全 文 ：液置于 50mL容量瓶中用 triss 缓冲液定容 , 用发光免疫法测
定其中胰岛素含量 ,以 0h 的含量为 100%计算其他时间胰岛
素相对百分含量;结果(见表 2)。
表 2　配伍液稳定性试验结果
时间/ h pH 值 胰岛素含量/ % 不溶性微粒数/粒·mL -1≥10μm ≥25μm
0 6.72 100 10.9 0.5
1 6.78 98.09 10.6 0.6
2 6.75 97.77 11.2 0.4
3 6.72 96.64 9.2 0.4
4 6.68 96.14 9.0 0.4
5 6.70 75.46 9.9 0.6
6 6.72 70.30 10.8 0.4
3　讨论
实验结果表明 , 室温(25℃)时胰岛素注射液与门冬氨酸
钾镁注射液在 5%葡萄糖注射液中配伍 , 6h 内其外观 、pH 值
无明显变化;不溶性微粒数符合规定;然而胰岛素含量在 4h
后变化超过 10%, 提示胰岛素注射液与门冬氨酸钾镁注射液
在 5%葡萄糖注射液中室温下可配伍应用 , 但应在 4h 内用
完。
参考文献
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学分册 , 2004 , 24(3):194.
〔2〕国家药典委员会编.中华人民共和国药典二部〔S〕.北京:化学工
业出版社 , 2005:附录 66.
〔3〕国家药典委员会编.中华人民共和国药典二部〔S〕.北京:化学工
业出版社 , 2005:附录 61.
D-101大孔吸附树脂富集粉葛中总黄酮的工艺优选
李锋涛1 ,陈　毓1 ,黄文强1 ,严国俊2(1.江苏畜牧医学院 泰州 225300;2.南京中医药大学 南京 210046)
摘要:目的　对粉葛中总黄酮有效部位采用 D-101大孔树脂进行富集纯化 ,为工业大生产提供实验依据。方法　采用静态与动态吸附一解吸
附两种方法 ,以总黄酮吸附率 、解吸附率及纯度作为评价指标 ,对大孔吸附树脂的吸附容量 、洗脱溶媒及上样时药液浓度 、上样速率 、洗脱速率 、
树脂径高比 、加盐处理等参数进行优化。结果　通过对各项参数的优选 ,确定了最佳工艺。结论　该法切实可行 ,纯化效果好 ,适合工业大生
产。
关键词:粉葛;总黄酮;大孔吸附树脂;工艺优选
中图分类号:T Q460.4　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2008)-012-0013-03
作者简介:李锋涛 ,男(1980-)。主要从事中药新药研究。职称:助
教。联系电话:13961019753 , E-mail:Lili-2006@163.com
　　粉葛为豆科(Legum inosae)植物甘葛藤 Pueraria thamsonii
Benth 的干燥根。为《中国药典》收载的常用中药材 , 在我国
具有悠久的应用历史。性平 ,味甘辛 , 具有解肌退热 ,生津 ,透
疹 ,升阳止泻的功效。总黄酮为粉葛的主要有效部位 , 现代研
究表明 , 粉葛总黄酮能降低血压 ,使冠脉血流量明显增加 , 对
血管平滑肌有明显的松弛作用 ,可降低外周阻力 , 对改善正常
心肌和缺血梗塞心肌的代谢均有良好的作用 , 还具有提高学
习记忆 ,抗氧化 , 抗癌等作用。
目前利用粉葛总黄酮开发的药物制剂有通塞脉片 、通脉
粉针 、愈风宁心片 、葛根黄酮胶囊等。利用大孔吸附树脂分离
纯化葛根总黄酮是一种常用的方法 ,所得总黄酮杂质少 、纯度
高 ,且具有操作简便 、成本较低 、树脂可反复使用等优点 ,适于
工业化规模生产。本试验选用 D-101 型大孔树脂 , 对粉葛中
的总黄酮进行富集纯化 ,并优化了各项参数 , 现报道如下。
1　仪器与材料
UV-2401(日本岛津);bp211D 型电子天平(德国赛多利
斯公司);D-101 型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公
司)。葛根素对照品(供含量测定用 ,批号:752-200108 中国药
品生物制品检定所)。粉葛购于南京市医药总公司 , 经南京中
医药大学陈建伟教授鉴定为豆科(Legum inosae)植物甘葛藤
Pueraria thamsonii Benth 的干燥根。
2　试验及结果
2.1　大孔树脂的预处理　取 D-101 大孔吸附树脂适量 , 用纯
化水浸泡 24h , 漂洗干净 , 倾去水液 , 再以 95%的乙醇浸泡
24h ,湿法装柱 , 继续用同浓度乙醇冲洗至流出液加等量水几
乎不产生白色浑浊为止 ,再以水冲洗至无醇味。
2.2　样品液的制备及其总黄酮含量测定　称取粉葛400g , 用
70%乙醇回流 3 次 , 每次 8 倍量 , 每次 2h。 合并提取液 , 减压
回收乙醇 , 浓缩至 400m L(药液∶药材=1∶1), 备用。照《中国
药典》 2005 年版一部附录 ⅤA 紫外-可见分光光度法 , 以葛根
素为对照品 , 以随行试剂为空白 ,测定波长 250nm , 采用标准
曲线法 , 测定提取液(药液∶药材=1∶1)中总黄酮的含量 , 结果
为 100.08mg·mL-1 。
2.3　树脂饱和吸附容量的确定　采用过饱和法确定树脂吸
附容量:取 10mL已预处理过的树脂 , 平行 3 份 , 分别湿法装
柱 , 每份加上述样品液 15mL , 以 3-4BV/ h(BV 为一个柱体积
单位)的速率上样 ,重复上样 1次。静置 2h 后 ,以水洗至洗脱
液无色 , 收集加样时流出液及水洗脱液 , 合并 , 定容至
250mL。精密吸取此液 1mL 水浴蒸干 ,以甲醇溶解并定量转
·13·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 20 No.12 2008
移至 25m L 容量瓶中 , 加甲醇至刻度;再从此液中精密吸取
1mL 置 25mL容量瓶中加水至刻度。以随行试剂为空白 , 在
250nm 处测定吸光度(A),以标准曲线法测定含量 , 计算溶液
中总黄酮含量 ,即为总黄酮残留量。并计算树脂吸附容量 ,结
果(见表 1)。
表 1　D-101大孔吸附树脂吸附容量测定结果
编号 总黄酮残留量(mg)
总黄酮上
样量(mg)
总黄酮吸
附量(mg)
吸附容量
(mg·mL -1)
平均值
(mg·mL -1)
RSD
(%)
1 916.76
2 944.60
3 972.44
1501.20
584.44 58.44
556.60 55.66 55.66 2.1
528.76 52.88
注:总黄酮上样量=上样量×药液总黄酮含量
总黄酮吸附量=总黄酮上样量-总黄酮残留量
吸附容量=总黄酮吸附量/树脂量
从结果可以看出 , D-101 大孔树脂对粉葛提取液中总黄
酮的饱和吸附容量为 55.66mg·mL-1树脂 , 换算为药材
0.5562g 生药/m L树脂 , 以浓度为 1∶1(药液∶药材)的药液计
每毫升树脂饱和上样量为 0.5562mL。
2.4　洗脱溶媒的确定　根据预试验 ,拟选择 50%以上的乙
醇作洗脱溶媒 ,再通过试验确定合适的乙醇浓度。取直径为
2cm×30cm 的玻璃层析柱 5 根 , 每根装已预处理过的树脂
30m L ,按饱和上样量的 80%上样 ,即浓度为 1∶1(药液∶药材)
的药液 13.3mL , 上样静置 2h 后 ,先以水洗脱 , 至流出液几乎
无色 ,再分别以 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇洗脱 , 收
集洗脱液 ,其中前 6BV 为一流份 ,再以 2BV 为一流份 ,收集至
10BV , 对每一流份测定其中总黄酮含量 , 计算解吸附率 、累积
解吸附率。并将所得洗脱液减压浓缩 、干燥 , 得浸膏 ,计算浸
膏中总黄酮纯度 ,结果(见表 2)。
从结果可以看出 ,不同浓度乙醇洗脱总黄酮的解吸附率
都达到了 70%以上 ,洗脱所得总黄酮的纯度也达到了 60%以
上 ,基本达到了纯化的要求。各浓度乙醇前 6BV 洗脱液中的
总黄酮解吸附率已达 70%以上 ,后 6BV 中所含的总黄酮已很
少 ,表明前 6BV 已基本洗脱完全;从解吸附率及总黄酮纯度
看 ,虽然 90%乙醇的解吸附率最高 , 但纯度相对减少。 考虑
工业大生产实际操作及生产成本等因素 , 决定洗脱溶媒采用
80%乙醇洗脱 ,并收集 6BV 的洗脱液。
表 2　不同浓度乙醇洗脱总黄酮解吸附率及所得浸膏总黄酮纯度
乙醇浓度(%)
总黄酮解吸附率(前 6BV)(%)
总黄酮累积解吸附率(10BV)(%)
浸膏总黄酮纯度(%)
50 71.75 76.00 61.73
60 75.21 79.20 63.12
70 79.33 81.44 60.19
80 82.50 84.43 69.50
90 86.35 86.86 66.49
注:总黄酮解吸附率=洗脱液中含量/上样量×100%,总黄酮纯度=
浸膏中总黄酮含量/浸膏重量×100%
2.5　洗脱工艺各参数的优选　在确定了洗脱溶媒后 , 下面进
一步对各项洗脱参数进行优选:上样时药液浓度 、上样速率 、
洗脱速率 、树脂径高比等。
2.5.1　上样时药液浓度的优选:取药液 4.5m L(饱和上样量
的 80%)5 份 ,每份分别按药液∶药材(1∶1 、2∶1 、3∶1、4∶1 、5∶1)
不同比例稀释 , 然后分别加入到五个各盛放 10m L 树脂的小
烧杯中。每 10min 搅拌一次 , 每 20min 精密吸取0.1mL , 按前
法测总黄酮含量 , 即为总黄酮残留量 , 并计算总黄酮残留率 ,
观察其随时间的变化趋势。结果(见图 1)。
图 1　树脂对不同浓度药液中总黄酮吸附速率的影响
注:总黄酮残留率=总黄酮残留量/总黄酮上样量×
100%
由上图可以看出 , 各浓度药液中总黄酮残留率均随吸附
时间的增加而下降 , 说明吸附时间越长 , 吸附量越大;其中浓
度为 1∶1 的药液总黄酮残留率随时间变化的幅度最小 , 2h 后
的残留率也最低 , 表明吸附快而稳定 , 吸附率也较高。因此确
定以药液∶药材=1∶1 上样 ,上样后静置吸附 2h 以上。
2.5.2　上样速率的优选　取直径为 2cm 的层析柱 4根 , 分别
加入树脂 20m L ,按饱和吸附量的 80%上样 , 即浓度为 1∶1 的
药液 8.9mL , 分别以 2 、4、6、8BV/h 的速率上样 , 上样后静置
2h , 然后以水洗脱至几乎无色 , 收集加样时流出液及水洗脱
液 , 合并 ,测定其中总黄酮含量 , 即为总黄酮残留量 , 并计算残
留率 , 结果上样速率(BV·h-1)2 , 4 , 6 , 8h 的总黄酮残留率
(%)分别为 6.95%, 7.02%, 7.23%, 7.35%。
由结果可知 ,随着上样速率的加快 ,总黄酮残留率有所增加,
即总黄酮吸附量减少,但各速率之间差异不大,因此考虑实际操
作 、节省时间等因素 ,以不超过 4BV/h 的速率上样为宜。
2.5.3　洗脱速率的优选:取 2cm ×30cm 的层析柱 5 根 , 分别
加入树脂 20m L ,按饱和吸附量的 80%上样 , 即浓度为 1∶1 的
药液 9.0mL , 按 4 BV/ h 的速率上样 , 上样后静置 2h , 以水洗
至几乎无色 , 再用 80%的乙醇分别按 2 、3 、4 、5 、6BV/ h 的速率
洗脱 , 每 2BV 收集一流份 , 洗至 6BV , 每一流份测定总黄酮
量 , 即为总黄酮洗脱量 ,并计算解吸附率。结果(见图 2)。
图 2　不同洗脱速率对总黄酮累计解吸附率的影响
由上图可以看出 , 各洗脱速率下 ,总黄酮累计解吸附率均
随洗脱倍数的增加而增大;相同洗脱体积下 , 总黄酮累计解吸
附率随各洗脱速率的增大而减小 。综合考虑实际操作及节约
时间等因素 , 以不超过 3BV/ h 的速率洗脱为宜。
·14·
海峡药学　2008年　第 20卷 第 12期
2.5.4　树脂柱径高比的优选:取内径为 2cm 的层析柱 5 根 ,
按径高比 1∶9、1∶11 、1∶13 、1∶15分别装入树脂 ,即树脂高度为
18 、22 、26 、30cm , 计算得树脂体积分别为:56.52、69.08 、
81.64 、91.06mL , 按饱和上样量的 80%、以不超过 4BV/ h 的
速率分别上样 ,上样后静置 2h ,以水冲洗至几乎无色 , 用 80%
的乙醇洗脱 ,收集 6BV 的洗脱液 , 测定总黄酮含量 , 即总黄酮
洗脱量 ,并计算解吸附率 , 结果(见表 3)。
表 3　径高比优选结果
编号 树脂径高比 总黄酮解吸附率(%)
1 1∶9 76.98
2 1∶11 79.84
3 1∶13 82.68
4 1∶15 85.23
由结果可以看出 ,随着径高比的增大 , 总黄酮的解吸附率
也增加 ,考虑实际操作等因素 , 确定树脂径高比为 1∶13以上。
2.5.5　加盐对总黄酮吸附率的影响:据文献报道 , 有些药材
提取液上样时加入适量的无机盐 ,能加快树脂的吸附速度 ,增
加吸附容量。本试验在粉葛提取液中加入了 10%的 NaCl ,进
一步考察了加盐条件下 D-101 大孔吸附树脂对总黄酮的吸附
影响。
取浓度为 1∶1 的药液 9.0mL 两份 , 一份药液加入 NaCl
0.9g(浓度为 10%), 另一份不加盐 , 然后分别以同样速率上
样到两根含10m L树脂的柱上。先做静态吸附试验 , 每 10min
搅拌 1次 , 每 20min 取样 1 次 0.1mL ,测定样品液中总黄酮含
量 ,即为总黄酮残留量 , 计算残留率 , 直到上样后 2h。 然后先
以水冲洗至流出液几乎无色后 ,用 80%乙醇洗脱 , 前 6BV 为
一流份 , 再以 2BV 为一流份 , 收集至 10BV , 对每一流份测定
其中总黄酮含量 ,即为总黄酮洗脱量 , 并计算解吸附率 , 结果
(见图 3 、4)。
由图 3 可以看出 ,在相同吸附时间内 , 加盐后总黄酮的残
留率与不加盐相比 ,没有减小反而增加 ,说明吸附量减小了;
而且随着吸附时间的变化 ,加盐后残留率变化幅度增大 ,说明
吸附速率也减慢了。
图 3　加盐处理对总黄酮吸附速率的影响
注:总黄酮残留率=总黄酮残留量/总黄酮总量×100%
图 4　加盐处理对总黄酮解吸附率的影响
　　由图 4 也可以看出 , 总黄酮累计解吸附率在加盐之后也
有所减小 , 因此综合考虑 ,药液上样前不需要加盐处理。
通过以上对各项参数的优选 ,基本确定了大孔吸附树脂
纯化粉葛总黄酮的工艺:选用 D-101 大孔吸附树脂 ,树脂径高
比在 1∶13 以上 ,以浓度为 1∶1(药液∶药材)的药液 , 按总黄酮
吸附容量 44.53mg·mL -1树脂(饱和吸附容量的 80%)上样 ,
上样速率不超过 4BV/h , 上样后静置 2h , 然后以水冲洗至水
几乎无色 , 改用 80%的乙醇以不超过 3BV/ h 的速率洗脱 , 收
集 6BV 的洗脱液 , 即得。
2.6　验证　按以上优选的各项参数 , 进行了 3 批验证实验 ,
结果表明 , 最终总黄酮的解吸附率到达了 80%以上 , 纯度也
到达了 70%以上 ,基本到达了纯化的要求。
3　讨论
3.1　在进行洗脱溶媒的优选时 ,按大孔吸附树脂对粉葛总黄
酮的饱和吸附容量上样 ,结果发现最后总黄酮的解吸附率较
低 , 只有 60.60%, 分析原因可能是总黄酮没有被树脂完全吸
附 , 上样后用水洗脱时损失较大 ,因此综合考虑后决定按树脂
饱和吸附容量的 80%上样 ,结果总黄酮的解吸附率提高到了
80%以上 , 达到了纯化的要求。
3.2　后期的中试放大试验也验证了此项工艺 , 并进一步优化
了各项参数。纯化后的总黄酮纯度较高 ,效果好 , 适合于工业
大生产。
参考文献
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