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。
1 0
9 1 89年 3月
高 等 学 校 化 学 学 报
E H C MI A CL JO UR NAO LF CHI NE SEV I UNE RSIT I E S
No
。
3
3 0 8、 3 1 0
刀豆组织电极用于眠测定的研究 `
沈国励 马 铭 曾鸽鸣 俞汝勤
(湖南大学化学化工系 )
谢锦云 张梅芬
(湖南师范大学生物系 )
关锐词 生物传感器 组织切片电极 腮的测定 刀豆切片一电极
关于生物组织传感器的研究 , A nr ol d 有详细综述川 . 刀豆中 包 含丰 富 的脉酶 , 本
文报道将刀豆切片与自制石墨内导 P v C 膜 p H 电极型氨气敏电极 偶 合 制成了刀豆切片
脉电极 , 对其响应特性 、 介质条件 、 固定化及切片厚度等因素进行了研究 , 取得了较满
意的结果 。
1 仪器与试剂
1
.
1 仪器 xP S 一 2 15 型离子活度计 ; P H S 一 3 C 型酸度计 ; 磁力搅拌器 ; C S 5 01 型超
级恒温槽 ; 冰冻切片机 .
1
.
2 试剂 所用氨基酸均为生化试剂 , 其余试剂均为 A . R . 级 , 实 验 用 水为去离
子水再蒸馏 。
K H Z PO
。 一
N a O H 缓冲液的配制 : 2 5 0 m L 0 . 2 m o l / L 磷酸二氢 钾 溶液 和 3 3 o m L o 。 2
m ol / L N
a O H 溶液与 40 0 m L 水混合 , 用 N a O H 或 H C I溶液调节 p H 至 9 . 0 . p H 值为 8 . 5
的 H 3 OB 3 一 K C I一 N a o H
、
K H
Z
OP
; 一
N a
Z B 。 O ,
·
l o H
2
0
、
N a
Z
B
`
O
, · l o H Z O
~
H C I等缓冲液按
常法 〔 2 ’配制 . T ir s 缓冲液系由 。 . 2 m ol / L 的三经 甲基 氨基甲烷 溶液以 l m ol / L 盐酸调至
p H 8
.
5配制 。
刀豆 (本地产 ) 组织切片浸泡于含 0 . 02 % C H C I , 的 K H Z p O 一N a O H 缓冲溶液中 , 在
冰箱中 4 ℃贮存 , 标准脉溶液也须在 4 ℃下存放 .
刀豆切片的交联 : 将刀豆切片置于 5 %明胶液中片刻后取出在 25 ℃下凉干 15 而 n ,
再放入 1 . 25 %戊二醛中交联 3 m in , 并用上述浸泡缓冲液充分洗涤后即成 .
2 电极的装置 、 使用与存放
刀豆组织 电极的结构如图 1 。 在氨气敏电极的气透
膜上紧贴一片均匀的刀豆组织切片 , 外罩尼龙 网即成 .
电极使用前需经 10 一 ` m ol / L 脉溶液浸泡活化约 s m ih ,
并放入缓冲液中洗至空白电位值 (约 1 0 Jn V 左右 )再进
行测定 , 不 用时将 电极 端 部 浸于 含 。 . 02 % C H CI 。 的
K H : PO 一N a O H缓冲液中于 4 ℃存放 。
3 实验步骤
移取 s m L p H值为 9 . 0的K H Z P O ; 一 N a O H 缓 冲 液于
收稿日期 : 19 8 7一 O了一 16 . 联系人 : 沈国励 .
. 国家自然科学基金资助课题 .
、 、 厂 、 g C }电极
聚四氟乙烯外牛1
I ) \ C 杆
石墨 捧
聚四 氟乙烯帽
I , V C膜
边 {粼
气透膜
刀豆切片
尼龙网
图 1 组织电极示意图
1 0L m洁净 、 干燥的小烧杯中 , 插入电极 , 开启磁力搅拌器并调至恒速 ,待读数稳定后加入
。 . s m L脉标准液 , 记录 l m in 内电位值变化 (刁E /水 , 水 = l m诬n) 或 稳 态 电位 值 ( E )
对 lg C 作图绘制标准曲线 .
4 缓冲体系及试验条件的选择
选用 5 种 p H 为 8 . 5的缓冲体系 , 试验电极对脉的响应性能 , 结 果 见表 1 . 在这 些
介质中 , 以 K H Z P O 。 一 N a O H 缓冲液中测得电极对脉的线性范围较宽 , 且 线 性区的斜率
较大 , 本实验中以 K H Z P O ` 一 N a O H 作电极的测试介质 . p H值在 8 . 。~ 9 . 0 变化对试 验结果
无显著影响 . p H 值大于 8 . 0时 N H 3 的转化率即符合氨电极响应的要求 , 9 . 。 时的线性 、
斜率及重现性较优 , 超过 9 . 0时生物组织电极线性变窄 , 响应斜率变小 , 系组 织 切片中
脉酶活力降低所致 . 温度升高 , 反应速率增大 . 为减缓刀豆组织腐坏 , 仍以室温测定为
宜 。 加入少量 ( 0 . 02 % )氯仿作防腐剂 , 新鲜刀豆切片在 4 ℃可保存约 2 个月 , 新装电极
约可使用 2 周 . 切片厚度变化于 150 一 1 0 0 0 拜m对结果无显著影响 .
表 1 介质对电极性能的影响
介 质 线性范围 (m ol / L ) 斜率 (m V / p C )
T r is缓冲液 4 . 6 x 10 一 3 ~ 4 . 6火 10 一 2 54 . 2
K H
2 P 0 百一 N a Z B ; 0 2 1 . 6又 1 0一 2、 4 . 6 x 10一 1 4 5 . 2
H
3 B 0
3一
K C I一 N a 0 H 2
.
0 x 1 0一 2~ 4
.
6 x 1 0 一 1 6 6
.
4
N a 2 B 4 0 , 一 H C I 4
.
6 K 10一 3 、 4 . 6大 10一 1 4 8 . 4
K H
Z
P O
4 一 N a 0 H 4
.
6 x 10 一 4 、 4 . 6 x 10一 2 5 1 . 1
5 电极的响应特性
电极的线性腮浓度范围 4 . 6 x l 。一 ` 一 1 . 0 只 1-0 ’ m o l/ L ; 稳 态电位 响应 ( E ) 的回归
方程 E = 一 2 4 。 6 十 6 1 . 8 1g C , 相关系数 o 。 9 9 8 6 ; 电极的实际检测下限 4 . o x l 。一 ’ m ol / .L
如取 刁E /水 (水 二 l m i )n 对 l g C 作图 , 线性回归方程为 刁E /水 = 109 . 68 十 3 3 . 34 l g C , 相关
系数 一 0 . 9 9 6 3 . 在本实验条件下测得酶反应的 M ihc a e ils 常数 k 、 为 3 . 39 x l o 一 ’ m o l/ .L
电极的静态响应时间为试液 浓度在 5 . 0 x 2 0一 ’ ~ 5 . 0 x 20一 ’ m O I/ L 时 , 4~ 6 m i n , 1 . o X
x l o一 2~ z
。
o 义 1 0一 ` m o l / L 时 , 1 0~ 12 m i n ; 簇 5 . 0 又 2 0一 ’ m o l / L 时 , 7~ g m i n 。 各 浓
度下动力学响应的恒定值均在 0 ~ 2 m in 之间 . 测试时采用动力学响应方法 , 可 获快速
的测定结果 , 重现性也好 .
6 干扰及 回收试验
多数生物的局部组织 一切片一仅有较少种类的酶 , 使这类电极较一般的微生物电极具有
较好的选择性 〔” , 而某些生物的全组织切片 , 则可能导致一些杂酶的副反应发生 . 本文
试验了 10 种可能干扰物质对脉液测定的影响 , 结果列于表 2 . 除精氨酸和谷氨酞胺略有
干扰外 , 多数物质的影响均河忽略不 计 .
表 2 共存物质的干扰 ( 共存物浓度为 1 0一 Z m ol / L )
共存物质
组氨酸
膀胧氨基酸
谷氨酸
赖氨酸
精氨酸
电位值对应的睬浓度 ( m ol /L )
< 5
.
0 x 1 0一 。
< 5
.
0 x 1 0一 6
< 5
.
o x 1 0
一 。
< 5 0 x 10
一 。
5 0 x 10一
共存物质
氨基丙酸
氨基乙酸
谷氨酸胺
N a N 0 2
N a N O
3
电位值对应的腺浓度 (m ol / L )
< 5
.
6 x 10
一 。
< 5
.
6 x 10一 。
1
.
3 X 10一 `
< 5
.
o x 下0一 。
< 5
.
o x 10 一 。
一 3 0 9 一
采用动力学响应法测定了 9份样品的平均回收率为 9 8. 9% , 标准偏差 1 . 8% 。 此外 ,
本文中的电极已用于兔血清和猪血清中脉的测定 , 详情将另文报道 。
参 考 文 献
A
r n o ld M A
.
OI n 一 s e l e e t i v e E l e e t r o d e R e v
,
1 98 6
: 8 : 8 5
杭州大学化学系分析化学教研室编 . 分析化学手册 (第二分册 ) , 北京 : 化学工业出版社 , 1 982 : 17
(责任编拜 : 毕素香 )
A J a
e k B e a n T i s s u e E l e e tr o d e f o
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Ab s t r a e t A i a e k b e a n t i s s u e s e e t i o n e l e e t r o d e s e n s i t i v e t o u r e a h a s b e e n
p r e p a r e d b y e o u p l i n g a i a e k b e a n s l i e e w i t h a n a m m o n i a g a s
一 s e n s i n g p r o b e u s i n g
PV C m e m b r a n e p H e l e e t r o d e a s t h e i n t e rn
a l e l e m e n t
。
T h e p o t e n t i o m e t r ic r e s p o n s e
e h a r a e t e r i s t i e s o f t h 王5 n e w e l e e t r o d e u n d e r s t e a d y 一 s t a t e a n d d y n a m i e e o n d it i o n
w e r e e x a而 n e d 。 T h e s t e a d y 一 s t a t e l i n e a r r e s p o n s e r a n s e o f t h i s e l e e t r o d e 15
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p H
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e a w a s d e t e r面 n e d b y u s i n g dyn a m i e m e t h o d , w i t h a n
a v e r a g e r e e o v e r y o f 0 8
. 。% a n d a s t a n d a r d d e v i a t i o n o f 2 . 5 % .
K e y w o rd s B i o s e n s o r
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s s u e s e e t i o n e l e e t r o d e
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一 3 10 一