全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2010, 22:701-704, 596
文章编号:1001-6880(2010)04-0701-05
　
　
　收稿日期:2009-06-29　　　接受日期:2009-10-23
＊通讯作者 Tel:86-25-83592335;E-mail:cflab@ 126.com
望江南总蒽醌苷抗肿瘤作用的研究
李月玲 ,张太平 ,彭士明 ,张鹤云＊
南京大学生命科学学院 医药生物技术国家重点实验室 , 南京 210093
摘　要:探讨望江南总蒽醌苷(CSAG)的抗肿瘤作用及其作用机制。利用 MTT法检测望江南总蒽醌苷对肝癌细
胞 HepS、肺癌细胞(A549)、小鼠肉瘤(S180)腹水型肿瘤细胞等肿瘤细胞和人正常肝细胞 L-02增殖的影响;实
体瘤称重法测定 CSAG对肝癌(HepS)实体瘤的抑制情况 , 将接种肿瘤的小鼠分成 5组 , 每组 6只小鼠 , 雌雄各
半 ,给药 12d,停药后 24h处死动物 , 秤鼠体重 ,剥离出肿瘤 , 秤瘤重 ,测定生化指标。结果显示 , CSAG对以上肿
瘤细胞的增殖均有抑制作用 , 对肝癌细胞荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用;同时可增加胸腺指数和脾指
数。因此 , CSAG具有明显的抗肿瘤效果 , 其抗肿瘤作用可能与提高机体免疫力和诱导细胞凋亡有关。
关键词:望江南总蒽醌苷;抗肿瘤;肝癌细胞 HepS;免疫;细胞凋亡
中图分类号:R285;Q946.91 文献标识码:A
StudyonAnti-tumorEfectsofTotalAnthraquinone
GlycosidesfromCoffeeSenna
LIYue-ling, ZHANGTai-ping, PENGShi-ming, ZHANGHe-yun＊
StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology, SchoolofLifeSciences, NanjingUniversity, Nanjing210093 , China
Abstract:Tostudyanti-tumoreffectofanthraquinoneglycosidesfromthetuberofCoffeeSenna(CSAG)anditsmecha-
nismofaction.TheefectsofCSAGonproliferationofhumanlungcancercelsA549, S180mousesarcomaascitestumor
cels, mousehepatomacellsHepSandhumannormallivercelsL-02wasdetectedbyMTTcolorimetricassay;HepSsol-
idtumormousemodelwasmadebysubcutaneousinjectionoflogarithmicphaseofHepScels.Aftermedicationsfor12
days, theefectofCSAGatdiferentdose(0.4, 0.2, 0.1mg/kg· d)oninhibitionrateoftumorweight, thymusindexand
spleenindexwasdetected.TheresultisthatCSAGcaninhibittheproliferationofthesetumorcells, andalsocansignifi-
cantlyinhibitedthegrowthofthetumoroftumor-bearingmice, increasethymusindexandspleenindexatthesametime.
SoCSAGhavesignificantlyanti-tumorefects.Themechanismofanti-tumorefectsofCSAGmightberelatedtothein-
creasedimmunityfunctionofmiceandinducedapoptosis.
Keywords:totalanthraquinoneglycosidesfromCoffeeSenna;HepS;anti-tumor;immunity;apoptposis
　　望江南(CassiaoccidentalisL.),豆科 ,决明属 ,
又名羊角豆 、野扁豆 ,主要分布于长江以南各地 ,望
江南的种子 、根 、茎 、叶都可入药 ,是民间一种常用的
中药 ,在临床上也有应用。望江南的主要活性成分
为蒽醌苷类化合物 ,由蒽醌类衍生物与糖结合而成 ,
具有抗菌消炎 、泻下 、抗风湿等作用 。尽管望江南民
间应用疗效确切[ 1] ,国内外学者对其药理活性和化
学成分也进行了初步研究 ,但是目前仍然很难依据
现有研究资料对其进行合理开发和利用 。从国内外
的文献报道来看 ,目前对望江南的药理活性研究主
要限于其抗炎作用 。本实验对望江南总蒽醌苷体内
外抗肿瘤作用进行了研究 ,以期为开发传统中药提
供科学依据 ,使望江南得到更有效的利用 。
1　材料
1.1　实验动物及瘤株
昆明种小白鼠 ,雌雄各半 , 18 ～ 22 g,购于南京
医科大学动物饲养中心 ,清洁级。肝癌 HepS细胞
株由中科院上海药物研究所提供 ,江苏省肿瘤研究
所培养传代 。肺癌细胞(A549)、小鼠肉瘤(S180)腹
水型肿瘤细胞 、人正常肝细胞 (L-02)本实验室冻
存 。
1.2　主要试剂及仪器
望江南总蒽醌苷样品(自制 ,纯度为 95.3%);
RPMI-1640 细胞 培养 液 (GIBCO公 司 , 批号:
2535081);四噻唑氮蓝 MTT(南京大治生物科技有
限公司 ,批号:0793);环磷酰胺(江苏恒瑞制药 ,批
号:07122821);胎牛血清 (北京元亨圣马生物技术
研究所 ,批号:XA070621HY);DG5033A酶联免疫检
测仪(南京华东电子集团医疗装备有限公司生产);
CO2培养箱 (ThermoForma公司 );DY-1001S型
DNA电泳仪(南京大学仪器厂);JD801凝胶电泳图
象分析仪(南京捷达公司)。
2　方法
2.1　望江南总蒽醌苷的制备
望江南干燥茎(本实验室种植)粉碎机粉碎 ,加
10 ～ 15倍体积冷水 ,煮沸 20 min,过滤取上清 ,滤渣
加水再重复煮两次 ,收集三次滤液 ,此即为提取母
液[ 2] 。母液经大孔树脂层析 ,酒精洗脱 ,浓缩除去
酒精 ,离心得清液即为望江南总蒽醌苷样品 [ 3] 。
2.2　细胞体外增殖分析
2.2.1　望江南总蒽醌苷对肝癌细胞(HepS)体外增
殖的抑制作用
无菌条件下取接种 7 ～ 10 d的 HepS瘤源小鼠
的腹水 ,无血清 RPMI-1640培养基洗涤两次 , 用含
10%小牛血清的 RPMI-1640培养基配制成细胞浓
度为 1×106 /mL的细胞悬液 , 向 96孔板每孔加入
80 μL,设一空白对照孔不加细胞悬液 。每个试验组
设 3 ～ 5个复孔(蒽醌苷的终浓度分别为:1.5625、
3.1250、6.25、9.375、12.5、15.625、18.75、21.875、
25 μg/mL),另设无药物的阴性对照组 ,再设一孔为
各浓度样品的无细胞组。培养板置于 37 ℃ 5%的
CO2培养箱中培养 24 h,加入 5 mg/mL的 MTT8.5
μL/孔 ,继续培养 4 h,加入 20%的 SDS40 μL/孔 ,
次日于酶标仪上 , 490nm下测 OD值。做三次重复 ,
每组的复孔取均值 ,并计算细胞生长抑制率 。
细胞生长抑制率 =[ 1-(试验组 -无细胞组)/
阴性对照组 ] ×100%
2.2.2　望江南总蒽醌苷对肺癌细胞(A549)体外增
殖的抑制作用
取对数生长期的细胞株配制成细胞浓度为 1×
10
5 /mL的细胞悬液 ,加入到 96孔板中 ,每孔 80μL,
设一空白对照孔不加细胞悬液。试验组加不同浓度
的蒽醌苷 80 μL,每个试验组设 3 ～ 5个复孔 [ 4] ,根
据预试验设置试验组蒽醌苷的终浓度分别为:6.25、
9.375、12.5、15.625、18.75、21.875、25 μg/mL。另
设无药物的阴性对照组 ,再设一孔为各样品浓度的
无细胞组 。以下操作同 2.2.1.
2.2.3　望江南总蒽醌苷对小鼠肉瘤(S180)腹水型
肿瘤细胞的体外增殖的抑制作用
小鼠肉瘤 S180腹水型肿瘤细胞株经小鼠腹腔
传代 ,无菌抽取腹水瘤细胞 ,置于含 15 %灭活胎牛
血清的 DMEM培养基中 , 37 ℃ 5%CO2培养箱中进
行培养 ,当细胞生长至对数期时 ,配制成浓度为 5×
10
5 /mL细胞悬液 ,接种于两块 96孔培养板上 ,每孔
80 μL设一空白对照孔不加细胞悬液 ,试验组加不
同浓度的望江南总蒽醌苷 80 μL,每个试验组设 6
个复孔 。试验组望江南总蒽醌苷的终浓度分别为:
6.25、9.375、12.5 μg/mL,另设无药物的阴性对照
组 ,再设一孔为各样品浓度的无细胞组。一块板培
养 24h和另一块培养 48 h,以下操作同 2.2.1。
2.2.4　望江南总蒽醌苷对人正常肝细胞(L-02)体
外增殖的抑制作用
复苏冻存的 L-02细胞后 ,以含 10 %小牛血清
的 RPMI-1640培养基培养传代 ,取第三代对数生长
期的细胞 ,配制成细胞浓度为 1×105 /mL的细胞悬
液 ,接种于 96孔板上 ,以下操作同 2.2.1。
2.3　望江南总蒽醌苷体内抗肿瘤作用
HepS细胞株小鼠腹腔内传代 , 5 ～ 7 d传代一
次 ,传代三次后 ,无菌条件下抽取腹水 ,加无菌生理
盐水洗涤离心 , 800 r/min离心 5 min,如此洗涤 3
次 ,调整细胞浓度至 1×107 /mL,台盼蓝染色法检测
存活率≥95%,用无菌注射器抽取细胞悬液皮下注
射于小鼠左后肢腋下 ,每只鼠接种 0.2 mL。接种 24
h后将试验动物随机分成五组 ,分别为模型组 ,阳性
对照组及高 、中 、低三个剂量给药组。每组六只 ,雌
雄各半 。模型组腹腔注射生理盐水 ,阳性对照组腹
腔注射环磷酰胺 ,剂量为 20 mg/kg· d,给药组腹腔
注射的剂量分别为 0.4、0.2、0.1 mg/kg· d,每天注
射前称体重;连续注射 12 d[ 6] 。于末次注射后 1 h,
称鼠体重 ,颈椎脱臼处死小鼠 。完整剥离瘤块 ,称
重;解剖小鼠 ,取出脾脏和胸腺 ,称重 。计算抑瘤率 、
胸腺指数和脾指数。
公式:抑瘤率(%)=(模型组平均瘤重 -给药
组平均瘤重)/模型组平均瘤重 ×100
胸腺指数脾指数 =脾脏重量 /小鼠体重(mg/g)
胸腺指数 =胸腺重量 /小鼠体重(mg/g)
2.4　DNA凝胶电泳法测定望江南总蒽醌苷对肝癌
细胞 HepS凋亡的影响
取 HepS肝癌肿瘤小鼠腹腔液 ,加入含 10%小
牛血清的 RPMI-1640培养基 ,配制成细胞悬液 ,取
702 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22
悬液加入 24孔板中 , 0.5 mL/孔 ,并分成五组:空白
对照组 、CSAG-20 μg/mL组 、CSAG-30 μg/mL组 、
CSAG-40μg/mL组 、CSAG-50μg/mL组 。分别加入
0.5 mLRPMI1640、CSAG-20 μg/mL、CSAG-30 μg/
mL、CSAG-40 μg/mL、CSAG-50 μg/mL置于 37 ℃,
5% CO2培养箱中培养 48 h,取处于对数生长期的
细胞 1.5mL, 1500 r/min离心 4min,弃上清 ,加入 1
mLPBS缓冲液悬浮细胞 , 1500r/min离心 4 min,弃
上清 ,加入 40 μL5 mol/L的 KI,振荡 30 s,加 100
μL生理盐水混匀 ,加苯酚 /氯仿 /异戊醇(25∶24∶1)
和苯酚 /氯仿(1∶1)各抽提一次 ,所加的量与管中液
体体积相同。小心地吸取上层水相至新管 ,加 0.1
倍体积 3 mol/L醋酸钠和 2.5倍体积的无水冷乙
醇 ,上下倒置混匀 ,置于-20 ℃沉淀 0.5 h;取出于 4
℃ 13000 r/min条件下离心 10min,将沉淀溶于 TE
缓冲液中 ,取各组 DNA溶液 16 μL,分别与 4 μL上
样缓冲液混匀后电泳[ 7] 。
3　结果与分析
3.1　望江南总蒽醌苷的体外抗肿瘤活性
望江南总蒽醌苷对体外培养的 HepS、A549、
S180细胞的增殖均有显著的抑制作用(表 1 ～ 3);
在总蒽醌浓度 <9.3750μg/mL时 ,促进人正常细胞
的增殖 ,浓度≥9.3750 μg/mL时 ,抑制人正常细胞
的增殖 ,江南总蒽醌苷达到一定浓度后对细胞产生
毒性(表 4)。
表 1　望江南总蒽醌苷对鼠肝癌 HepS细胞增殖的影响(x±
s, n=12)
Table1　EffectoftotalanthraquinoneglycosidesfromCofee
SennaonmousehepatomacelHepSproliferation(x
±s, n=12)
组别
Group
药物浓度
Drug
concentration
(μg/mL)
平均 A值
AverageA
抑制率
Inhibition
ratio(%)
对照组 Controlgroup 0.79±0.0781
试验组 Experimentalgroup 1.5625 0.08±0.0121 90.00
3.1250 0.07±0.0231 91.25
6.2500 0.03±0.0001 96.20
9.3750 0.06±0.0151 92.50
12.5000 0.05±0.0211 93.75
15.6250 0.05±0.0381 93.75
18.7500 0.04±0.0251 95.00
21.8750 0.04±0.0381 95.00
25.0000 0.00±0.0001 100.00
　　注:与对照组性比:1P<0.001。 Note:vscontrolgroup:1P<0.001.
表 2　望江南总蒽醌苷对人肺癌 A549细胞增殖的影响(x±
s, n=12)
Table2　EfectoftotalanthraquinoneglycosidesfromCofee
Sennaonproliferationofhumanlungcancercells
A549(x±s, n=12)
组别
Group
药物浓度
Drug
concentration
(μg/mL)
平均 A值
AverageA
抑制率
Inhibition
ratio(%)
对照组 Controlgroup 0.84±0.103
试验组 Experimentalgroup 6.2500 0.50±0.0501 41.18
9.3750 0.23±0.0051 72.94
12.5000 0.03±0.0201 96.47
15.6250 0.02±0.0251 97.65
18.7500 0.01±0.0201 98.82
21.8750 0.00±0.0001 100.00
25.0000 0.00±0.0001 100.00
　　注:与对照组性比:1P<0.001。
Note:vscontrolgroup:1P<0.001.
表 3　望江南总蒽醌苷对小鼠肉瘤 S180腹水型肿瘤细胞增
殖的影响(x±s, n=12)
Table3　EfectoftotalanthraquinoneglycosidesfromCofee
SennaonproliferationofS180 mousesarcomaasides
tumorcells(x±s, n=12)
组别
Group
药物浓度
Drug
concentration
(μg/mL)
平均 A值
AverageA
抑制率
Inhibition
ratio(%)
对照组Ⅰ (24h) 1.20±0.113
试验组Ⅰ (24h) 6.2500 1.03±0.127 14.16
9.3750 0.29±0.0282 75.83
12.5000 0.04±0.0231 96.67
对照组Ⅱ(48h) 0.84±0.047
试验组Ⅱ(48h) 6.2500 0.93±0.000 7.14
9.3750 0.07±0.0002 91.67
12.5000 0.06±0.0172 94.64
　　注:与对照组性比:1P<0.05, 2P<0.005。
Note:vscontrolgroup:1P<0.05, 2P<0.005.
表 4　望江南总蒽醌苷对人正常肝细胞 L-02细胞增殖的影
响(x±s, n=12)
Table4　EfectoftotalanthraquinoneglycosidesfromCofee
SennaonhumannormallivercelL-02 proliferation
(x±s, n=12)
组别
Group
药物浓度
Drug
concentration
(μg/mL)
平均 A值
AverageA
抑制率
Inhibition
ratio(%)
对照组 Controlgroup 0.98±0.053
试验组 Experimentalgroup 1.5625 1.23±0.0001 -25.51
3.1250 1.29±0.0001 -31.63
703Vol.22 　　　　　　李月玲等:望江南总蒽醌苷抗肿瘤作用的研究 　
6.2500 1.42±0.0001 -44.90
9.3750 0.91±0.0001 7.14
12.5000 0.57±0.0001 41.84
15.6250 0.36±0.0001 63.27
18.7500 0.29±0.0001 70.40
21.8750 0.29±0.0001 70.40
25.0000 0.21±0.0001 78.57
　　注:与对照组性比:1P<0.001。 Note:vscontrolgroup:1P<0.
001.
3.2　望江南总蒽醌苷对 HepS实体瘤生长的抑制
作用
实验结果表明 ,望江南总蒽醌苷对实体瘤小鼠
的瘤重有抑制作用(表 5),能提高脾指数和胸腺指
数(表 6),抑制肿瘤生长的同时可以保护小鼠的免
疫器官 ,与模型组相比差异有显著性。
表 5　望江南总蒽醌苷对荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s, n=
12)
Table5　EffectoftotalanthraquinoneglycosidesfromCofee
Sennaontumorweightoftumor-bearingmice(x±s, n
=12)
组别
Group
剂量
Dose
(mg/kg·d)
平均瘤重(g)
Average
tumorweight
抑制率
Inhibition
ratio(%)
模型组 0.667±0.079
CTX组 20 0.386±0.0481 42.1
高剂量组 0.4 0.429±0.0282 35.7
中剂量组 0.2 0.562±0.133 15.7
低剂量组 0.1 0.615±0.178 7.80
　　注:与模型组相比:1P<0.001, 2P<0.005。
Note:vsmodlegroup:1P<0.001, 2P<0.005。
表 6　望江南总蒽醌苷对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影
响(x±s, n=12)
Table6　EffectoftotalanthraquinoneglycosidesfromCofee
Sennaonspleenindexandthymusindexoftumor-
bearingmice(x±s, n=12)
组别
Group
剂量
Dose
(mg/kg·d)
脾指数
Spleen
index
(mg/g)
胸腺指数
Thymus
index
(mg/g)
模型组 6.56±0.295 2.85±0.307
CTX组 20 4.87±0.083 1.50±0.143
高剂量组 0.4 7.28±0.3472 1.75±0.1141
中剂量 0.2 7.07±0.5822 2.18±0.0602
低剂量组 0.1 7.17±0.7172 2.28±0.3922
　　注:与阳性对照组相比:1P<0.05, 2P<0.005。
Note:vspositivegroup:1P<0.05, 2P<0.005.
3.3　DNA凝胶电泳法测定 CSAG对 HepS肝癌细
胞凋亡的影响
实验结果表明(图 1), 25 μg/mL没有小分子量
的 DAN片段 ,大部分细胞直接坏死;其他四组与空
白对照组相比 ,有较多的小分子 DNA条带且形成
“Ladder”,大分子量 DNA量较少 ,说明细胞内的大
部分 DNA已降解成分子量为核小体整数倍的 DNA
梯形片段 ,而对照组为连续性 DNA碎片。结果表明
四个低剂量的望江南总蒽醌苷对 HepS的凋亡有显
著的促进作用。
图 1　DNA凝胶电泳图
Fig.1　MapofDNAagarosegelelectrophoresis
　　注:1～ 5:1.5625, 3.125, 6.25, 12.5 , 25 μg/mL;6.空白对照
组;7.DNAMarker
4　讨论
　　体外实验表明 ,望江南总蒽醌苷对 HepS、A549、
S180的增殖具有显著的抑制作用;体内抑瘤实验表
明 ,望江南总蒽醌苷对小鼠 HepS肝癌有明显的抑
制作用 ,且能抑制肿瘤生长 ,提高脾脏指数和胸腺指
数 ,增强免疫功能 ,其增强免疫功能是望江南抗肿瘤的
机制之一。DNA凝胶电泳法和结果说明 ,望江南总蒽
醌苷抑制 HepS细胞增殖的机制可能是 ,在低浓度时引
起细胞凋亡 ,高浓度时细胞毒作用直接毒杀细胞。
以上实验说明望江南总蒽醌苷在体内外均具有
显著的抗肿瘤活性 ,其可能机制为提高免疫力和诱
导细胞凋亡 。本实验只是一个初步研究 ,需进一步
探明望江南总蒽醌苷抗肿瘤的作用靶点 ,为合理开
发利用望江南提供依据。
参考文献
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(下转第 596页)
704 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22
113.7 (C-2′), 145.8 (C-3′), 150.0 (C-4′), 116.2
(C-5′), 119.3 (C-6′), 79.2 (C-1″), 73.3 (C-2″),
71.5(C-3″), 70.6 (C-4″), 81.4 (C-5″), 61.8 (C-
6″)。以上波谱数据与文献报道基本一致 [ 9] ,故鉴
定为异荭草苷 。
化合物 8　白色片状 , mp.98 ～ 100 ℃.1HNMR
(DMSO-d6 , 300 MHz)δ:4.55(2H, d, J=4.9 Hz, 2,
4-OH), 4.50(1H, d, J=5.4 Hz, 3-OH), 4.32 (2H,
t, J=5.7 Hz, 1, 5-OH), 3.40 ～ 3.59 (4H, m, 1, 5-
H), 3.37 ～ 3.42 (3H, m, 2, 3, 4-H);13CNMR(DM-
SO-d6 , 75MHz)δ:63.2(C-1 , C-5), 72.9(C-2, C-3,
C-4)。以上波谱数据与文献对照一致 [ 10] ,故鉴定
该化合物为侧金盏醇。
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