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藏药刀豆总黄酮超声提取的优化及其抗氧化活性
孔子铭， 谢建锋， 李颖晨， 王 颖， 韩泳平*
(西南民族大学少数民族药物研究所，四川 成都 610041)
收稿日期:2015-08-10
基金项目:国家“十二五”科技支撑计划 (2012BAI27B07);西南民族大学硕士点建设项目 (2015XWD-S0703)
作者简介:孔子铭 (1988—)，男 (蒙古族)，硕士，研究方向为民族药物化学。Tel:18081950783，E-mail:370559065@ qq． com
* 通信作者:韩泳平 (1965—)，男，教授，研究方向为民族药物化学。E-mail:yphan65@ tom． com
摘要:目的 优化超声提取藏药刀豆总黄酮的工艺条件，并考察其抗氧化活性。方法 采用单因素法和响应面设计
法，优化超声提取藏药刀豆总黄酮的工艺条件，并测试提取物清除氧自由基和羟自由基的能力。结果 最优提取条件
为乙醇体积分数 50. 88%，料液比 1 ∶ 20. 71，温度 72. 32 ℃，该条件下总黄酮得率为 0. 675%。而且，提取物具有清除
超氧自由基和羟自由基的能力，并与总黄酮含有量呈正相关性。结论 该方法可用于藏药刀豆中总黄酮的提取，而且
提取物具有较强的抗氧化活性。
关键词:藏药刀豆;总黄酮;超声提取;单因素;响应面设计;抗氧化活性
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)05-1163-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 05. 044
藏药刀豆又名洋刀豆、直生刀豆，是藏药中常用的一
种药材，为豆科植物刀豆 Canavalia gladiata (Jacq．)DC．
的种子，原产西印度、中美洲和加勒比海地区，我国主要
分布于长江流域及其以南各省区，以华中、华南为多［1］，
植株为茎矮生或半蔓生，荚果较蔓性刀豆小，种子白色，
肾形。其味甘，性温，归胃、肾经，功效降气止呃，温肾
助阳，可用于治疗虚寒之呃逆、呕吐，肾虚腰痛。《本草纲
目》记载，刀豆能“温中下气，利肠胃，止呃逆，益肾补
元”［2］，而藏药刀豆为卫生部公布的第一批 “药食兼用食
品”，具有良好的保健治疗作用［3］。现代药理研究表明，
藏药刀豆中的主要药用成分为刀豆球蛋白、脲酶以及黄酮
类成分等，目前对其在食品和保健品中的应用大多集中于
营养价值较高的蛋白质类成分［4］，以及具有一定抗肿瘤作
用的 L-刀豆氨酸［5］，但尚无黄酮类成分的报道。由于超声
提取法具有提取效率高、适应性广、提取药液杂质少等优
点，因此在植物有效成分的提取方面已获得较为广泛的应
用［6-7］。本实验采用响应面设计法确定超声提取刀豆总黄酮
优化条件，同时还对其体外抗氧化活性进行了初步考察，
可有益于该生物资源的合理利用。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 药材和对照品 藏药刀豆 (成都市荷花池药材市
场)。柚皮素对照品 (含有量 98%，四川成都曼思特生物
科技有限公司，批号 MUST-11041107);抗坏血酸对照品
(天津瑞金特化学品有限公司)。
1. 1. 2 试剂 石油醚 (60 ～ 90 ℃，天津市富宇精细化工
有限公司);无水乙醇 (成都海兴化工试剂厂);浓盐酸
(成都市中科试剂厂);邻苯三酚 (天津市光复精细化工研
究所);邻二氮菲 (成都化学试剂厂);磷酸二氢钠、磷酸
氢二钠、硫酸亚铁 (天津市瑞金特化学品有限公司);双
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氧水 (30%)、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷 (天津
博迪化工股份有限公司);三氯乙酸、四氢硼钠 (成都市
科龙化工试剂厂);铁氰化钾 (成都市联合化工试剂研究
所);三氯化铁 (上海山浦化工有限公司)。所有试剂均为
分析纯。
1. 1. 3 仪器 UnicamUV500 紫外可见分光光度计 (美国
Themo Nicolet公司);AE240 电子分析天平 (梅特勒-托利
多仪器上海有限公司);800 离心机 (江苏省金坛市正基仪
器有限公司);HH-2 数显恒温水浴锅 (国华电器有限公
司);电热恒温干燥箱 (金坛市荣华仪器制造有限公司);
KQ52001 超声波清洗器 (昆山市仪器有限公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 黄酮类型的鉴别 藏药刀豆经打粉、干燥后，从中
取适量按一定料液比加入溶剂，提取后趁热过滤，合并滤
液，微孔滤膜过滤，浓缩定容至 50 mL。在试管中取醇提
液适量，加入四氢硼钠，滴入 1%盐酸溶液后呈紫红色，
说明为二氢黄酮类成分，然后进行紫外全扫描，得到其吸
收图谱。另取柚皮素对照品适量，50%乙醇溶解，进行紫
外全扫描，得到其吸收图谱。
1. 2. 2 标准曲线的制备 精密称取干燥至恒重的柚皮素对
照品 20 mg，50%乙醇溶解并定容至 100 mL量瓶中，摇匀。
再分别吸取标准液 1、2、4、6、8 mL，置于 50 mL量瓶中，
加 50%乙醇至刻度，摇匀，在 290 nm处测定吸光度。以柚
皮素质量浓度为横坐标 (X)，吸光度为纵坐标 (Y)绘制
标准曲线。
1. 2. 3 单因素试验 取干燥后的藏药刀豆粉末 1 g，按一
定料液比加入溶剂，在设定条件下 (提取次数、温度、乙
醇体积分数、料液比)进行超声回流提取。然后，趁热过
滤，石油醚萃取后取下层液，微孔滤膜过滤，定容至
50 mL，按“1. 2. 2”项下方法测定其含有量。
1. 2. 4 响应面法优化提取条件 在单因素试验结果的基础
上，选择乙醇体积分数、料液比、提取温度这 3 个最显著
的影响因素作为研究对象，以黄酮得率为响应值，利用
Design Expert 7. 0 软件设计 Box-Behnken 试验。以 A (乙醇
体积分数)、B (料液比)、C (提取温度)为自变量，以
黄酮提取率 (Y)为响应值进行分析，每组平行 3 次，取
平均值，得出最优方案。
1. 2. 5 抗氧化实验供试液的配制 取藏药刀豆适量，置于
60 ℃ 烘箱中干燥，粉碎，过 5 号筛。称取 5 g，置于
100 mL圆底烧瓶中，每次加入 60 mL石油醚，65 ℃下回流
脱脂 1 h，共两次，挥干溶剂，药渣置于 150 mL 圆底烧瓶
中，在 51%乙醇、液料比 1 ∶ 21，72 ℃条件下超声回流
30 min，抽滤提取液，离心 (3 000 r /min)10 min，除去沉
淀，澄清液挥干溶剂，得到浸膏，收率为 19. 32%，冷藏
(3 ～ 5 ℃)备用。然后，提取物浸膏用 51%乙醇溶解定容
于 100 mL 量瓶中，再分别量取 5. 0、10. 0、15. 0、20. 0、
25. 0 mL，定容于 25 mL 量瓶中，制成样品液，冷藏 (3 ～
5 ℃)备用。其质量浓度 (相当于原药材量)分别为 10、
20、30、40、50 mg /mL，则总黄酮质量浓度分别为 67. 1、
134. 2、201. 3、268. 4、335. 4 μg /mL。
1. 2. 6 维生素 C 对照品的配制 称取维生素 C 标准品
0. 671 g，51%乙醇溶解定容于 100 mL 量瓶中，分别量取
1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL，定容于 100 mL 量瓶中，即
得 质 量 浓 度 分 别 为 67. 1、 134. 2、 201. 3、 268. 4、
335. 4 μg /mL的维生素 C对照品。
1. 2. 7 刀豆总黄酮对超氧阴离子自由基的清除实验 往试
管中加入 4. 5 mL 50 mmol /L 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙
酸 (pH =8. 4)缓冲溶液，25 ℃水浴中预热 20 min，加入
1. 0 mL样品液混匀后，立即加入 0. 4 mL在 25 ℃下预热过的
3 mmol /L邻苯三酚 (用新沸水配制的 10 mmol /L HCl配制)，
25 ℃下反应 20 min，加入 0. 5 mL 1 mol /L HCl 终止反应，
303 nm下测定吸光度 A样，重复3次，取平均值。自氧化管用
1. 0 mL 51%乙醇代替样品，样品比管用 0. 3 mL 10 mmol /L
HCl代替邻苯三酚，空白管用 1. 0 mL 51%乙醇液代替样
品，再用 0. 3 mL 10 mmol /L HCl 代替邻苯三酚。计算公式
为清除率 d = ［A自 － (A样 － A样比)］ /A自 × 100%
［8-9］。
1. 2. 8 刀豆总黄酮对羟自由基的清除实验 往试管加入
2. 0 mL 0. 2 mmol /L 磷酸缓冲液 (pH = 7. 4)、1. 2 mL
0. 75 mmol /L邻菲啰啉无水乙醇溶液、1. 0 mL 样品液、
1. 0 mL 0. 75 mmol /L 硫酸亚铁 (新沸水现配)，混匀后立
即加入 0. 5 mL 0. 05%双氧水，37 ℃恒温水浴锅中保温1 h，
于 510 nm下测定吸光度，重复 3 次，取平均值。损伤管用
51%乙醇液代替样品液，未损伤管用 1 mL 51%乙醇液代替
样品，再用高纯水代替 0. 05%双氧水溶液，计算公式为清
除率 E = (A样 － A损) / (A未损 － A损) × 100%
［10-11］。
2 结果与分析
2. 1 黄酮类型的鉴别 首先，将刀豆总黄酮提取液图谱分
别与芦丁和柚皮素对照品溶液的紫外吸收图谱进行比较，
由于柚皮素是柚皮甙的甙元，属于二氢黄酮类化合物，故
以柚皮素标准品溶液为二氢黄酮的标准对照品［12］。由图 1
可知，藏药刀豆提取液的紫外吸收扫描图谱与芦丁明显不
同，呈现出典型的二氢黄酮类成分特征，结合理化鉴别实
验结果，可知刀豆总黄酮属二氢黄酮类成分。将其与柚皮
素对照品溶液的紫外吸收图谱比较后发现，两者的相似程
度很高，最大吸收波长都在 290 nm处。
2. 2 柚皮素标准曲线 以柚皮素质量浓度为横坐标 (X)，
吸光度为纵坐标 (Y)绘制标准曲线，得到线性回归方程
Y =48. 035X +0. 013 8，r = 0. 999 7，在 0. 002 ～ 0. 032 mg /mL
范围内线性关系良好。
2. 3 单因素试验
2. 3. 1 提取次数的影响 在料液比 1 ∶ 20，乙醇体积分数
50%，超声功率 200 W，超声时间 30 min，超声温度 50 ℃
的条件下，提取 1、2、3、4 次。结果，总黄酮提取率随提
取次数的增加而上升，但程度不明显，由于提取 1 次后的
增加量很少，故确定提取 1 次。
2. 3. 2 提取时间的影响 在料液比 1 ∶ 20，乙醇体积分数
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图 1 紫外扫描图谱
50%，超声功率 200 W，超声温度 50 ℃的条件下，以不同
提取时间进行提取，平行 3 次，取平均值，结果见图 2。
由图可知，当提取时间超过 30 min后，总黄酮提取率已基
本不再增加，故确定提取时间为 30 min。
图 2 不同提取时间对总黄酮提取率的影响
2. 3. 3 乙醇体积分数的影响 在料液比 1 ∶ 20，超声功率
200 W，超声时间 30 min，超声温度 50 ℃的条件下，以不
同体积分数的乙醇溶液进行提取，平行 3 次，取平均值，
结果见图 3。由图可知，以 50%左右乙醇溶液为溶剂时，
总黄酮提取率较高，故选择 45%、50%、55%乙醇进行响
应面分析。
图 3 不同乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
2. 3. 4 料液比的影响 在乙醇体积分数 50%，超声功率
200 W，超声时间 30 min，超声温度 50 ℃的条件下，以不
同料液比进行提取，平行 3 次，取平均值，结果见图 4。
由图可知，在料液比为 1 ∶ 20 左右时，总黄酮提取率较高，
故选择 1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25 料液比进行响应面分析。
图 4 不同料液比对总黄酮提取率的影响
2. 3. 5 提取温度的影响 在料液比 1 ∶ 20，乙醇体积分数
50%，超声功率 200 W，超声时间 30 min 的条件下，以不
同提取温度进行提取，平行 3 次，取平均值，结果见图 5。
由图可知，随着提取温度增加，总黄酮提取率在 70 ℃前呈
上升趋势，但在 70 ℃后又呈下降趋势，故选择 65、70 和
75 ℃提取温度进行响应面分析。
图 5 不同提取温度对总黄酮提取率的影响
2. 4 响应面设计
2. 4. 1 Box-Behnken设计与结果 在单因素试验的基础上，
选择乙醇体积分数 (A)、料液比 (B)、提取温度 (C)这
3 个最显著的影响因素作为研究对象，以黄酮得率为响应
值，设计 Box-Behnken试验，采用 Design Expert 7. 0 软件分
析，结果见表 1。经回归拟合后，得到刀豆黄酮含有量
(Y)与各因素的回归方程为 Y = 0. 67 + 5. 125 × 10 －3 A +
0. 010B + 0. 013C + 4. 250 × 10 －3 AB + 4. 500 × 10 －3 AC +
3. 750 × 10 －3BC － 0. 022A2 － 0. 044B2 － 0. 015C2。
表 1 Box-Behnken设计与结果
编号 A乙醇 /% B 料液比 C 提取温度 /℃ 黄酮得率 /%
1 50 1 ∶ 20 70 0. 671
2 45 1 ∶ 25 70 0. 607
3 50 1 ∶ 25 75 0. 639
4 55 1 ∶ 15 70 0. 596
5 50 1 ∶ 20 70 0. 672
6 50 1 ∶ 25 65 0. 604
7 50 1 ∶ 15 75 0. 614
8 55 1 ∶ 25 70 0. 627
9 50 1 ∶ 20 70 0. 672
10 45 1 ∶ 20 65 0. 622
11 50 1 ∶ 15 65 0. 594
12 55 1 ∶ 20 75 0. 655
13 45 1 ∶ 20 75 0. 637
14 45 1 ∶ 15 70 0. 593
15 55 1 ∶ 20 65 0. 622
16 50 1 ∶ 20 70 0. 670
17 50 1 ∶ 20 70 0. 673
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2. 4. 2 模型的方差分析 (表 2) 由表可知，整个回归模
型的 P ＜ 0. 000 1，达到极显著水平，表明该模型能很好地
描述实验结果;一次项 A、B、C的 P均 ＜ 0. 05，为显著水
平，表明 3 个因素对总黄酮的提取率都有显著影响;二次
项 A2、B2 和 C2 的 P均 ＜ 0. 000 1，达到极显著水平;失拟
型的 P ＞ 0. 05，水平不显著，表明该方程有效性良好。
表 2 方差分析
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 0. 015 9 1. 623 × 10 －3 421. 56 ＜ 0. 000 1
A 2. 101 × 10 －4 1 1. 901 × 10 －4 54. 58 0. 000 2
B 8. 000 × 10 －4 1 8. 000 × 10 －4 207. 79 ＜ 0. 000 1
C 1. 326 × 10 －3 1 1. 326 × 10 －3 344. 45 ＜ 0. 000 1
AB 7. 225 × 10 －5 1 7. 225 × 105 18. 77 0. 003 4
AC 8. 100 × 10 －5 1 8. 100 × 10 －5 21. 04 0. 002 5
BC 5. 625 × 10 －5 1 5. 625 × 10 －5 14. 61 0. 006 5
A2 2. 094 × 10 －3 1 2. 094 × 10 －3 543. 86 ＜ 0. 000 1
B2 7. 986 × 10 －3 1 7. 986 × 10 －3 2 074. 21 ＜ 0. 000 1
C2 9. 856 × 10 －4 1 9. 856 × 10 －4 256. 01 ＜ 0. 000 1
残差 2. 695 × 10 －5 7 3. 850 × 10 －6 — —
失拟性 2. 175 × 10 －5 3 7. 250 × 10 －6 5. 58 0. 065 1
纯误差 5. 200 × 10 －6 4 1. 300 × 10 －6 — —
总差 0. 015 16 — — —
2. 4. 3 响应面分析 (图 6 ～ 8) 由图可知，乙醇体积分
数和料液比对提取率的影响为明显的二次抛物线，总黄酮
得率随乙醇体积分数和料液比的增加而迅速上升，有明显
的交互作用，但达到一个峰值后又迅速降低。当乙醇极性
随体积分数增加而改变，直到接近黄酮极性时，有利于黄
酮的溶出，同时料液比的增加也给黄酮溶出提供了更多空
间。当乙醇体积分数和料液比过大时，黄酮的溶出反而减
少。而且，乙醇体积分数和提取温度，以及料液比和提取
温度对提取率的影响均为明显的二次抛物线。
图 6 乙醇体积分数和料液比对提取率的影响
2. 4. 4 提取工艺的确定和验证 以总黄酮得率范围中的最
低点为出发点，采用快速上升法进行条件优化，得到最佳
工艺条件为乙醇体积分数 50. 88%，料液比 1 ∶ 20. 71，提
取温度 72. 32 ℃，总黄酮得率 0. 675%，即 6. 75 mg /g。然
后，以乙醇体积分数 51%，料液比 1 ∶ 21，提取温度
72. 5 ℃ 进行 3 次验证试验，测得平均总黄酮得率为
0. 671%，与理论预测值非常接近。由此可知，该提取条件
准确可靠，具有实用价值。
图 7 乙醇体积分数和提取温度对提取率的影响
图 8 料液比和提取温度对提取率的影响
2. 5 抗氧化活性考察
2. 5. 1 清除超氧阴离子自由基 藏药刀豆总黄酮随着质量
浓度增加，清除超氧阴离子自由基的能力逐渐增强，但稍
弱于维生素 C，见图 9。
图 9 清除超氧阴离子自由基能力的比较
2. 5. 2 清除羟自由基 藏药刀豆总黄酮随着质量浓度增
加，清除羟自由基的能力逐渐增强。而且，其在低质量浓
度时的清除率高于维生素 C，但随着质量浓度增加，维生
素 C的清除能力反而胜出，见图 10。
图 10 清除羟自由基能力的比较
3 结论
提取温度、料液比和乙醇体积分数对藏药刀豆总黄酮
的提取率均有显著影响，在单因素试验基础上，采用 Box-
Bhenken设计方案，应用 Design Expert 7. 0 软件对所得模型
进行分析，得到最佳工艺条件为乙醇体积分数 50. 88%，
料液比 1 ∶ 20. 71，提取温度 72. 32 ℃，总黄酮得率
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0. 675%。然后，以乙醇体积分数 51%，料液比 1 ∶ 21，提
取温度 72. 5 ℃进行 3 次平行验证试验，测得平均总黄酮得
率为 0. 671%，与理论预测值非常接近。由此可知，该提
取条件准确可靠，具有实用价值。
抗氧化实验结果表明，藏药刀豆总黄酮提取物对超氧
阴离子自由基 (O2
－)和羟自由基 (·OH)均有较强的清
除能力，并与其质量浓度呈正相关性，即抗氧化活性明显。
在生物体内，存在蛋白质、脂肪等诸多能和自由基作用的
物质，从而破坏细胞结构和功能，引发生物体产生动脉粥
样硬化、糖尿病、癌症等多种疾病［13］，而黄酮成分具有抗
炎、抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血压等较广泛的生
物活性［14］。因此，本实验具有较大的应用价值，可为相关
产品的开发与利用提供一定参考依据。
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窄叶鲜卑花叶超声提取工艺的优化
卫阳飞1， 宋 海1， 张宏曦2， 杨永建3， 李建银3， 岳国仁1 *
(1． 河西学院，甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000;2． 甘肃省张掖市甘州区食
品药品监督管理局，甘肃 张掖 734000;3． 兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000)
收稿日期:2015-08-07
基金项目:河西学院青年教师科研基金项目 (QN2014-15)
作者简介:卫阳飞 (1987—)，女，硕士，助教，从事药用植物资源开发与利用研究。Tel:18093612285，E-mail:wyfhxxy@ 163． com
* 通信作者:岳国仁 (1966—)，男，博士，教授，从事有机化合物的应用与合成研究。E-mail:xinziwuzhijin@ 163． com
摘要:目的 优化窄叶鲜卑花叶的超声提取工艺。方法 以齐墩果酸和熊果酸的总评值为指标，在单因素试验的基础
上，采用响应面分析法对乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间等条件进行优化。结果 最优提取工艺为浸泡
时间 2. 0 h，乙醇体积分数 72. 7%，液料比 32 ∶ 1，提取温度 53 ℃，提取时间 1. 633 h (约 98 min)，齐墩果酸平均提
取率为 14. 03 mg /g，熊果酸为 0. 984 5 mg /g。结论 该工艺稳定合理，对窄叶鲜卑花的开发利用具有一定实践意义。
关键词:窄叶鲜卑花;叶;超声提取;齐墩果酸;熊果酸;响应面分析法
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)05-1167-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 05. 045
窄叶鲜卑花 Sibiraea angustata (Ｒehd．)Hand． -Mazz为
蔷薇科鲜卑花属植物，主要分布于西藏、青海、甘肃、四
川等地，生长在海拔 2 400 ～ 3 500 m 的高山、溪边、灌木
丛中或林缘［1-2］，藏族民间常用其叶作茶饮，用于治疗食后
腹胀等原因引起的消化不良症状，命名为“柳茶”。近年
来药理研究表明，窄叶鲜卑花叶具有调节脂质代谢［3］、保
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2016 年 5 月
第 38 卷 第 5 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
May 2016
Vol． 38 No． 5