全 文 ：基金项目:国家 “十五 ”科技攻关专题子项(项目编号:2001BA535C-
8)
作者简介:黎继烈(1959-),女 ,中南林业科技大学生命科学与技术
学院教授 ,博士。 E-mail:lijilie@ 163.com
收稿日期:2008 -07-08
第 24卷第 5期
2 0 0 8年 9月
Vol.24, No.5
Sep.2 0 0 8
金橘黄酮抑菌作用研究
Studyonefectofanti-microbialbykumquatflavones
黎继烈
LIJi-lie　
张　慧
ZHANGHui　
王　卫
WANGWei　
李忠海
LIZhong-hai
(中南林业科技大学生命科学与技术学院 ,湖南 长沙　410004)
(ColegeofLifeScience＆Technology, CentralSouthUniversityofForestry＆Technology, Changsha, Hunan410004, China)
摘要:探讨金柑黄酮的抑菌作用。以金橘黄酮为受试物 , 研
究其活性成分对大肠杆菌 , 枯草芽孢杆菌 、金黄色葡萄球菌 、
黑曲霉 、青霉 、毛霉的抑制作用。金橘黄酮对供试菌株的抑
制效果顺序为:金黄色葡萄球菌 >枯草杆菌 >大肠杆菌 >毛
霉 , 对青霉 、黑曲霉没有抑菌作用 。最小抑菌浓度分别为
0.63, 1.25, 1.25, 2.50 mg/mL。最小杀菌浓度为 1.25, 2.50,
2.50, 2.50 mg/mL。抑菌率随作用时间延长而增加 , 对 4种
供试菌株的半抑菌率时间(IT50)分别为 4.65, 5.70, 6.74,
9.71 h。
关键词:金橘;黄酮;抑菌
Abstract:Theanti-microbialandsecurityofkumquatflavoneswasstud-
ied.Theantibacterialexperimentinvitroshowedthatthecrudeextractsof
flavonesatthediferentconcentrationhadinhibitoryefectonStaphyloclc-
cusaureus, Bacilussubtilis, Excherichiacoli, Aspergilusniger, Penicil-
liumspandMucorracemosus.Theinhibitingorderofthecrudeextractsof
kumquatflavoneswasS.aureus>B.subtilis>E.coli>M.racemosus.
Theminimuminhibitionconcentrations(MIC)were0.63, 1.25, 1.25,
2.50 mg/mLrespectively.Thehalfinhibitingtime(IT50)wasgivenas
below:4.65, 5.70, 6.74, 9.71 h.
Keywords:Kumquat;Flavones;Anti-microbial
黄酮类化合物一般呈弱酸性 , 能使蛋白质凝固或变性 ,
具有杀菌和抑菌作用 [ 1] 。近年来通过研究也证实了一些黄
酮类化合物表现出了一定的抑菌作用 [ 2 ～6] , 有人对黄酮类物
质如橙皮甙 [ 7] , 五倍子乙醇提取物 [ 8] , 大蒜油 [ 9]等体外抑菌
作用进行了研究 , 并取得了很好的效果。
金橘为柑桔亚科金橘属植物中的一种 , 含有多种活性物
质 , 据报道 ,桔皮提取物对食品常见污染菌具有广谱抑菌作
用 [ 10] 。目前 ,虽然对柑桔黄酮的生物活性已有部分研究 , 但
对金橘类似的研究少有报道。 本试验以金橘黄酮为研究对
象 , 探讨其对细菌和真菌的抑制作用。
1　材料与方法
1.1　材料与设备
金橘黄酮提取物:金橘于 2005年 11月采自湖南浏阳 ,
品种为金弹(FortunelaCrassifoliaSwingle)。 鲜果真空冷冻
干燥 , 粉碎过 40目筛 ,用石油醚脱脂回流 2 h, 脱脂后的金橘
粉按乙醇浓度 75%, 萃取温度 57 ℃, 萃取时间 37 min, 液料
比 30∶1微波萃取 ,过滤 , 浓缩 ,加入无水乙醇分离蛋白质及
糖类 , 石油醚多次清洗分离后冷冻干燥得金橘黄酮提取物粉
末 , 经测定含总黄酮 33.82%。
受试物溶液配制:用 30%乙醇溶解金橘黄酮 , 配制成浓
度为 5.00 mg/mL的溶液 ,然后用所用溶剂梯度稀释 2倍 , 得
到 5.00, 2.50, 1.25, 0.63, 0.31, 0.16mg/mL的受试物溶液。
菌种:大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacilus
subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloclccusaureus)、黑曲霉(As-
pergillusniger)、青霉(Penicillium sp)、毛霉 (Mucorracemo-
sus), 以上菌种均为中南林业科技大学发酵工程试验室保存。
牛肉膏 (AR)、蛋白胨 (AR)、琼脂粉 (AR)、葡萄糖
(AR)、氯化钠(AR)、氢氧化钠(AR)、硫酸(AR)、BaCl2 、
2H2O(AR)、马铃薯:市售。
牛津杯:北京先驱威锋技术开发公司;
LAC-5060S高压灭菌锅:DAIHANLABTECHCO.LTD;
PYX-280S-A生化培养箱:科力仪器;
HWY-100B恒温培养摇床:上海智城分析仪器制造有限
公司;
GIS-1000B凝胶成像仪:上海天能科技有限公司;
Colon2.01克隆计数操作系统:上海天能科技有限公司。
1.2　方法
1.2.1　培养基
(1)细菌培养基:菌种活化用牛肉膏蛋白胨琼脂培养
基 , 试管培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基 , 管碟法平皿培养
38
DOI :10.13652/j.issn.1003-5788.2008.05.026
下层用同菌种活化培养基 ,上层(即含菌层)用琼脂减半的牛
肉膏蛋白胨琼脂培养基 , 单层平板培养法用牛肉膏蛋白胨琼
脂培养基。
(2)真菌培养基:菌种活化用 PDA培养基 , 试管培养用
PDB培养基 ,管碟法平皿培养下层用同菌种活化培养基 , 上
层(即含菌层)用琼脂减半的 PDA培养基 , 单层平板培养法
用同菌种活化培养基 。
1.2.2　菌种活化　各菌种取 3支试管 , 每支试管倒入一定
量的培养基 , 制成斜面 , 取供试菌种一环 , 划线培养 ,细菌于
37 ℃培养 24 h,真菌于 28 ℃培养 48 h,待用。
1.2.3　菌悬液配制　参考文献 [ 11]的方法。
(1)细菌悬液的制备:将各个试验细菌分别接种于营养
琼脂斜面 , 37 ℃培养 24 h, 随后用 0.9%无菌生理盐水配制 ,
使菌悬液浓度约为 5×106 ～ 5×107 CFU/mL。
(2)真菌悬液的制备:将各个试验真菌分别接种于 PDA
培养基斜面 , 28 ℃培养 48 h, 随后严格无菌操作用无菌生
理盐水配制 , 使此时使菌悬液的含菌量约为 5 ×104 ～
5×105 CFU/mL。
1.2.4　管碟法检测金橘活性成分粗提物抑菌作用　参考文
献 [ 6]的方法。 取 20 mL下层培养基倾注于下层平板 , 将
0.1 mL菌悬液与 5 mL上层培养基混匀倾注于上层含菌平
板。待凝固后 , 呈对角放置 4个牛津杯 , 在其中 3个牛津杯
中顺时针加入浓度分别为 1.25, 2.50, 5.00 mg/mL的试样 ,
另一个以无菌生理盐水为空白对照 , 加入试样溶剂 , 用无菌
滤纸盖好。细菌于 37 ℃培养 24 h, 真菌于 28 ℃培养 36 h,
做 3个平行试验。培养结束后 , 测量形成抑菌圈的直径 , 检
测金橘活性成分粗提物的抑菌活性。
1.2.5　试管发生率(GTB)最小抑菌浓度(MIC)的测定　参
考文献 [ 12] 的方法。 将 1 mL试样 , 9 mL液体培养基 ,
0.1 mL菌悬液加入无菌试管 , 振荡均匀 , 细菌于 37 ℃培养
24 h,真菌于 28 ℃培养 48 h,做 3个平行试验。观察每个试
样的 3个平行试验的试管 , 记录试管中发生菌体生长的试管
数目 , 按式(1)计算试管发生率(GTB)。 3个平行样试管中
澄清均未发生菌体生长的最高稀释度为该试样对某供试菌
株的最小抑菌浓度(MIC)。
GTB=发生菌体生长的试管数
3
×100% (1)
1.2.6　最小杀菌浓度(MBC)的测定　参考文献 [ 12]的方
法。取 GTB =0.00%的培养液一环做平皿划线培养 , 细菌
于 37℃培养 24h,真菌于 28℃培养 48 h, 做 3个平行试验 ,
观察菌落形成情况 , 形成菌落数 <5的最小试样浓度为该试
样对某供试菌株的最小杀菌浓度(MBC)。
1.2.7　作用时间与抑菌率(IBR)的关系　参考文献 [ 12]的
方法。将最小杀菌浓度的试样 1 mL, 液体培养基 9 mL, 菌悬
液 0.1 mL加入无菌试管中 , 作用 2, 4, 6, 8, 10 h后 ,取一环菌
悬液 , 划线培养 ,细菌于 37 ℃培养 24 h, 真菌于 28 ℃培养
48 h,做 3个平行试验。培养后用克隆计数系统计菌落数 ,
按式(2)计算抑菌率(IBR)。
IBR=对照皿菌落数 -试验皿菌落数对照皿菌落数 ×100% (2)
2　结果与分析
2.1　不同浓度金橘黄酮的抑菌作用
如表 1所示 , 金橘黄酮对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、大
肠杆菌及毛霉有抑制作用。试样在低浓度(1.25 mg/mL)
时 , 对细菌已表现明显的抑菌效果 ,抑菌圈直径 >14.00 mm,
而对毛霉的抑菌圈直径 <7.00 mm。试样对细菌的抑制作用
基本是随着浓度的增加而增强。提取物对供试菌株的抑制
效果顺序为:金黄色葡萄球菌 >枯草杆菌 >大肠杆菌 >毛
霉 , 对青霉 、黑曲霉没有抑菌作用 。
2.2　试管发生率(GTB)与最小抑菌浓度(MIC)的测定
由表 2可知 , 金橘黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最
好 , 试样浓度为 0.63 mg/mL时 , GTB =0.00%,对毛霉的抑
制效果最差 , 试样浓度为 0.63 mg/mL时 , GTB = 66.67%。
通过表 2所示各供试菌种株的试管发生率(GTB)可知 , 金橘
黄酮对供试菌株的抑制作用效果由大到小为:金黄色葡萄球
菌 >枯草杆菌 >大肠杆菌 >毛霉。这一结果与管碟法检测
抑菌效果的作用顺序一致。
GTB为 0.00%的最小受试浓度为该试样对某菌株的最
小抑菌浓度(MIC)。由表 2可知 , 金橘黄酮对金黄色葡萄球
菌 、枯草杆菌 、大肠杆菌及毛霉的最小抑菌浓度分别为 0.63,
1.25, 1.25, 2.50 mg/mL。大肠杆菌 、枯草杆菌与金黄色葡萄
球菌分属革兰氏阴性菌和阳性菌 ,说明金橘黄酮对细菌有较
好的抑制作用。
表 1　不同浓度金橘黄酮的抑菌作用
Table1　Thebacteriostasisofdifferentconcentrationflavoneextracts /(mg· mL-1)
供试菌株
抑菌圈直径 /mm ±SD
5.00 2.50 1.25 空白
金黄色葡萄球菌 23.30±0.17 20.76±0.12 16.58±0.31 6.03±0.03
枯草杆菌 20.88±0.22 17.48±0.37 15.63±0.30 6.01±0.01
大肠杆菌 18.76±0.26 16.86±0.43 14.67±0.29 6.03±0.02
青霉 6.10±0.03 6.03±0.03 6.05±0.05 6.03±0.02
毛霉 16.02±0.23 14.54±0.38 7.10±0.31 6.00±0.02
黑曲霉 6.09±0.05 6.04±0.04 6.06±0.01 6.02±0.02
39
提取与活性 　 2008年第 5期
表 2　不同浓度金橘黄酮试管发生率(GTB)与最小抑菌浓度(MIC)
Table2　TheGTBandTheMICofdifferentconcentrationflavoneextracts
供试菌株
/(mg· mL-1)
金黄色葡萄球菌
GTB/%
枯草杆菌
GTB/%
大肠杆菌
GTB/%
毛霉GTB
/%
金黄色葡萄
球菌 MIC
枯草杆菌
MIC
大肠杆菌
MIC
毛霉
MIC
5.0 0.00 0.00 0.00 0.00 - - - -
2.5 0.00 0.00 0.00 0.00 - - - -
1.25 0.00 0.00 0.00 33.33 - - - +
0.63 0.00 33.33 33.33 33.33 - + + +
0.31 33.33 33.33 66.67 66.67 + + + +
0.16 100.00 100.00 100.00 100.00 + + + +
空白 100.00 100.00 100.00 100.00 + + + +
　　 　 -表示未发生菌体生长;+表示发生菌体生长
2.3　最小杀菌浓度(MBC)的测定
从表 2中未发生菌体生长的受试组中挑一环培养液 , 接
种于固体培养基上 , 划线培养 ,观察 , 以产生菌落少于 5个的
受试组为试样对某供试菌株的最小杀菌浓度(MBC)。
由表 3可知 , 金橘黄酮对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、大
肠杆菌及毛霉的最小杀菌浓度分别为 1.25, 2.50, 2.50,
2.50 mg/mL。其中金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度最小 ,说
明试样对其抑制效果最好。
表 3　金橘黄酮最小杀菌浓度(MBC)
　Table3　TheMBCofflavoneextracts /(mg· mL-1)
供试菌株
抑菌圈直径 /mm ±SD
5.00 2.50 1.25 0.63
金黄色葡萄球菌 0 2 4 5
枯草杆菌 0 3 > 5 -
大肠杆菌 2 1 > 5 -
毛霉 1 4 - -
　　 　 -表示未进行划线培养
2.4　作用时间与抑菌率(IBR)的关系
将最小杀菌浓度试样 1 mL, 液体培养基 9 mL, 菌悬液
0.1 mL加入无菌试管 , 作用 2, 4, 6, 8, 10h后 , 划线培养 ,计菌
落数。
如图 1所示 , 金橘黄酮对 4种供试菌株的抑制率均随着
作用时间的延长而增加。对金黄色葡萄球菌的抑制效果最
好 , 作用 10 h时 , 抑菌率 >90%;对毛霉抑制效果最差 , 作用
10 h时 ,抑菌率为(52.67±9.75)%。作用 2 h时 , 试样对枯
草杆菌 、大肠 杆菌及毛 霉的抑制 效果相似 , 抑菌率
<20.00%;而对金黄色葡萄球菌抑制效果较好 , 抑菌率
>20.00%。通过抑菌率—作用时间线性关系研究发现 , 试样
对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、大肠杆菌及毛霉的抑菌率与
作用时间均呈良好的线性关系 , R2 >93.00%, 表明试样对
供试菌株的抑菌率随着作用时间的延长而增大 ,半抑菌率时
间(IT50)分别为 4.65, 5.70, 6.74, 9.71 h。
图 1　金橘黄酮作用时间与 IBR关系
Figure1　Therelationofactivetime
andIBRofflavoneextracts
3　结论
金橘黄酮提取物有一定的抑菌能力 , 是因为黄酮类化合
物可通过破坏微生物细胞壁及细胞膜的完整性 ,导致微生物
细胞释放胞内成分引起膜的电子传递 、营养吸收 、核苷酸合
成及 ATP活性等功能障碍 , 阻止其生物大分子 , 如 DNA、
RNA及蛋白质的合成 , 从而抑制微生物的生长;黄酮类化合
物的化学结构都属于酚类衍生物 ,其分子结构上有较多的酚
羟基 , 这些官能团与蛋白质或酶通过氢键方式结合 , 影响部
分膜蛋白质合成或失去活性 , 导致细胞质的流失和解体 , 起
到了杀菌和抑菌的作用 。本试验中所用受试物为金橘黄酮 ,
其抑菌作用并非单一化合物的活性 ,可能是多种成分的协同
作用 , 为了进一步了解金橘活性物质的抑菌机理 , 可对提取
物进行分离纯化 , 深入探讨其活性物质的抑菌机理及其构效
关系。
试验结果显示 , 金橘黄酮对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、
大肠杆菌有较强的抑制作用 , 说明金橘黄酮有可拓展的应用
价值 , 可作防腐保鲜剂 、抗氧化剂等 , 用于食品添加剂和医药
保健品的开发 , 以达到防腐抑菌 、抗氧化双重功效。
40
第 24卷第 5期 黎继烈等:金橘黄酮抑菌作用研究 　
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