波提取，ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分离，以乙腈-水（45∶55）为流动相，
梯度洗脱，流速 0.3 mL/min，柱温 35 ℃，检测波长 215 nm。柠檬苦素和诺米林可在 3 min 内实现同时分离、测定。
柠檬苦素和诺米林分别在 1～1780 μg/mL 和 1～1720 μg/mL 范围内线性关系良好（R2 = 0.9999），方法检出限分别
为 1.65 μg/g 和 1.28 μg/g，加标回收率分别为 97.19%～100.06%和 95.35%～99.83%，相对标准偏差（RSD）均小于
5%。 本法分析时间短，灵敏度高，操作方便，结果准确，适用于金柑中柠檬苦素和诺米林的同时测定。
关键词 超高效液相色谱； 柠檬苦素； 诺米林； 金柑
文章编号 1009-7848（2013）02-0177-05
近年来，金柑果实因其营养丰富，风味独特，
逐渐被消费者接受。 由于金柑中柠檬苦素类化合
物等苦味物质的存在， 所以大大影响金柑产品的
口感。研究表明，若强烈苦味的柠檬苦素和诺米林
在果汁中含量超过 6 mg/L， 则果汁不适宜饮用[1]。
据相关研究报道， 柠檬苦素在水溶液中的苦味阈
值约 6 mg/L，比柚皮苷要苦 20倍[2]。这些苦味物质
虽然影响金柑产品的口感，但其具有抗菌、抗病毒
和抗肿瘤等功能[3-4]，应用价值很高。对金柑中苦味
物质进行研究，不仅有利于金柑的深加工，而且有
利于开发利用金柑中苦味物质。
研究金柑中的苦味物质， 需要一种精确定量
的分析方法。 目前报道的检测方法很多， 主要有
HPLC 法 [5-6]、Davis 法 [7]、TLC 法 [8]、UV 法 [9]、RIA 法
等[10]。以上方法中 Davis法测定步骤繁琐；UV法仅
适于对柠檬苦素类化合物总量的测定；TLC 法因
依靠目测定量，测试结果误差较大；RIA 法检测不
仅需用昂贵的计数器， 而且还存在放射性保护和
废物处理等问题。 目前多采用 HPLC 法检测柠檬
苦素类化合物， 但由于果汁中柠檬苦素类化合物
含量较低， 该方法线性范围和检出限达不到检测
要求，所以测定结果有误差。 截至发稿前，对于应
用超高效液相色谱法同时测定柠檬苦素和诺米林
的检测方法未见报道。
随着色谱柱填料技术的发展， 超高效液相色
谱 （ultra performance liquid chromatography，U-
PLC）技术比传统的 HPLC技术具有更高的分离能
力，大大改善了分析速度、灵敏度和分离度 [11]。 本
文旨在建立 UPLC 同时测定金柑中柠檬苦素和诺
米林的分析方法， 以实现柠檬苦素类化合物快速、
准确的检测，从而丰富柠檬苦素类化合物检测手段。
1 材料与方法
1.1 材料
金柑：采于福建尤溪，去籽，45 ℃热风烘干至
恒重，粉碎过 40目筛，备用。
1.2 试剂
柠檬苦素（Limonin）和诺米林（Nomilin）标样，
购自 SIGMA 公司；乙腈（色谱纯）、二氯甲烷（分析
纯）、乙醇（分析纯）。 水为超纯水。
标准溶液配制： 分别称取柠檬苦素和诺米林
标准品 0.0178 g和 0.0172 g，用乙腈溶解并定容至
10 mL。 分别配制成含柠檬苦素 1.78 mg/mL 和诺
米林 1.72 mg/mL 的标准使用溶液。
1.3 仪器与设备
ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪， 美国
收稿日期： 2012-03-03
基金项目： 福建省科技创新平台建设项目（2009N2002）
作者简介： 孟鹏，男，1980 年出生，博士生，工程师
通讯作者： 郑宝东
Vol． 13 No． 2
Feb． 2 0 1 3Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 13 卷 第 2 期
2 0 1 3 年 2 月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.02.009
中 国 食 品 学 报 2013 年第 2 期
Waters 公司；分析天平，德国赛多利斯；高速组织
捣碎机（FW135），天津市台斯特仪器有限公司；超
声波振荡器（DS-8510 DTH），上海生析超声仪器
有限公司；高速冷冻离心机（AvantiJ-E），美国贝克
曼公司；旋转蒸发仪（RE-52AA），上海亚荣仪器生
化厂；Milli-Q 超纯水纯化系统， 美国 Millipore 公
司；涡旋混合器。
1.4 色谱条件
色谱柱 ：ACQUITY UPLCTM BEH C18 柱 （2.1
mm×100 mm，1.7 μm），美国 Waters 公司；流动相：
V 乙腈∶V 水（45∶55）；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL/min；进
样体积：2 μL；检测波长：215 nm；流动相梯度程序：
等度洗脱。
1.5 待测样品溶液的提取
水浴提取法： 取金柑粉末 5.0 g 于烧瓶中，加
入 100 mL 提取溶剂，50 ℃水浴回流提取。
超声提取法： 取金柑粉末 5.0 g 于烧瓶中，加
入 100 mL 提取溶剂，超声波提取。
提取液过滤后，滤液在 50 ℃真空旋转蒸发至
干，用乙腈溶解残渣并定容至 100 mL，混匀，用
0.22 μm滤膜过滤，备用。
2 结果与分析
2.1 检测波长
根据柠檬苦素和诺米林的特征吸收， 以乙腈
为空白， 采用 PDA检测器在 200～400 nm 范围内
对一定浓度的柠檬苦素和诺米林标准溶液进行紫
外扫描（如图 1 所示），结果表明柠檬苦素和诺米
林在 215 nm 处有最大吸收， 因此选择 215 nm 为
检测波长。
2.2 提取方法的优化
2.2.1 提取溶剂 根据文献[12]，选择二氯甲烷、
乙醇、丙酮 3 种溶剂 50 ℃水浴提取 1 h，结果见表
1。 二氯甲烷提取效果最佳。
2.2.2 提取方法 采用二氯甲烷作提取溶剂，比
较水浴提取法和超声波提取法，结果见表 2。 超声
波方法对柠檬苦素和诺米林的提取效率明显高于
水浴法，且超声波提取 1 h后，提取率基本稳定。
溶剂 柠檬苦素/mg·g－1 诺米林 ／mg·g－1
二氯甲烷 0.86 0.091
丙酮 0.70 0.088
乙醇 0.62 0.082
表 1 不同溶剂对柠檬苦素和诺米林的提取率
Table 1 The efficiency of different solvents
on extracting limonin and nomilin
提取方法 时间/h 柠檬苦素/mg·g－1 诺米林/mg·g－1
水浴提取 1.0 0.86 0.091
1.5 0.92 0.093
2.0 0.95 0.099
超声波提取 0.5 0.92 0.090
1.0 1.16 0.12
1.5 1.17 0.12
表 2 不同提取方法对柠檬苦素和诺米林的提取率
Table 2 The efficiency of different method on extracting
limonin and nomilin
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2.3 流动相
分别以不同比例的乙腈-水为流动相进样，分
析表明，当乙腈体积分数 30%～50%时，柠檬苦素
和诺米林两种物质被分离开来。考虑到分析时间、
乙腈用量和样品中杂质的干扰等因素， 选择体积
分数 45%乙腈作流动相。 该条件下柠檬苦素和诺
米林的分离度高，峰形较好，保留时间分别为 2.35
min和 2.97 min。 柠檬苦素和诺米林的标准品色谱
图、样品的色谱图分别见图 2、图 3。
2.4 线性范围和检出限
精密吸取柠檬苦素和诺米林标准使用溶液，
配制成梯度稀释液， 在选定的色谱条件下进样
2μL，分析。 分别以柠檬苦素和诺米林的质量浓度
（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲
线，计算其回归方程，结果见表 3，图 4。 柠檬苦素
和诺米林的回归方程分别为 Y=3970X+2080，Y=
3490X+4380，回归方程的 R2值均为 0.9999。 柠檬
苦素的线性范围为 1～1 780 μg/mL，诺米林的线性
范围为 1～1 720 μg/mL，这两种物质在较宽的质量
浓度范围呈现良好的线性关系。
2.5 检出限
依据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的
规定，检出限以信噪比 S/N＞3计[13]。 以测定仪器的
3倍信噪比（S/N=3，LOD）计算，本方法中柠檬苦素
和诺米林的检出限（LOD）分别为 1.65 μg/g和 1.28
μg/g。
2.6 回收率和精密度试验
称取金柑粉， 分别加入一定量的柠檬苦素和
诺米林标准溶液，运用所建立的方法，对金柑粉和
加标金柑粉进行预处理和色谱分析，结果见表 4。
柠檬苦素的加标回收率在 97.19%～100.06%之间，
相对标准偏差（RSD）0.74%~2.25%。诺米林的加标
回收率在 95.35%～99.83%之间 ， 相对标准偏差
（RSD）0.80%~3.36%，符合方法学分析要求。
线性范围/
μg·mL-1
回归方程
相关
系数
柠檬苦素 1~1 780 Y = 3970X + 2080 0.999
诺米林 1~1 720 Y = 3490X + 4380 0.999
表 3 柠檬苦素和诺米林标准曲线的线性范围和
相关系数
Table 3 The linear range and regression equation of
the calibration curve for limonin and nomilin
超高效液相色谱法快速并同时检测金柑中柠檬苦素和诺米林 179
中 国 食 品 学 报 2013 年第 2 期
样品含量/mg 添加量/mg 测定量/mg 回收率/% 标准偏差 *（RSD）/%
柠檬苦素 1.25 1.78 2.98 97.19 2.25
8.90 10.13 99.78 1.23
17.80 19.06 100.06 0.74
诺米林 0.14 1.72 1.78 95.35 3.36
8.60 8.64 98.84 2.30
17.20 17.31 99.83 0.80
表 4 加标回收率实验结果
Table 4 Result of addition recovery experiment
*：平行样品数 n=5。
2.7 UPLC检测体系的实际应用
采用上述 UPLC 检测体系， 对市售的琯溪蜜
柚、脐橙、柑橘，烘干、粉碎、提取后检测，结果见
表 5。
3 讨论
1） 采用传统高效液相色谱测定柠檬苦素和
诺米林已有研究报道。 孙崇德[12]、黄高凌[14]等利用
HPLC 法对柑橘和蜜柚中的柠檬苦素和诺米林进
行检测，方法精度高，重复性好，但检测范围为 4.3~
186.25 μg/mL。 在日常检测中，柑橘类水果中的柠
檬苦素浓度均超过此线性范围。 本文采用 UPLC
检测技术，通过优化色谱条件，将柠檬苦素和诺米
林的线性范围分别扩大为 1～1 780 μg/mL 和 1～
1 720 μg/mL，且范围内线性关系良好（R2=0.9999）。
刘亮等 [15]人用 HPLC 法分析两种物质需 16
min，流动相消耗量为 16 mL（流速 1.0 mL/min）。本
文采用 UPLC法，在 3 min 内即可完成 1 次进样分
离，流动相消耗仅 0.9 mL（流速 0.3 mL/min），在保
证分离度的同时，大大缩短了分析时间，减少了溶
剂消耗，降低了分析成本。 相比传统 HPLC 法，U-
PLC的分离效果和分析效率均有极大地提高。
2） 本文建立的柠檬苦素和诺米林的 UPLC
检测体系，具有高效、合理、准确和重复性好等特
点， 可用于金柑果实中柠檬苦素类化合物的提取
与检测。 为金柑柠檬苦素类化合物的进一步开发
利用奠定了基础。
样品名称 柠檬苦素 诺米林
脐橙 1.42 1.99
琯溪蜜柚 3.21 1.87
柑橘 0.95 0.47
尤溪金柑 1.24 0.16
表 5 不同样品中柠檬苦素和诺米林的含量（mg/g DW）
Fig.5 The contents of limonin and nomilin in different
samples（mg/g DW）
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参 考 文 献
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Study on Rapid Simultaneous Determination of Limonin and Nomilin
in Kumquat Using Ultra-Performance Liquid Chromatography
Meng Peng1，2 Zheng Baodong1*
（1Food Science College of Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002
2Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality， Fuzhou 350002）
Abstract A method for the rapid simultaneous determination of limonin and nomilin in Kumquat by ultra perfor-
mance liquid chromatography （UPLC） was developed. The limonin and nomilin in the samples were first extracted with
methylene chloride by sonication. The analyses were performed on UPLC with an ACQUITY UPLCTM BEH C18 column（2.1
mm×100 mm，1.7 μm）， using acetonitrile-water （45∶55， V/V） as the mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The col-
umn temperature is measured 35 ℃， with a detection wavelength of 215 nm. The two compounds were effectively separat-
ed by gadient elution and detected by PDA in 3 minutes. The Calibration curve were good linear in the range of 1～
1 780 μg/mL for limonin and 1～1 720 μg/mL for nomilin， the correlation coefficient were both 0.9999. The limits of de-
tection（LOD） were 1.65 μg/g and 1.28 μg/g. The additon recoveries were 97.19%～100.06% and 95.35%～99.83%， respec-
tively. The relative standard deviations were less than 5%. The result indicated that the method is rapid， sensitive， con-
venient， accurate and may be used for determination of limonin and nomilin in kumquat.
Key wods ultra performance liquid chromatography（UPLC）； limonin； nomilin； kumquat
超高效液相色谱法快速并同时检测金柑中柠檬苦素和诺米林 181