全 文 ：鸡眼草总黄酮的提取工艺条件及其体外抗氧化性
王春景 胡小梅 刘高峰 李 晶 (蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233000)
〔摘 要〕 目的 研究鸡眼草总黄酮的提取工艺条件及其体外抗氧化活性。方法 通过单因素实验和正交试验对鸡眼草总黄酮的提取工艺条
件进行优化。采用清除羟自由基(·OH)、清除超氧阴离子自由基(O

2 )、抗 O

2 活力和总抗氧化能力(T-AOC)等方法评价其黄酮类化合物的体外抗
氧化活性。结果 鸡眼草总黄酮得的最佳提取工艺条件为:取温度为 70℃、乙醇浓度为 55%、提取时间为 2. 5 h、料液比为 1∶ 50。随着鸡眼草总黄酮
浓度的增加，对·OH和 O

2 的清除率逐渐升高，抗 O

2 活力和 T-AOC亦随之增强。结论 优选的鸡眼草总黄酮提取工艺合理、稳定可行，鸡眼草总
黄酮具有一定的体外抗氧化活性。
〔关键词〕 鸡眼草;黄酮类化合物;提取工艺条件;抗氧化性
〔中图分类号〕 R284. 2 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2012)21-4697-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 21. 041
基金项目:安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2012B109) ;蚌埠医学
院优秀人才基金资助(2006BR068)
第一作者:王春景(1972-) ，男，讲师，硕士，主要从事天然植物资源开发
利用研究。
鸡眼草蝶形花科鸡眼草属的一年生草本植物，俗称掐不
齐、人字草等，生于路边、林下、田野、山地、丘陵。鸡眼草具有
抗炎镇痛〔1，2〕、止血〔3〕等生物活性，用于治疗婴幼儿迁延性慢性
腹泻疗效显著〔4〕，对 IgA 肾病模型大鼠具有一定的治疗作
用〔5〕，鸡眼草也是国内苗医用于骨伤疾病的苗族药物之一〔6〕。
鸡眼草含有芹菜素、槲皮素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山萘
酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷等黄酮类化合
物〔7〕，鸡眼草黄酮类化合物具有抑制白细胞介素-5 的生物活
性〔8〕。已有研究表明很多植物黄酮类化合物具有较强的清除
自由基等抗氧化作用〔9 ～ 11〕，关于鸡眼草总黄酮的提取工艺研究
及其抗氧化活性研究均未见具体报道，本文研究了鸡眼草总黄
酮的提取工艺条件及其体外抗氧化活性，以期为鸡眼草黄酮类
化合物的进一步开发利用提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器 芦丁:南京替斯艾么中药研究所;邻苯三酚
Amersco公司分装;Tris Feinbiochemica Heidelberg 公司;抗超氧
阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒、总抗氧化能力
(T-AOC)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;乙醇、石油
醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、水杨酸、
H2O2、FeSO4、盐酸等均为国产分析纯。实验材料鸡眼草九月中
旬采于蚌埠市郊区。UV-1800 紫外 /可见分光光度计:北京瑞
利分析仪器公司。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 总黄酮的提取工艺
1. 2. 1. 1 提取方法 鸡眼草 65℃烘至恒重后粉碎，乙醇浸提，
蒸干所得浸膏用温蒸馏水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙
酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取部，蒸干得鸡眼草
粗黄酮粉。
1. 2. 1. 2 总黄酮含量的测定〔12〕 精密称取芦丁 0. 01 g，用体
积分数 30% 的乙醇溶解并定容至 100 ml，配成浓度为
0. 1 mg /ml的芦丁标准液，吸取芦丁标准液 0、1、2、3、4、5、6、7、
8 ml于 9 支刻度试管中，分别加 0. 3 ml 5% NaNO2，摇匀，静置
6 min;再加 10%Al(NO3)3 0. 3 ml，摇匀，静置 6 min;再加入 4%
NaOH 4 ml，用 30%乙醇定容至 10 ml，摇匀，静置 15 min，以 0
浓度为参比，波长 510 nm测吸光度，将芦丁浓度与吸光度进行
线性回归得标准曲线:A = 15. 617c － 0. 004 1，R2 = 0. 999 8。样
品中的黄酮含量测定方法为:将所得粗黄酮粉用适量 30%乙醇
溶解后，取 1 ml，按上述标准曲线制作的方法测定吸光度，再由
标准曲线计算出黄酮浓度。
1. 2. 1. 3 单因素实验 选取温度、乙醇浓度、料液比和时间 4
个因素分别做单因素实验，考察它们对总黄酮得率的影响。具
体为:分别称取鸡眼草粉末 1 g，按料液比 1∶ 30、65%的乙醇、提
取3. 0 h，考察不同提取温度(55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、
80℃)对其总黄酮得率的影响;以料液比 1 ∶ 30、65℃、提取
3. 0 h，考察不同乙醇浓度(50%、55%、60%、65%、70%、75%)
对其总黄酮得率的影响;按 65℃、65%的乙醇、提取3. 0 h，考察
不同料液比(1∶ 25、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40、1∶ 45、1∶ 50、1∶ 55)对其总
黄酮得率的影响;以料液比 1∶ 30、65℃、65%的乙醇，考察不同
提取时间(2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0 h)对其总黄酮得率的
影响。
1. 2. 1. 4 正交试验设计 在以上单因素实验的基础上，每因
素选取 3 个水平，设计 L9(3
4)正交试验，从而确定最佳提取工
艺条件，各因素水平设计见表 1。
表 1 正交试验因素水平设计
水平
A提取温度
(℃)
B乙醇浓度
(%)
C提取时间
(h)
D料液比
(g∶ ml)
1 60 55 2. 5 1∶ 40
2 65 60 3. 0 1∶ 45
3 70 65 3. 5 1∶ 50
1. 2. 2 抗氧化活性测定
1. 2. 2. 1 羟自由基(·OH)清除实验〔13〕 水杨酸法，向反应
体系中分别加入 6 mmol /L FeSO4 溶液 2 ml、6 mmol /L 水杨酸-
·7964·王春景等 鸡眼草总黄酮的提取工艺条件及其体外抗氧化性 第 21 期
乙醇溶液 2 ml、浓度为 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、
4. 0 mg /ml的黄酮液 2 ml，摇匀，再各加入 6 mmol /L H2O2 2 ml，
用蒸馏水定容至 10 ml，摇匀，37℃水浴 30 min，以蒸馏水为参
比，510 nm测定各吸光度 Am，同样方法测定不加黄酮液的吸光
度 A0，不加 H2O2 各黄酮液的本底吸光度 An。
1. 2. 2. 2 超氧阴离子自由基(O

2 )清除实验
〔13〕 邻苯三酚自
氧化法，向反应体系中各加 25℃预热 20 min的 Tris-HCl缓冲溶
液(pH = 8. 2)5 ml、浓度为 0. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、1. 5、
1. 75、2. 0 mg /ml的黄酮液 2 ml、双蒸水 2 ml，摇匀，再分别加入
25℃预热 20 min的 3 mmol /L邻苯三酚 1 ml，摇匀，以不加邻苯
三酚和黄酮液为参比，波长 325 nm每 30 s测一次吸光度，至反
应启动后的第 6 分钟，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标进
行线性回归，得到的直线斜率为反应速率 ΔA，以同样方法测定
不加黄酮液时邻苯三酚自氧化速率 ΔA0。
1. 2. 2. 3 抗超氧阴离子自由基(O

2 )活力实验 按照测定试
剂盒的操作方法进行实验，抗 O

2 活力单位定义为:在反应体
系中，每毫升黄酮液在 37℃反应 40 min 所抑制的 O

2 相当于
1 mg的维生素 C所抑制的 O

2 的变化值为一个活力单位。
1. 2. 2. 4 总抗氧化能力(T-AOC)测定 按照测定试剂盒的操
作方法进行实验，T-AOC单位定义为:在 37℃时，每分钟每毫升
黄酮液使反应体系的吸光度值每增加 0. 01 时，为一个总抗氧
化能力单位。
1. 3 统计学方法 采用方差分析进行组间比较。
2 结 果
2. 1 单因素实验结果 由图 1 可知，随着温度升高，总黄酮得
率随之提高，75℃时又有所降低，故选择 60℃、65℃、70℃作为
正交试验温度的优化水平。由图 2 可看出，乙醇浓度为 55%时
总黄酮得率最高，随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率又有所下
降，并趋于平稳，故选择 55%、60%、65%作为进一步提取优化
的条件。由图 3 可知，提取时间为 2. 5 h和 3. 0 h时，总黄酮得
率基本无变化，随着提取时间的进一步延长，总黄酮得率呈下
降趋势，故选择 2. 5 h、3. 0 h、3. 5 h作为进一步提取优化选择的
条件。图 4 表明，随着料液比的增加，总黄酮得率亦随之增加，
特别是 1∶ 40 ～ 1 ∶ 50 时增加较快，随后又趋于平稳，故选择 1 ∶
40、1∶ 45、1∶ 50 作为正交试验料液比的进一步优化水平。
2. 2 正交试验结果与分析 正交试验结果表明(表 2) ，提取
温度、乙醇浓度、提取时间、料液比 4 因素对鸡眼草总黄酮得率
的影响为大小为:料液比 ＞提取温度 ＞提取时间 ＞乙醇浓度
(即 D ＞ A ＞ C ＞ B) ，最佳提取工艺条件为:A3B1C1D3，即提取温
度为 70℃、乙醇浓度为 55%、提取时间为 2. 5 h、料液比为 1∶
50 时，鸡眼草总黄酮的提取得率最高。进一步方差分析表明
(表 3) ，试验选取的 4 因素的 3 个水平，提取温度、乙醇浓度和
提取时间这 3 因素的 3 个水平对鸡眼草总黄酮得率的影响差
异不显著(P ＞ 0. 05) ，料液比的 3 水平间差异显著(P ＜ 0. 05)。
通过各因素的 F值看出 FD ＞ FA ＞ FC ＞ FB，这与表 2 直观得出
的 4 因素影响大小(D ＞ A ＞ C ＞ B)结果是一致的。
表 2 的正交试验设计中不包括最佳提取工艺条件
A3B1C1D3，需追加实验进行验证。将 5 份鸡眼草粉末按提取温
度为 70℃、55%乙醇、料液比为 1∶ 50、提取 2. 5 h，计算总黄酮得
率为(2. 10 ± 0. 95)%。在 A3B1C1D3 条件下，鸡眼草总黄酮得
率高于表 2 设计的各组合，所以按 A3B1C1D3 条件提取鸡眼草
总黄酮，得率较高，且实验稳定性也较强。
表 2 正交试验设计及结果
试验号
A提取温度
(℃)
B乙醇浓度
(%)
C提取时间
(h)
D料液比
(g:ml)
总黄酮得率
(%)
1 1 1 1 1 1. 89
2 1 2 2 2 1. 88
3 1 3 3 3 1. 97
4 2 1 2 3 2. 00
5 2 2 3 1 1. 90
6 2 3 1 2 1. 93
7 3 1 3 2 1. 98
8 3 2 1 3 2. 05
9 3 3 2 1 1. 89
T1 5. 74 5. 87 5. 87 5. 68
T2 5. 83 5. 83 5. 77 5. 79
T3 5. 92 5. 79 5. 85 6. 02
m1 1. 91 1. 96 1. 96 1. 89
m2 1. 94 1. 94 1. 92 1. 93
m3 1. 97 1. 93 1. 95 2. 00
R 0. 06 0. 03 0. 04 0. 11
表 3 正交实验结果方差分析
变异来源 自由度(df) 平方和(SS) 均方(MS) F P值
A 2 0. 006 0. 003 0. 704 0. 531
B(误差) 2 0. 001 0. 001 0. 117 0. 892
C 2 0. 003 0. 001 0. 211 0. 815
D 2 0. 019 0. 009 7. 224 0. 025
总和 T 8 0. 028
2. 3 体外抗氧化性结果
2. 3. 1 对·OH的清除作用 由图 5 可看出，随着鸡眼草总黄
酮浓度的升高，·OH的清除率逐渐增加，且其浓度与清除率之
间存在一定的量效关系。将浓度与清除率进行线性回归，利用
回归方程求出当清除率为 50%时的浓度，即其半数清除浓度
(EC50)为 3. 17 mg /ml。
2. 3. 2 鸡眼草总黄酮对 O

2 的清除作用 鸡眼草总黄酮对
O

2 的清除率亦随着其浓度的增加而逐渐升高 (见图 5) ，其
浓度与清除率之间亦存在一定的量效关系。将浓度与其清除
率进行线性回归，利用回归方程求出其半数清除浓度 (EC50)
约为1. 10 mg /ml。
2. 3. 3 抗 O

2 活力作用 由图 6 可知，鸡眼草总黄酮抗 O

2
活力单位随着其浓度的增加而逐渐增加，表明鸡眼草总黄酮
对 O

2 由一定的影响能力，这与其对 O

2 的清除作用结果
一致。
2. 3. 4 总抗氧化能力 随着鸡眼草总黄酮浓度的增加，其总
抗氧化能力单位亦随之增大 (见图 6) ，表明其总抗氧化能力
逐渐增强，这可能与其能够清除·OH 和 O

2 等自由基是
相关的。
·8964· 中国老年学杂志 2012 年 11 月第 32 卷
图 1 提取温度对鸡眼草
黄酮得率的影响
图 2 乙醇浓度对鸡眼草
黄酮得率的影响
图 3 提取时间对鸡眼草
黄酮得率的影响
图 4 料液比对鸡眼草
黄酮得率的影响
图 5 鸡眼草总黄酮对·OH和
O

2 的清除效果
图 6 鸡眼草总黄酮抗 O

2 活力和
总抗氧化能力
3 讨 论
单因素实验及正交试验结果表明，提取温度、乙醇浓度、提
取时间、料液比 4 因素对鸡眼草总黄酮得率的影响为大小为:
料液比 ＞提取温度 ＞提取时间 ＞乙醇浓度，最佳提取工艺条件
为:提取温度为 70℃、乙醇浓度为 55%、提取时间为 2. 5 h、料液
比为 1∶ 50，按此工艺条件提取，鸡眼草总黄酮的提取得率约为
2. 10%。该提取工艺条件简单易行，且重现性较好。鸡眼草总
黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除作用，
其清除率与浓度间存在一定的量效关系。鸡眼草总黄酮抗超
氧阴离子自由基活力单位和总抗氧化能力单位亦随着其浓度
的增加而增加，均表明鸡眼草总黄酮具有一定的体外抗氧化活
性，可考虑将其黄酮类化合物开发为抗氧化保健食品或生物制
品，从而促进鸡眼草的进一步开发利用。
4 参考文献
1 Tao JY，Zhao L，Huang ZJ，et al. Anti-inflammatory effects of ethanol ex-
tract from Kummerowia striata (Thunb. ) Schindl on LPS-stimulated
RAW 264. 7 cell〔J〕. Inflammation，2008;31(3) :154-66.
2 周玖瑶，黄桂英，韩 坚 . 三叶人字草抗炎镇痛作用研究〔J〕. 中国
医药导报，2007;4(2) :155-6.
3 周玖瑶，陈蔚文，黄桂英，等 . 三叶人字草止血作用研究〔J〕. 中国实
验方剂学杂志，2007;13(3) :65-6.
4 孙 洁，王 燕，丁希伟 . 鸡眼草治疗婴幼儿迁延性慢性腹泻病疗效
观察〔J〕. 现代中西医结合杂志，2010;19(5) :553-4.
5 周玖瑶，王 霞，余应嘉，等 . 三叶人字草对 IgA 肾病模型大鼠的治
疗作用〔J〕. 中药新药与临床药理，2009;20(6) :533-6.
6 曾宪平，田 兰，田华咏，等 . 骨伤科苗药整理与研究〔J〕. 中国民族
医药杂志，2007;9(1) :39-43.
7 唐人九 . 人字草黄酮类化学成分研究〔J〕. 华西药学杂志，1999;11
(1) :5-10.
8 Park KY，Lee SH，Min BK，et al. Inhibitory effect of luteolin 4-O-gluco-
side from Kummerowia striata and other flavonoids on interleukin-5 bioac-
tivity〔J〕. Planta Med，1999;65(5) :457-9.
9 Rice-Evans CA，Miller NJ，Paganga G，et al. Structure-antioxidant activity
relationships of flavonoids and phenolic acids〔J〕. Free Radic Biol Med，
1996;20:933-56.
10 Ghafar MFA，Prasad KN，Weng KK，et al. Flavonoid，hesperidine，total
phenolic contents and antioxidant activities from Citrus species〔J〕. Af-
rican J Biotechnol，2010;9(3) :326-30.
11 章丹丹，高月红，Jessica Tao Li，等 . 桑枝总黄酮的抗氧化活性研究
〔J〕. 中成药，2011;33(6) :943-6.
12 赵 爽，严铭铭，赵大庆，等 . 小飞蓬总黄酮提取工艺优选及体外抗
氧化活性研究〔J〕. 中成药，2011;33(2) :348-50.
13 贾长虹，常丽新，李 月，等 . 月季叶黄酮对自由基和亚硝酸盐的清
除作用研究〔J〕. 食品工业科技，2010;31(9) :104-6.
〔2011-08-09 收稿 2011-10-10 修回〕
(编辑 曹梦园)
·9964·王春景等 鸡眼草总黄酮的提取工艺条件及其体外抗氧化性 第 21 期