全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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［责任编辑 顾雪竹］
［收稿日期］ 20130829(012)
［基金项目］ 北京中医药大学复方中药制药创新团队项目(2011-CX70-13)
［第一作者］ 党晓芳，在读硕士，从事中药新剂型与新技术研究，Tel:18810481585，E-mail:yangmuju@ 163. com
［通讯作者］ * 倪健，教授，博士生导师，从事中药新剂型与新技术研究，Tel:010-84738607，E-mail:njtcm@ 263. net
鬼箭羽总黄酮含量测定方法的建立
党晓芳，曹飒丽，祁娟娟，张慧，张晋，付京，陈杨，倪健*
( 北京中医药大学中药学院，北京 100102)
［摘要］ 目的:建立鬼箭羽总黄酮的含量测定方法并筛选其提取方法。方法:以芦丁为对照品，通过单因素试验优选显
色方法和显色条件，建立总黄酮含量测定的方法学考察并优选其提取方法。结果:采用盐酸-镁粉反应比色法，芦丁在 0. 020 ～
0. 104 mg与吸光度呈良好线性关系(r = 0. 997)，平均加样回收率 99. 424%(ＲSD 2. 220%)。结论:盐酸-镁粉显色法具有精密
度高、重复性好等优势，适用于鬼箭羽总黄酮的定量分析。鬼箭羽总黄酮的提取宜采用回流法。
［关键词］ 鬼箭羽;总黄酮;显色条件;单因素试验;方法学考察;提取方式
［中图分类号］ Ｒ283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)09-0096-03
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfix． 2014090096
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /doi /10． 13422 / j． cnki． syfjx． 000070． html
［网络出版时间］ 2014-02-25 13:52
Optimization of Determination for Total Flavonoids in Euonymus alatus
DANG Xiao-fang，CAO Sa-li，QI Juan-juan，ZHANG Hui，ZHANG Jin，FU Jing，CHEN Yang，NI Jian*
(School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
［Abstract］ Objective:To establish a method for determination of the content of total flavonoids in
Euonymus alatus． Method:Selecting rutin as a reference substance，single factor tests were adopted to optimize
colorimetry methods and conditions，determination of the content of total flavonoids was established and optimized its
extraction method． Ｒesult:Hydrochloric acid-Mg reaction assay was adopted，rutin had a liner relationship with
absorbance in the range of 0. 021-0. 104 mg (r = 0. 997)，average recovery was 99. 424% with ＲSD of 2. 220% ．
Conclusion:HCl-Mg colorimetry method appeared to be an accurate， reliable and repeatable system for
determination of total flavonoids in E． alatus． Total flavonoids in E． alatus should employ reflux extraction method．
·69·
第 20 卷第 9 期
2014 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 9
May，2014
［Key words］ Euonymus alatus; total flavonoids; colorimetry conditons; single factor test;
methodological study;extraction method
鬼箭羽味酸甘涩，性微寒［1］，具有破血、痛经、
杀虫、散瘀止痛等功效，主治闭经、产后腹痛、虫积腹
痛、跌打损伤等症［2］。现代药理研究发现鬼箭羽中
黄酮类化合物具有降血糖、调血脂及延缓动脉粥样
硬化等作用［3］，但其含量测定的相关报道较少。本
实验拟比较 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH，AlCl3，HCl-Mg
显色法对鬼箭羽总黄酮含量测定的影响，为鬼箭羽
的质量控制提供参考。
1 材料
TU-1810 型紫外-可见分光光度仪(北京普析通
用仪器有限责任公司)。鬼箭羽购于北京同仁堂有
限责任公司，经北京中医药大学生药系刘春生教授
鉴定为卫矛科植物卫矛 Euonymus alatus(Thunb．)
Sieb．的干燥翅状枝条及其附属物;芦丁对照品(四
川省维克奇生物科技有限公司，批号 129723)，试剂
均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 溶液的制备
2. 1. 1 供试品溶液 称取鬼箭羽药材 200 g，加
70%乙醇 2 L回流提取 2 次，每次 2 h，滤过，合并滤
液，减压回收乙醇并浓缩干燥，得鬼箭羽干膏;精密
称取干膏 0. 25 g，置 25 mL 量瓶中，加 70%乙醇溶
解并定容，摇匀，即得。
2. 1. 2 对照品溶液 精密称取芦丁对照品适量，加
70%乙醇定容于量瓶中，制成 0. 020 g·L －1溶液，
即得。
2. 2 显色试剂及检测波长的选择
2. 2. 1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法 精密移取
对照品溶液和供试品溶液各 3. 0 mL，分别置于
25 mL量瓶中，加 5% NaNO2 溶液 1. 0 mL，摇匀，放
置 6 min;加 10%Al(NO3)3 溶液 1. 0 mL，摇匀，放置
6 min;加 10% NaOH 试液 10 mL，加 70%乙醇定容
至刻度，摇匀，显色 15 min，以相应试剂为空白，于
400 ～ 700 nm进行全波长扫描，结果供试品溶液在
500 nm附近未见吸收峰。
2. 2. 2 AlCl3 显色法 精密移取对照品溶液3. 0 mL
和供试品溶液 1. 0 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，各
加入 0. 1 mol·mL －1AlCl3 1. 0 mL，加 70%乙醇定容，
摇匀，显色 15 min，以相应试剂为空白，于 300 ～ 500
nm进行紫外扫描，结果显示 400 nm 附近供试品溶
液未见吸收峰。
2. 2. 3 HCl-Mg 显色法 精密吸取对照品溶液
3. 0 mL和供试品溶液 0. 5 mL，分别置于加有镁粉
300 mg 的具塞试管中，将试管置冷水浴(约 15 ℃)
中，缓慢滴加浓盐酸 3 mL并不时振摇试管，加 70%
乙醇补足至 10 mL，摇匀，置沸水浴中加热 60 min，
取出，迅速冷却至室温，以相应试剂为空白，
于 400 ～ 700 nm进行紫外扫描，结果发现二者的最
大吸收波长基本一致，均为(524 ± 1)nm，且重复性
好。而用 Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 和 AlCl3 显色时，
对照品溶液和供试品溶液在 400 ～ 700 nm均无相应
吸收峰，故采用 HCl-Mg显色法，检测波长 524 nm。
2. 3 显色条件考察
2. 3. 1 加热时间 分别精密吸取对照品溶液和供
试品溶液 3. 0，0. 5 mL，各 5 份，分别置于加有镁粉
300 mg的具塞刻度试管中，按 2. 2. 3 项下方法操
作，依次置于沸水浴中分别加热 20，40，60，80，100
min，取出，迅速冷却至室温，于 524 nm 处测定吸光
度(A)，结果表明加热 60 min时，供试品溶液与对照
品溶液同时具有最大吸收，故确定 HCl-Mg 粉显色
的加热时间 60 min。
2. 3. 2 镁粉用量 分别精密吸取对照品溶液和供
试品溶液 3. 0，0. 5 mL，各 5 份，分别置于加有镁粉
0. 1，0. 2，0. 3，0. 4，0. 5 g 的具塞刻度试管中，按
2. 2. 3 项下方法操作，于 524 nm处测定 A，结果显示
镁粉用量为 300 mg时二者的 A最大。
2. 4 显色稳定性考察 分别精密量取对照品溶液
3. 0 mL和供试品溶液 0. 5 mL，各 7 份，分别于显色
后放置 0，10，20，30，40，50，60 min，按 2. 2. 3 项下方
法测定，结果 A的 ＲSD分别为 0%，0. 369%，表明对
照品溶液和供试品溶液显色后 1 h内基本稳定。
2. 5 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液适
量，配制成不同质量浓度溶液，分别置于加有镁粉
300 mg的具塞刻度试管中，按 2. 2. 3 项下方法于
524 nm处测定 A，以对照品用量为横坐标，A为纵坐
标，得回归方程 Y = 6. 755X － 0. 017(r = 0. 997)，表
明芦丁在 0. 020 ～ 0. 100 mg与 A呈良好线性关系。
2. 6 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液 6 份，
每份 3. 0 mL，置加有镁粉 300 mg 的具塞刻度试管
中，按 2. 2. 3 项下方法于 524 nm 处测定 A，计算
ＲSD0%，表明仪器精密度良好。
2. 7 重复性试验 精密吸取同一供试品溶液 6 份，
·79·
党晓芳，等:鬼箭羽总黄酮含量测定方法的建立
每份 2. 0 mL，置加有镁粉 300 mg 的具塞刻度试管
中，按 2. 2. 3 项下方法于 524 nm 处测定 A，计算
ＲSD 1. 606%，表明该方法重复性良好。
2. 8 回收率试验 称取过四号筛鬼箭羽药材 6 份，
每份 7. 030 mg，各加入一定量芦丁对照品，加入
95%乙醇溶液 80 mL于 30 ℃超声(150 W，40 kHz)
3 h，将提取液蒸至无醇味，加 70%乙醇溶解并定容
至 50 mL量瓶中，精密移取 2. 0 mL分别置于加有镁
粉 300 mg的具塞刻度试管中，按 2. 2. 3 项下方法于
524 nm处测定 A，计算回收率，结果见表 1。
表 1 鬼箭羽总黄酮含量测定的回收率试验
No．
加入量
/mg
实测值
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
ＲSD
/%
1 7. 026 14. 033 99. 673 99. 424 2. 220
2 7. 029 13. 937 98. 266
3 7. 032 14. 068 100. 085
4 7. 033 13. 782 96. 003
5 7. 028 14. 046 98. 829
6 7. 026 14. 245 102. 689
2. 9 提取方法 考察取鬼箭羽药材，粉碎，过四号
筛(60 目)，精密称取 3 份，每份 1 g，各加入 95%乙
醇 80 mL，分别采用索氏法(索式提取 4 h)、超声
法［4］(30 ℃超声 3 h，150 W，40 kHz)、回流法(90 ℃
加热回流 3 h)提取，提取液分别蒸至无醇味，加
70%乙醇定容至 50 mL量瓶中，作为供试品溶液，按
2. 2. 3 项下方法于 524 nm 处测定 A，结果总黄酮提
取量分别为 8. 593，11. 952，14. 056 mg·g －1。采用
SPSS 17. 0 统计软件对数据进行 One-Way ANOVA
方差分析及 Student-Newman-Keuls(SNK)多重比较
分析，结果见表 2，3。方差分析及 SNK 结果表明，3
种提取方法差异极显著(P ＜ 0. 01)，均有统计学意
义，表明回流提取法可将鬼箭羽中黄酮类物质提取
完全，且操作较索氏提取法简便，故选择回流法作为
鬼箭羽总黄酮的提取方式。
表 2 鬼箭羽总黄酮含量测定的 One-Way ANOVA统计分析
方差来源 SS f MS F P
组间 0. 456 2 0. 228 153. 945 0. 000
组内 0. 009 6 0. 001
表 3 鬼箭羽中总黄酮含量测定的 SNK多重比较分析
组别 N
子集 α = 0. 05
索氏提取法 超声提取法 回流提取法
超声提取法 3 0. 859
索氏提取法 3 1. 195
回流提取法 3 1. 406
Sig． 1. 000 1. 000 1. 000
3 讨论
总黄酮含量测定的方法主要包括 NaNO2-Al
(NO3)3-NaOH显色法、AlCl3 显色法和 HCl-Mg 显色
法［5-6］。当黄酮化合物的 B环中不存在 3，4 －邻位
二酚羟基的结构时，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系是
无法显色的［8］;AlCl3 显色法
［9］反应主要发生在 3-
羟基、4-羰基和邻二酚羟基，只存在 5-羟基、4-羰基
的黄酮类物质与 AlCl3 不发生反应;鬼箭羽中香橙
素、柚皮素等成分的结构较为特殊，使得这两种显色
方法不能用于鬼箭羽黄酮类成分的测定。而黄酮、
黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇均易在盐酸-镁粉作
用下被还原，生成橙红到红紫色物质，故采用 HCl-
Mg显色法。
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［责任编辑 刘德文］
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第 20 卷第 9 期
2014 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 9
May，2014