全 文 ：中国农学通报 2010,26(19):99-102
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
L-刀豆氨酸[1](L-canavanine)又叫L-2-氨基-4-胍氧
基—丁酸，是一种精氨酸的拮抗剂 [2]，其结构式如下
图，精氨酸 C5亚甲基被氧原子所取代，广泛存在于
Leguminosae的240属，1200种植物中[3]，作为一种天然
非蛋白质氨基酸，其具有一定的毒性[4-6]、抗代谢性[7]和
抗肿瘤性[8]。
NH2-C (=NH)-NH-O-CH2-CH2-CH (-NH2)-COOH
L-刀豆氨酸由于其毒性，L-刀豆氨酸被认为是一
种潜在的杀虫剂，因此具有一定的研究价值。已报道
的 测 定 刀 豆 氨 酸 的 方 法 ，主 要 是 运 用 PCAF
(pentacyanoamm-onioferrate)与 L-刀豆氨酸的特异反
第一作者简介：陈东芳，女，1985年出生，硕士研究生，生化与分子生物学，主要从事植物组织培养。通信地址：230036皖合肥市长江西路130号安徽
农业大学生化教研室203室，E-mail：chendongfang165@163.com。
通讯作者：文汉，副教授，硕士生导师，1963年出生。曾主持和参与的项目有：农业部重点实验室项目“葛根黄酮含量的测定及方法的研究”；安徽省
教育厅“天然茶皂素清塘剂的研究”；安微省自然科学基金项目“精制油茶品质建成机制的研究”；安徽省教育厅“舒城油茶产业化关键技术的研究”和
安徽省发改委“黄山脱毒贡菊产业化生产”等。“霍山石斛种苗、天麻种麻脱毒快繁和工厂化繁育技术的研究”获2004年度安徽省科学技术奖三等奖；
“黄山贡菊良种（两季花）选育及高产栽培技术的研究”2005年通过安徽省科技厅组织的鉴定，2006年获安徽省科学技术奖三等奖。“茶油精深加工生
产关键技术的研究”于2004年通过安徽省科技厅组织的鉴定，2007年获安徽省科学技术奖三等奖。通信地址：230036皖合肥市长江西路130号安徽
农业大学生化教研室207室，E-mail：lifwen1000@163.com。
收稿日期：2010-04-28，修回日期：2010-05-07。
一种新的测定刀豆氨酸含量的方法
陈东芳，文 汉
（安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036）
摘 要：主要研究了2,4-二硝基氟苯与刀豆氨酸在pH 9.5硼砂缓冲溶液中反应的最佳条件，从而拟建立
一种新的、快速简便的测定刀豆氨酸的方法。主要运用了分光光度法测定络合物在 571 nm处的吸光
度。结果表明：在50℃水浴30 min后，刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯发生显色反应，即形成绿色1:1的稳定
络合物。其最大吸收峰在571 nm，表观摩尔吸光系数∈ = 1.086×104 L/(mol·cm)，在13.75~220 μg/mL范
围内遵守比尔定律，对应线性回归方程为：y=0.0051x+0.0682；相关系数为：R2=0.9939。加标回收率为
96.6%~101.56%范围之内，相对标准偏差在1.768%之内，从而建立了刀豆氨酸简单、快速测定的新方法。
关键词：刀豆氨酸；分光光度法；2,4-二硝基氟苯
中图分类号：Q946.889 文献标志码：B 论文编号：2010-1325
A new Method of L-canavanine Determination
Chen Dongfang, Wen Han
(Department of Life Science, Anhui Agricultral University, Hefei 230036)
Abstract: This paper studied optimum conditions about 2,4 - dinitrofluorobenzene and L-canavanine reaction
in pH9.5 borax buffer solution, for establishment of a new, fast and easy determination of L-canavanine
method. The method used spectrophotometry determination 571 nm absorbance. The results showed that
L-canavanine with 2,4 - dinitrofluorobenzene occurred color reaction at 50℃ for 30 min, forming a stable
green complex with 1:1. The maximum absorption peak at 571 nm and the apparent molar absorption
coefficient ∈ =1.086×104 L/(mol·cm). It obeys beer’s law in 13.75-220 μg/mL, the corresponding linear
regression equation, y=0.0051x+0.0682; correlation coefficient R2=0.9939. Recoveries were 96.6%-101.56%,
relative standard deviation of 1.245%-1.768% range. Thus a simple new method for rapid determination
L-canavanine was established.
Key words: L-canavanine; spectrophotometry; 2, 4-dinitrofluorobenzene
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应[9]，和HPLC法[10]以及氨基酸自动分析仪法[11]对刀豆
氨酸进行定量测定。试剂PCAF Sigma公司早已停止
生产，HPLC法对仪器和操作要求较高，建立简便、快
速测定刀豆氨酸的方法还未有报道，因此此实验研究
了L-刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯在硼砂缓冲液中反应
形成络合物的条件，拟建立一种新的、操作简单、快速
的定量测定L-刀豆氨酸的方法，为生物合成刀豆氨酸
建立基础。
1 试剂与方法
1.1 主要仪器与试剂
试验时间、地点：2009年 12月—2010年 4月在安
徽农业大学生化实验室进行。
TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪
器责任有限公司）；pHS-3C酸度计(上海康仪仪器厂)，
SIGMA低温台式高速离心机(德国)。
刀豆氨酸(Sigma公司生产)，精氨酸、丙氨酸、苯丙
氨酸等为国产试剂，硼砂，乙腈为色谱纯，2,4-二硝基
氟苯为上海金山县兴塔化工厂生产的化工试剂，其他
试剂均为分析纯。
样品为此实验室悬浮培养的刀豆愈伤细胞液，碾
磨后经10000 r/min冷冻离心20 min，上清液通过旋转
蒸发浓缩三倍，作为待测液，置4℃冰箱中保存备用。
1.2 试验方法
向10 mL带盖dorf试管中加0.05 mol/L pH 9.5硼
酸钠缓冲液 l mL，乙腈 l mL，刀豆氨酸操作液或样品
液1 mL，2,4-二硝基氟苯溶液10 μL，摇匀，放在50℃水
浴锅中避光水浴30 min，流水冷却至室温后，以相同方
法制备试剂空白为参比，用1 cm石英比色皿在571 nm
处测定其吸光度。
2 结果与讨论
2.1 吸收光谱
用紫外可见分光光度计于 200~800 nm之间进行
光谱扫描，并绘制吸收光谱图（如图 1）。如图所示，
DNFB(2,4-二硝基氟苯的缩写)试剂的吸收峰在 200~
420 nm之间，刀豆氨酸的吸收峰在 210 nm处，而刀豆
氨酸与DNFB在 pH 9.5的硼砂缓冲液中作用后，在
571 nm处形成新的吸收峰，这表明二者反应生成新的
绿色物质如图2示。
图2 刀豆氨酸与DNFB反应后络合物
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
200 400 600 800
λ/nm
吸
光
度
刀豆氨酸棗 缓冲液
DNFB棗 乙腈
络合物棗 试剂空白
图1 光谱曲线
2.2 反应温度的影响
在 30、40、50、60、70℃条件下测定络合物的吸光
度。实验结果表明，随温度升高，络合物在 571 nm处
的吸光度增大，当达到 50℃时，刀豆氨酸与DNFB络
合物的吸光度最大，且比较稳定，温度过高吸光度减
小，所以在50℃条件下进行比较好。
2.3 反应时间的影响
测定了刀豆氨酸与DNFB在不同加热时间后络合
物的吸光度，结果表明随加热时间的增加吸光度也在
增加，在 30 min基本达到稳定，且稳定时间为 60 min，
随后的时间里吸光度基本不变，因此加热时间可以定
为30 min。
2.4 pH的影响
分别选用 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0几种不同 pH
的硼砂缓冲液，进行络合物吸光度的测定。结果表明，
随pH的增大吸光度也增大。到pH 9.5时吸光度较大，
且变化较小，实验选取pH 9.5。
2.5 试剂用量的影响
按实验方法配置溶液，加入DNFB溶液的量分别
为0.0、2.5、5.0、7.5、10.0和12.5 μL时，测定吸光度。结
果表明，随DNFB用量增加，吸光度增大。但当DNFB
加入量超过 10.0 μL时，由于DNFB本身有颜色，使得
刀豆氨酸——缓冲液
DNFB——乙腈
络合物——试剂空白
·· 100
陈东芳等：一种新的测定刀豆氨酸含量的方法
反应后的颜色变黄，反应的吸光度变小。因此显色剂
用量为10.0 μL。
2.6 络合物组成[12]
采用摩尔比法与等摩尔连续变化法测得络合物
组成为刀豆氨酸与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1，并
测得表观摩尔吸光系数为1.086×104 L/(mol cm)。
3 反应机理初探
由于做了十几种基本氨基酸在同样反应条件下，
没有绿色络合物出现，而只有刀豆氨酸在这种条件下
有绿色络合物出现，推测可能是由于刀豆氨酸分子内
O原子上或者是O原子和N原子上公有一对孤对电子
可作为电子给予体，而 2,4-二硝基氟苯作为电子接受
00.1
0.20.3
0.40.5
0.60.7
0.8
0 20 40 60 80
温度/℃
吸
光
度
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 20 40 60 80
时间/min
吸
光
度
图3 温度的影响 图4 时间的影响
+ =
体，在硼砂缓冲液中形成络合物。基于测得的络合物
组成比为1:1，反应可表示如上[13]。
4 标准曲线
按实验方法分别取不同量的刀豆氨酸标准液，进
行反应后测定络合物的吸光度，绘制标准曲线，结果表
明，刀豆氨酸用量在13.75~220 μg/mL范围内遵守比耳
定律，线性回归方程为y=0.0051x+0.0682；相关系数为
0.9939。
5 样品分析
5.1 样品测定
按实验方法操作，准确移取适量的样品液于
10 mL dorf管中，反应后于 571 nm处测吸光度，通
过标准曲线计算样品中刀豆氨酸的含量，结果如下
表。
5.2 方法回收率和精密度实验
按实验方法，加入不同量的刀豆氨酸标准溶液，用
标准加入法测定其回收率。测定结果见表 2。由表 2
可知，方法的回收率为101.56%、99.4%和96.6%。相对
标准偏差为1.245%、1.598%和1.768%。
6 结论与讨论
通过此实验研究发现，刀豆氨酸与DNFB在 0.05
mol/L pH 9.5的硼砂缓冲液反应生成绿色络合物的最
佳条件为温度 50℃，加热时间 30 min，在 571 nm有最
大吸光度。通过样品回收率和精密度实验进行验证，
可以看出此方法有一定的可验证性，说明此方法可作
为一种新的测定刀豆氨酸的简便、快速的方法。
样品
100408
吸光度
0.496 0.503 0.505
含量/(μg/mL)
84.86
RSD/%
0.0047
表1 刀豆氨酸含量的测定
加入量/μg
46.75
71.5
121.0
测得值/μg
47.48
71.1
116.89
回收率/%
101.56
99.4
96.6
RSD/%
1.245
1.598
1.680
表2 样品回收率的测定结果（n=6）
·· 101
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