全 文 ：收稿日期:2008-10-22;　修订日期:2009-02-16
基金项目:浙江省森林培育重中之重学科开放基金项目(No.200607)
作者简介:乔文涛(1984-),男(汉族),河南商丘人 ,现为河南中医学院药
学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然药物化学研究工作.
＊通讯作者简介:袁　珂(1959-),女(汉族),河南郑州人 ,现任浙江林学院
天然药物研发中心教授 ,学士学位 ,主要从事天然药物化学的研究工作.
含羞草中总黄酮提取纯化工艺研究
乔文涛 1 ,张　静1 ,俞凌雁 2 ,马婷婷2 ,袁　珂 2＊
(1.河南中医学院 ·药学院 ,河南 郑州　450008;
2.浙江林学院天然药物研发中心 , 浙江 临安　311300)
摘要:目的 研究提取纯化含羞草中总黄酮的最佳工艺条件。方法 以芦丁为对照 , 含羞草总黄酮得率为考察指标 ,通过
正交实验法优选超声提取总黄酮的最佳工艺。在此基础上 , 采用真空薄膜浓缩 , 超声脱色 , 大孔吸附树脂 DiaionHP-20
吸附分离纯化含羞草总黄酮提取物。结果 最佳提取工艺为用 10倍量的 80%乙醇为溶剂超声提取 3次 , 10 min/次。最
佳分离纯化工艺为:采用大孔吸附树脂 DiaionHP-20进行分离富集 , 以不同浓度的乙醇进行梯度洗脱 , 洗脱流速为 5
ml/min,收集 40% ～ 60%乙醇洗脱部位并减压浓缩得总黄酮提取物 , 总黄酮的含量达到 76%。结论 优化了含羞草中总
黄酮的提取纯化方法 , 为含羞草资源的综合利用和产业化开发提供了参考。
关键词:含羞草;　总黄酮;　提取;　纯化
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)08-1986-02
　　含羞草为豆科含羞草属植物含羞草 Mimosapudica的全
草 [ 1] , 又名知羞草 、怕羞草 、喝乎草 、刺含羞草等。主要分布在我
国华东 、华南 、西南等地的山坡丛林 、湿地 、路旁 , 具有清热利尿 、
化痰止咳 、安神止痛 、凉血止血之功效 , 临床多用于急性肝炎 、神
经衰弱 、失眠 、肺结核咳血 、血尿 、结膜炎 、跌打损伤 、带状疱疹等
症 [ 2] 。含羞草中含有大量对人体有益的活性物质 , 包括黄酮类 、
酚类 、生物活性多糖 、氨基酸类 、有机酸类和其它微量元素。其中
的黄酮类化合物具有显著的生理活性 [ 3 ～ 5] , 如抗脂质过氧化 、抗
衰老 、清除自由基 、抗肿瘤 , 降低血脂 、抗菌抑菌 、增强免疫力等作
用。本文通过正交实验考察了超声提取含羞草总黄酮的工艺 ,同
时采用大孔吸附树脂进行吸附分离 , 并结合真空薄膜浓缩 、超声
脱色等方法对含羞草提取物进行分离与纯化 ,以期为工业化生产
提供参考依据。
1 　仪器与材料
1.1 　仪器 UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪
器有限公司);KQ-250B超声波提取器(昆山市超声仪器有限公
司);NJL07-3型实验专用微波炉(南京杰全微波设备有限公司 ,
额定功率 800W);MiliporeSimplicity型超纯水器(美国 Milipore
公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);真空薄膜
浓缩装置 [ 6](自装);101 -1型电热恒温干燥箱;微量分析天平
(EETTLERAE240瑞士), 微孔滤膜(上海医药工业研究院);芦
丁对照品(中国药品生物制品鉴定所提供)。
1.2 　材料与试剂 含羞草于 2003-05采自海南三亚 , 由海南
大学植物学教授黄世满鉴定为豆科含羞草属植物含羞草的全植
株;所用试剂均为分析纯。
2 　方法与结果
2.1　标准曲线的绘制 准确称取干燥恒重的芦丁对照品 12.8
mg, 加 60%乙醇(体积分数 ,下同)溶解并定容置 100ml的量瓶中 ,
摇匀得质量浓度为 0.128g/L的对照品溶液。分别取上述芦丁标
准溶液 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0ml于 6只 10ml量瓶中, 用 60%乙
醇补充至 5ml,各加入 0.3ml5%亚硝酸钠, 摇匀, 放置 5 min后各
加入 10%硝酸铝 0.3ml, 摇匀。 5 min后再加入 1 mol/ml的氢氧
化钠溶液 4ml,混匀 ,用 60%乙醇稀释至刻度。 10min后于 510nm
处测吸光度 ,试剂为空白参比, 以芦丁质量浓度为横坐标 ,吸光度
为纵坐标绘制标准曲线 ,用最小二乘法进行线行回归 , 得芦丁含量
与吸光度之间的回归方程:A=9.049 1C+0.006 4, r=0.999 7。
2.2 　不同溶剂提取所得提取物得率及总黄酮得率的比较
2.2.1　 不同溶剂提取所得提取物的得率比较 称取粉碎并过
60目筛后的含羞草原料 4份 , 每份 20 g, 分别选用 50%的乙醇 、
80%的乙醇 、甲醇 、70%的丙酮 4种不同的溶剂进行索氏提取 , 溶
剂用量均为 200 ml,提取时间为 5 h。分别将提取液浓缩至稠膏
状移入烘箱中烘干至恒重。称重 ,计算得率。结果见表 1。
2.2.2　 不同溶剂提取所得总黄酮的得率比较 分别吸取一定
量由不同溶剂提取所制得的含羞草提取液于 10 ml量瓶中 ,添加
60%乙醇溶液使体积约为 5 ml,按照上述绘制芦丁标准曲线的方
法 , 依次加入 0.3 ml5%亚硝酸钠 、 0.3 ml10%硝酸铝 、 4 ml1
mol/ml的氢氧化钠溶液 , 混匀 ,用 60%乙醇稀释至刻度。静置 20
min后用紫外可见分光光度计法测定不同溶剂提取所得提取液
的吸光度 ,重复 3次测定 ,并根据标准曲线换算出总黄酮的得率 ,
计算平均含量及 RSD。结果见表 2。
表 1　不同溶剂提取所得提取物及得率的比较
提取溶剂 提取物量 m/g 得率(%)
50%乙醇 1.956 5 9.78
80%乙醇 2.379 6 11.90
甲醇 2.223 4 11.12
70%丙酮 2.404 8 12.02
表 2　不同溶剂提取所得提取物中总黄酮的得率比较 %
提取溶剂 总黄酮得率
1 2 3
平均得率 RSD
50%乙醇 0.061 0.065 0.062 0.063 3.321
80%乙醇 0.208 0.214 0.215 0.212 1.783
甲醇 0.148 0.143 0.145 0.145 1.825
70%丙酮 0.207 0.199 0.202 0.203 1.994
由表 1可以看出 , 由 4种不同的溶剂进行索氏提取 ,以 70%
丙酮进行提取所得提取物的得率为最高;由表 2可以看出 , 以
80%乙醇为溶剂进行提取 ,所得提取物中总黄酮得率相对最高。
虽然以 70%丙酮提取得率最高且总黄酮的得率与用 80%乙醇提
取相当 ,但考虑到乙醇与丙酮相比 , 具有无毒安全 ,廉价易得的优
点 , 故提取溶剂选用 80%乙醇。
2.3 　超声提取工艺的优选
2.3.1　 样品溶液的制备与测定 分别精密称定干燥并过 60目
筛的含羞草粗粉 9份 , 每份 20.00 g,以 80%乙醇为溶剂 , 按正交
实验表中所选取的因素水平分别进行超声提取。分别吸取一定
量含羞草超声提取液于 10 ml量瓶中 , 添加 80 %乙醇溶液使体
·1986·
时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8
积约为 5 ml,按照上述绘制芦丁标准曲线的方法 , 依次加入亚硝
酸钠 、硝酸铝和氢氧化钠溶液 , 混匀 , 用 80%乙醇稀释至刻度。
静置 20min后测定吸光度 ,计算样品中总黄酮的含量。
2.3.2　正交设计 通过正交实验 ,以芦丁的含量为考察指标 ,通
过紫外法对超声提取方法进行正交实验 , 以优选出最佳提取工
艺。选用 L9(34)正交方案 , 以超声时间 、超声次数及溶剂用量 3
个因素 , 每个因素 3个水平设计实验方案。结果见表 3 ～ 4。
表 3　考察因素与水平
水平 A超声时间 t/min
B
超声次数 /次
C
溶剂用量 /倍
1 10 1 6
2 20 2 8
3 30 3 10
2.3.3　超声提取最佳工艺 从表 4中的直观分析可以明显看
出提取的最佳组合为 A1B3C3 ,即用 10倍量的 80%乙醇为溶剂超
声提取 3次 , 10min/次。
2.4 　分离纯化工艺优选 大孔吸附树脂 DiaionHP-20特别适
合对黄酮苷类化合物的富集分离 ,因此本实验采用大孔吸附树脂
DiaionHP-20对含羞草黄酮粗提物进行分离纯化。 具体操作
为:取药材 1 kg, 干燥后粉碎过 60目筛 , 按照以上最佳工艺进行
超声提取 , 得到的粗提物经真空薄膜浓缩至体积减半 , 加 2%活
性碳室温超声脱色 2次 , 20 min/次。抽滤 ,除去滤渣后继续真空
薄膜浓缩至无醇味 , 得提取物。 用大孔吸附树脂 DiaionHP-20
进行湿法装柱(色谱柱:6 cm×80 cm, 柱体积:450 ml), 以水 、
20%乙醇 、 40%乙醇 、 60%乙醇 、80%乙醇 、乙醇溶剂系统进行梯
度洗脱 , 控制洗脱流速为 5 ml/min。分别收集不同浓度的乙醇洗
脱液。将各部分洗脱液进行真空薄膜浓缩 、后转移至旋转蒸发仪
中真空浓缩至干燥粉末 , 计算得率。同时按照上述的紫外法检测
总黄酮的含量。结果见表 5。
表 4　正交实验设计及实验数据
实验号 A　　　　　B　　　　C　　　　　D
1 2 3 4
总黄酮的含量
/mg· g-1
1 1 1 1 1 2.706
2 1 2 2 2 6.070
3 1 3 3 3 8.289
4 2 1 2 3 3.125
5 2 2 3 1 5.137
6 2 3 1 2 3.529
7 3 1 3 2 2.249
8 3 2 1 3 3.986
9 3 3 2 1 3.837K
1 5.688 2.693 3.407 3.893K2 3.930 5.064 4.344 3.949K3 3.357 5.218 5.225 5.133Rj 2.331 2.525 1.818 1.240
　　K1、K2、K3表示均值 , Rj表示极差
表 5　大孔吸附树脂分离纯化实验结果 %
洗脱溶剂 得率 总黄酮质量分数
水 28.56 1.76
20%乙醇 10.66 14.81
40%乙醇 43.48 87.38
60%乙醇 7.66 63.55
80%乙醇 3.78 8.28
乙醇 5.86 7.20
由表 5可看出 , 用中等浓度 40%乙醇洗脱效果较好 , 总提取
物得率达到 43.48%, 总黄酮含量可达到 87.38%;从洗脱情况
看 , 总黄酮主要集中在 40% ～ 60%乙醇洗脱部位 , 水洗脱部位经
理化检测发现除含少量的黄酮外 ,还含有较多的多糖等大极性化
合物 , 可将这部分弃去 , 而 20%乙醇 、 80%乙醇及乙醇洗脱部位
相比之下则含少量的黄酮类成分。因此 ,按照以上方法对含羞草
总黄酮粗提物进行分离富集与纯化 , 收集各洗脱部位 , 将 40% ～
60%乙醇洗脱部位合并 , 进行真空薄膜浓缩后即可得到总黄酮提
取物 , 经紫外测定总黄酮的含量达到 76%。
2.5 　最佳提取纯化工艺 由实验得到最佳提取纯化含羞草总
黄酮的工艺:新鲜含羞草※干燥后粉碎※过 60目筛※室温超声
提取※提取液※真空薄膜浓缩至体积减半※浓缩液※加 2%活
性炭室温超声波脱色 2次※抽滤除去滤渣※脱色液※继续真空
薄膜浓缩至无醇味※上大孔树脂 DiaionHP-20柱※用水及乙醇
混合溶剂梯度洗脱※分别收集洗脱液※将 40% ～ 60%乙醇洗脱
液合并减压浓缩至干※干浸膏样品※检测含量※成品。
3 　讨论
本实验选用芦丁作为对照品 ,因为芦丁是黄酮化合物中比较
有代表性的一种 ,其 B环的 3, 4 -邻二酚羟基部位发生紫外吸
收 , 可以通过测定芦丁对照品的吸收度 , 从而求算供试品中总黄
酮的含量。这是总黄酮含量测定实验中比较经典的方法。
通过实验证明 ,提取含羞草中总黄酮的最佳工艺为用 10倍
量的 80%乙醇为溶剂超声提取 3次 , 10 min/次。
本实验采用大孔吸附树脂 DiaionHP-20分离含羞草中
的黄酮类成分 , 选择不同浓度的乙醇溶液进行洗脱 , 得出
40%乙醇溶液洗脱效果较好 , 总分离物得率达到 43.48%, 总
黄酮含量达到 87.38%。另外水洗脱部位得率较高 , 含少量黄
酮 , 还含有较多的大极性化合物。 在用大孔吸附树脂分离含
羞草总黄酮时 ,可先用水洗脱 , 除去大量的大极性化合物 , 减
少影响 , 再用 40%乙醇进行洗脱。
现代药理研究表明 ,黄酮类化合物在心血管系统 、内分泌系
统和抗肿瘤方面具有明显的药理作用。含羞草总黄酮的药理活
性未见深入研究。本文利用大孔吸附树脂分离纯化含羞草总黄
酮 , 为进一步研究含羞草总黄酮的药理活性 ,更好地开发利用含
羞草资源奠定了基础。
参考文献:
[ 1 ] 　江苏新医学院.中药大辞典 [ M] .上海:上海科学技术出版社 ,
1986:1147.
[ 2 ] 　全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编 [ M] .北京:人民卫生出
版社 , 1975:464.
[ 3 ] 　华光军 , 郭　勇.黄酮类化合物药理研究进展 [ J] .广东药学 ,
1999, 9(4):9.
[ 4 ] 　黄河胜.黄酮类化合物药理作用研究进展 [ J] .中国中药杂志 ,
2000, 25(10):499.
[ 5 ] 　王　玮 , 王　琳.黄酮类化合物的研究进展 [ J] .沈阳医学院学报 ,
2002, 4(2):115.
[ 6 ] 　袁　珂 , 俞　莉.真空薄膜浓缩装置的研制及应用研究 [ J] .分析
化学 , 2005, 33(9):1358.
·1987·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8 时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期