全 文 ：第 27卷 第 2期
2008 年　4 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Ag ricultural Univ ersity
Vo l.27　No.2
Apr.2008 , 193～ 197
广东省和海南省象耳豆根结线虫的鉴定＊
卓　侃1)　胡茂秀1)　廖金铃1)＊＊　崔汝强1 , 2)　李迅东1)　王　彬1)　周健勇3)
(1)华南农业大学资源环境学院 ,广州 510642;
2)广东出入境检验检疫局 ,广州 510623;3)广东省南海出入境检验检疫局 , 南海 528200)
摘要　运用线虫比较形态学 、结合同工酶 、mtDNA-PCR、rDNA-IGS-PC R技术 ,对采自中国广东和海南 2 个
省的根结线虫进行鉴定。在海南省定安的木豆(Cajanus cajan)、海南省海口的木豆和番石榴(Psidium guaja-
va)、广东省番禺的辣椒(Ca psicum annuum)和南瓜(Cucurbita moschata)及广东省遂溪的豇豆(Vigna sinensis)
上发现象有耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)。这是首次在海南省外发现象耳豆根结线虫 ,同时还发现该
线虫的 2 个新寄主 ,即木豆和南瓜。
关键词　象耳豆根结线虫;鉴定;广东省;海南省
中图法分类号　Q 595.17;S 432.4 +5　　文献标识码　A　　文章编号　1000-2421(2008)02-0193-05
收稿日期:2007-09-26;修回日期:2007-12-07
＊国家“十一五”科技支撑项目(2006BAD08A08-27)、农业公益性行业科研专项(NYNHZX07-050)、国家自然科学基金项目(30471142)和
广东省科技厅农业攻关项目(2007B02079008)资助
＊＊通讯作者.E-mail:jlli ao@scau.edu.cn
卓　侃 ,男 , 1979年生 ,博士 ,助理研究员.工作单位:华南农业大学资源环境学院 ,广州 510642
　　根结线虫(Meloidogyne spp.)广泛分布于世界
各地 ,是一类危害极大的植物寄生线虫。世界每年
由根结线虫所引起经济上重要农作物的损失占总损
失的 5%[ 1] 。目前防治根结线虫病的方法除了化学
防治外 ,还包括植物检疫 、抗性品种 、轮作 、生物防治
等一些非化学性防治措施。对于非化学性防治措
施 ,根结线虫种的准确鉴定是重要的前提条件 。
迄今为止 ,全世界已报道的根结线虫种已超过
90个 ,中国报道的种类也超过了 50 种[ 2-3] 。据调查
研究 ,我国分布最广泛 、最常见的根结线虫与世界各
地类似 ,包括南方根结线虫(Meloidogyne incogni-
ta)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫
(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)。近年
来 ,另一种根结线虫 ,即象耳豆根结线虫(M.enter-
olobii)越来越受到人们的重视 。该线虫是 1983 年
在我国海南省儋州市象耳豆树上发现的 1 个新
种[ 4] ,该种在报道之后的 20余年很少被研究。近来
研究发现该线虫可以寄生豆科 、茄科 、葫芦科中的多
种经济作物及番石榴等热带水果 ,还可以寄生携带
Mi抗性基因的番茄[ 5-6] ,而且在海南省的三亚 、琼海
和澄迈等地也被发现[ 6-7] 。象耳豆根结线虫已经成
为我国热带 、亚热带地区作物的一个重要潜在病原
物。根结线虫的传统鉴定方法主要根据形态学 ,特
别是会阴花纹进行 ,但由于其较大的变异性导致有
时结果不够准确[ 8] 。象耳豆根结线虫会阴花纹变异
较大 ,部分会阴花纹形态与南方根结线虫会阴花纹
形态相似 ,如果仅根据该特征 ,有可能将象耳豆根结
线虫误定为南方根结线虫[ 6] 。因此 ,笔者结合形态
学 、同工酶及分子生物学手段对从广东省和海南省
采集到的根结线虫样品进行鉴定 ,旨在明确象耳豆
根结线虫除了分布在上述 4个地区外 ,是否在其它
地方也有分布 ,为准确鉴定及控制该线虫提供理论
依据 。
1　材料与方法
1.1　供试虫源
2003年至 2005 年在广东省的广州 、佛山 、江
门 、番禺 、开平 、阳江 、廉江 、湛江 、遂溪 、雷州 、徐闻和
海南省的海口 、琼山 、定安 、屯昌 、琼中等地采集根结
线虫群体 。在解剖镜下 ,从根结选取单卵块 ,接种于
预先培植于消毒土的感病品种番茄(满丰 1 号)根
部 ,进行活体保存 ,待用。
1.2　线虫形态观察
观察雌虫 、雄虫和 2龄幼虫的形态特征 。采集
经纯化的根结线虫种群 ,在解剖镜下 ,用镊子和解剖
针分离成熟雌虫 ,将雌虫置于清水中 ,并移入硬塑料
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 27 卷　
板上按常规方法制作会阴花纹 ,修正和清洗制作好
会阴花纹后 ,用 Olympus高级显微镜和扫描电镜观
察会阴花纹形态 ,并拍照保存于电脑中 。
1.3　同工酶分析
参考 Esbenshade 等[ 9] 的方法稍作改动 。采用
北京六一仪器厂生产的 DYY-Ⅲ-6B 型电泳仪 ,
DYY-Ⅲ-23A型垂直板电泳槽 ,凝胶板大小为 125
mm×100 mm ,凝胶厚度 1 mm 。分离胶和浓缩胶
同源 ,电极缓冲液是 pH 8.3 的 T ris-甘氨酸缓冲
液。
酶浸提液为 20%蔗糖 (W/V)和 2% TritonX-
100 ,每个种群挑取 4 ～ 5个低龄雌虫制成 1个样品 。
用 50μL 微量取样器加样 ,每孔 30μL ,其中含 5μL
溴酚兰溶液 ,以已知爪哇根结线虫作对照。电泳时 ,
前 1 h 电压为 80 V ,其后保持恒压 200 V ,整个电泳
约 4 h。
酯酶(EST)和苹果酸脱氢酶(MDH)的染色配
方及操作步骤参照 Esbenshade 等[ 10] 的方法。显色
完全后漂洗3次 ,在 10%醋酸加上 10%甘油中固定
3 h 以上 ,然后扫描并贮存在电脑中。参照 Esben-
shade等[ 9] 的标准 ,判读 EST 和 MDH 谱型 ,初步确
定根结线虫的种类。
1.4　DNA 鉴定
1)线虫 DNA 提取 。采用微量 DNA 提取法 ,主
要参照 Liao 等[ 11] 的方法 , 略加改动 。首先配制
WLB 液 ,WLB液包括:2.5 mmo l/L DT T ,1.125%
吐温 20 , 0.025%明胶 , 2.5 倍 PCR 缓冲液 [ 125
mmo l/L KCl , 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3),
3.75 mmo l/L MgCl2 ] 。然后在载玻片上滴 16 μL
预冷的WLB液 ,挑入 3 ～ 5 条 2龄根结线虫幼虫 ,
用手术刀将线虫切成多段 ,迅速吸取含尽量多的线
虫片段的悬浮液 8 μL ,加到含 10 μL 无菌水的 Ep-
pendorf管中 ,再向管中加入 2 μL 预冷的 1 mg/mL
蛋白酶K ,使总体积为 20 μL ,迅速放入-70 ℃冰箱
10 min以上。接着将 Eppendo rf管置于 65 ℃恒温
60 min , 95 ℃恒温 10 m in ,最后 12 000 r/min 离心
0.5 min。此时即得到 DNA 悬浮液 ,可直接用于
PCR ,也可保存于-20 ℃。
2)mtDNA 的 COI I/ lRN A基因间序列的扩增 。
对 mtDNA 的 COI I 和 lRN A 基因间序列 , 采用 2
对引物进行扩增 。 2 对引物的上游引物均为
C2F3[ 12] ,下游引物分别是 MRH106[ 13] 和 1 108[ 12] 。
其中引物 MRH106位于引物 1 108 下游约 130 bp
处。引物序列分别为
　C2F3:5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG -3′;
MRH106:5′-AATTTCTAAAGACTTTTCTTAGT -3′;
　1 108:5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′。
PCR反应体系:DNA 模板 10 ～ 20 ng , ExTaq
(5 U/μL)0.125 μL , 10 × PCR 缓冲液 2.5 μL ,
dN TP(2.5 mmol/ L)2 μL , 引物(10 μmol/ L)各
1μL ,加无菌水至 25μL。
扩增条件:94 ℃4 m in;接着 94 ℃1 min ,50 ℃
1 m in , 72 ℃ 2 min 共 35 个循环;最后 72 ℃ 10
min。
扩增产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳分离 ,每 100
mL 琼脂糖凝胶加入 5 μL EB 替代物 GoldView 。
电泳缓冲液为 0.5×TBE ,以 5 V/cm 电压电泳约
30 min。用凝胶图象分析系统照相 ,并储存到电脑
中。
3)rDNA-IGS 序列的扩增 。对 rDNA 的 IGS
序列 ,采用引物 5S 和 18S [ 14] 进行扩增 。引物序列
分别为 5S:5′-TTA ACT TGCCAGA TCGGACG-3′,
18S:5′-TCTAA TGAGCCG TACGC-3′。PCR反应
体系及扩增产物电泳同本文“1.4 , 2)” 。
扩增条件:94 ℃ 4 m in;接着 94 ℃ 0.5 min ,
53 ℃0.5 min , 72 ℃1.5 min 共 35个循环;最后
72 ℃10 min。
2　结果与分析
2.1　线虫形态鉴定
显微观察结果表明 ,采自海南省定安等地的 6
个根结线虫群体(表 1)形态相似 ,可能为同 1个种 。
雌虫虫体膨大 ,呈梨形 ,有明显突出的颈;头区无环
纹 ,与颈部稍缢缩 ,头冠高 ,唇盘圆盘状 ,略突起;排
泄孔位置通常在近中食道球处;口针细长 ,锥体部与
杆部等长 ,略向背面弯;口针基部球粗大;每个群体
内的会阴花纹均有一定的变异 ,但不同群体之间的
会阴花纹变异趋势类似 ,其特征为:整体卵圆形或椭
圆形 ,线纹细且较平滑 ,背弓低至高 ,大多数会阴花
纹无侧线 ,少数具 1条或 2条不清晰的侧线(图 1);
雄虫蠕虫形 ,虫体较小型 ,体环清晰;头区高圆 ,略缢
缩 ,无环纹;头骨架中等发达;口针直 ,锥体部尖 ,杆
部与基部球分界清楚;口针基部球大;中食道球卵圆
形 ,瓣膜清楚;排泄孔位置变化较大;尾短 、圆;交接
刺略弯 ,基部圆;2龄幼虫蠕虫形 ,体环小而清晰;头
区略缢缩 ,无环纹 ,唇盘略高于中唇;口针纤细 ,锥体
194
　第 2 期 卓　侃等:广东省和海南省象耳豆根结线虫的鉴定 　
部锐尖 ,与杆部分界明显;口针基部球清楚 、大 、圆;
透明尾明显 ,到尾末端渐变细 ,末端钝圆 ,有 1 ～ 3次
缺刻;直肠稍膨大 。主要形态特征与 Yang 等[ 4] 和
刘昊等[ 6] 对象耳豆根结线虫形态的描述基本相符 。
主要形态测量值与 Yang 等[ 4] 报道相比 ,除雌虫最
大体宽偏小(306.0 ～ 693.6 μm ,375.7 ～ 809.7μm)
和雄虫交接刺偏长外(29.0 ～ 35.1 μm , 27.3 ～ 32.1
μm),其余基本相符。故初步判断这 6 个根结线虫
群体为象耳豆根结线虫。
表 1　象耳豆根结线虫鉴定结果
Table 1　Identification result of M.enterolobii
　代号
　Code
寄主
Hos t
采集地
Origin
HNM 1 木豆 Cajanus ca jan 海南定安 Ding′an , Hainan
HNM 3 木豆 Cajanus ca jan 海南海口 H aikou , H ainan
HNF5番石榴 Psidium guajava 海南海口 H aikou , H ainan
GDL6 辣椒 Capsicum annuum 广东番禺 Panyu , Guangdong
GDN1 南瓜 Cucurbita mosch ata 广东番禺 Panyu , Guangdong
GDJ1 豇豆 Vig na s inensi s 广东遂溪 Suixi , Guangdong
图 1　象耳豆根结线虫的代表性雌虫会阴花纹形态
Fig.1　Typical female per ineal patterns of M .enterolobii
2.2　同工酶测定结果
6个根结线虫群体的 2 种同功酶表型一致 ,即
Est2条主要酶带 , 为 VS1-S1 型;MDH 单 1 条酶
带 ,为 N1a型 。其中 GDN1的酶谱图见图 2。以往
的研究已经证明 Est-MDH 表型是根结线虫鉴定的
可靠依据之一 ,因此根据已建立的 Est-MDH 表型
图谱[ 6 , 9] ,可判定这 6个根结线虫群体均为象耳豆根
结线虫。
2.3　mtDNA 的 COI I/ lRN A基因间序列的扩增
利用引物 C2F3和 MRH106 对 6个根结线虫
群体 mtDNA 的 COI I/ lRN A 基因间序列进行扩
增 ,扩增图谱见图3-a 。从扩增图谱可见 ,所有线
图 2　象耳豆根结线虫 GDN1 群体的酯酶
和苹果酸脱氢酶表型
Fig.2　Esterase(Est)and malate dehydrogenase(MDH)
phenotypes of GDN1 isolate of M.enterolobii
a.象耳豆根结线虫 M.entero lobi i;
b.爪哇根结线虫 M.javanica
图 3　象耳豆根结线虫 mtDNA的电泳图谱
Fig.3　Products of PCR amplified mtDNA between COII and lRNA of 6 populations of Meloidogyne enterolobii
a.利用引物 C2F3和 MRH106扩增 Using primers C2F3 and MRH106;
b.利用引物 C2F3和 1 108扩增 Usin g p rim ers C2F3 and 1 108;
M.Marker;1.HNM1;2.HNF5;3.HNM3;4.GDN1;5.GDL6;6.GDJ1
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　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 27 卷　
虫群体都扩增获得 1 条约 850 bp的亮带 。同时用
引物 C2F3和 1 108对 6个根结线虫群体的 COI I/
lRN A 基因间序列进行扩增 ,扩增图谱见图 3-b。从
扩增图谱可见 ,所有线虫都扩增获得 1条约 700 bp
的亮带。可见 ,目的片段大小与文献[ 15]报道的象
耳豆根结线虫一致。
2.4　rDNA-IGS 序列的扩增
利用引物 5S/18S对象耳豆根结线虫 GDN 1的
rDNA 的5S和 18S 间 IGS区进行扩增 ,扩增图谱见
图 4。从扩增图谱可见 ,该线虫扩增获得 1 条大约
800 bp的亮带 ,目的片段与龙海等[ 7] 报道的象耳豆
根结线虫一致。
图 4　引物 5S和 18S扩增象耳豆根结线虫
rDNA-IGS区的电泳图谱
Fig.4　PCR products ampl ified the interventing IGS regions
of M.enterolobii using primers 5S and 18S
M.DL 2000 DNA marker;1.HNM1;2.HNF5;
3.HNM3;4.GDN1;5.GDL6;6.GDJ1
3　讨　论
本研究运用比较形态学 、同工酶电泳 、mtDNA-
PCR 、rDNA-IGS-PCR相结合的方法 ,在海南省定
安的木豆 、海南省海口的木豆和番石榴 、广东省番禺
的辣椒和南瓜及广东省遂溪的豇豆上发现了象耳豆
根结线虫 Meloidogyne enterolobi i 。
据报道 ,迄今象耳豆根结线虫的发生地仅局限
在中国海南省的儋州 、三亚 、琼海和澄迈 4 个地
方[ 4 , 6] 。本研究不仅在海南省的定安和海口发现象
耳豆根结线虫 ,而且在广东省也发现该线虫。这是
首次在海南省外发现该线虫 ,推测该线虫在我国南
方亚热带 、热带地区可能有较广的分布。本次调查
新发现豆科(Legumino sae)的木豆和葫芦科(Cu-
curbitaceae)的南瓜是该线虫的寄主新记录 。目前
已记载象耳豆根结线虫可以侵染多种蔬菜 、热带水
果等经济作物 ,包括豆科的象耳豆 、菜豆 、豇豆和大
豆;葫芦科的黄瓜和西瓜;茄科(Solanaceae)的番
茄 、茄子 、辣椒和烟草;桃金娘科(Myrtaceae)的番石
榴和莲雾;番荔枝科(Annonaceae)的番荔枝以及携
带Mi抗性基因的番茄 ,造成严重的生产损失[ 4-6 , 16] 。
这些研究表明该线虫寄主范围广 、毒性强 ,是热带 、
亚热带地区一些重要经济作物的一种重要病原物 ,
因此应该进一步开展该线虫的调查 ,尤其是在我国
的热带和亚热带地区 ,了解该线虫的分布情况及新
的潜在寄主 ,为采取有效的检疫措施防止该线虫传
播提供必要的依据。
对根结线虫的鉴定 ,传统方法主要是根据会阴
花纹的特征进行鉴定 ,然而一些研究认为会阴花纹
变异很大[ 6 , 8 , 17-18] ,仅根据会阴花纹有可能造成误
定;同工酶 ,尤其酯酶和苹果酸脱氢酶已经成为根结
线虫鉴定的一种重要手段 ,但是这一方法也具有一
定的局限性。该方法需要活力旺盛的低龄雌虫[ 8] ,
而且有的种会产生多种酶谱带类型[ 9] ,给鉴定带来
困难 。因此 ,在一些发达国家 ,人们已经兴起了形态
学 、生物化学 、分子生物学相结合的方法进行根结线
虫的分类鉴定 ,该方法在分类鉴定上的客观性和准
确性已得到国际的公认 。目前 ,中国的根结线虫分
类鉴定仍比较依赖传统的形态学方法 ,根结线虫的
分类相对落后于美欧等国家 ,这种状况不利于对外
交流及我国根结线虫的深入研究。鉴如此 ,笔者认
为应该在形态学的基础上 ,结合分子生物学和生物
化学的手段来鉴定我国的根结线虫 。本研究应用这
套方法成功地鉴定出象耳豆根结线虫 ,对今后根结
线虫的鉴定有一定参考价值。
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3)Guangdong N anhai Entry-ex it Inspect ion and Quarantine Bureau , N anhai 528200 ,China)
Abstract　Root kno t nematodes collected f rom Guangdong Province and Hainan Province w ere iden-
tified by using mo rpholog y , isozyme , mtDNA-PCR , and rDNA-IGS-PCR.Meloidog yne enterolobii were
found to parasitize pigeonpea , guava in Hainan Province and capsicum , pumpkin , cow pea in Guangdong
Province.M.enterolobi i were fi rst ly found outside Hainan Province.Pigeonpea and pumpkin are the tw o
new hosts fo r M.enterolobi i.
Key words　Meloidogyne enterolobi i;ident ification;Guangdong Province;Hainan Province
(责任编辑:陈红叶)
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