全 文 ：相思子毒素的分子特点及其在临床中的应用前景
李丽琴 ,郑晓军 ,陈乐贵 ,史瑞雪 ,林福生
(北京药物化学研究所 ,北京 102205)
　　[ 摘要] 　相思子毒素是从豆科植物(Abrus Precatorius L.)种子中分离的一种细胞毒性蛋白。它由 A , B 两条
链组成 ,由一个二硫键相连 , B链具有半乳糖凝集活性 ,可与细胞膜上受体结合 , 帮助 A 链进入细胞内 , A 链进入细
胞催化 60S 大亚基的 28S rRNA 的第 4324 位脱去腺嘌呤而使 60S 核糖体亚基失活 , 从而使细胞蛋白合成被抑制。
本文综述了有关相思子毒素的分子结构特点 、毒性机制和在临床中的应用前景。
[ 关键词] 　相思子毒素;结构特点;免疫毒素;临床应用
[ 中图分类号] R979.1　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1003-3734(2002)05-0360-04
Molecular characteristics and clinical application prospect of abrin
LI Li-qin ,ZHENG Xiao-jun ,CHEN Le-gui ,SHI Rui-xue , LIN Fu-sheng
(Pharmaceut ical Chemistry Inst itute of Beijing , Beijing 102205 , China)
[Abstract] 　Abrin is one of the potent toxins isolated from the beans of plant Abrus precatorius L.The
toxic protein consists of two disulfide-bonded subunits , the A and B chain.The B chain is a galactose-specific
lectin that facilitates the binding of abrin to the cell membrane and the endocytosis of A chain.After entering
the cells , the A chain catalytically inactivates 60S ribosomal subunits by removing adenine position 4324 of 28S
r-RNA , and thereby inhibits protein biosynthesis.The structural characteristics , toxicological mechanism and
clinical application prospect of abrin were reviewed in this paper.
[ Key words] 　abrin;st ructural characteristics;immunotoxin;clinical application
　　相思子毒素是存在于相思子(Abrus precatorius
L.)种子中的一种细胞毒性蛋白 ,是毒性最强的植
物毒素之一 。有报道表明 ,一粒破壳的相思子就可
将人致死。20世纪 90 年代以来 ,国外就相思子毒
素的空间结构 、中毒机制 、中毒预防进行了研究。同
时 ,相思子毒素可用于恶性肿瘤的治疗 ,在临床中有
很好的应用前景 。
1　相思子毒素的分子结构特点
1.1　一级结构　相思子毒素的相对分子质量约为
65 000 ,由 A 和 B 2条链组成 。不同产地的相思子
含有在一级结构上稍有差异的相思子毒素 ,表现为
其毒性大小有差异 。目前通过氨基酸序列分析和基
因克隆方法测定了相思子毒素的一级结构[ 1～ 7] ,不
同的相思子异毒素之间 ,在氨基酸个数及类型上稍
有变异 。A和 B 2条链的 N-末端序列见表 1 。
表 1　相思子异毒素 A、B链的 N-末端序列比较
Abrin　　　 A 链 B链 测定方法 参考文献
Abrin a EDRP IKFS(250AA) Edman降解法 1
Abrin a IVEKSKICSSR(267AA) Edman降解法 2
Abrin a SIVEKSKICSS(268AA) Edman降解法 3
Abrin b SIVEKSKICSS(268AA) 3
pGA7.3 EDRP IKFS(251AA) 基因测序 4
PGA7.2 EDRP IKFS(251AA) 4
Preproabrin QDQVIKFT(251AA) SKICSSR(263AA) 基因测序 5
pCDNAAC-1 EDRP IKFS(251AA) IVEKSKICSSR(267AA) 基因测序 6
pCDNABC-8 QDQVIKFT(251AA) IVEKSKICSSR(267AA) 6
pCDNABC-5 QDQVIKFT(250AA) IVEKSKICSSR(267AA) 6
Abrin Ⅰ QDQVIKFT 基因测序 7
Abrin Ⅲ EDRP IKFS 7
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　　同蓖麻毒素相似 ,相思子毒素也是以前体蛋白
形式表达 ,编码前体相思子毒素的基因组不含内含
子 ,从 5 端到 3 端分别编码由 34个氨基酸残基组
成的前导序列 , 250 或 251 个氨基酸残基组成的 A
链 ,10个氨基酸残基组成的连接肽 ,267或 268个氨
基酸残基组成的 B链 。34个氨基酸残基组成的前导
序列很可能包含一个信号肽 ,诱导前体进入内质网 ,
进行翻译后加工 ,然后再转运到种子蛋白储存部位 ,
推测信号序列的切点位于第19位的 Ser羧基端。
根据蛋白酶裂解序列分析及基因克隆核酸序列
分析 ,相思子毒素A 链的 N-末端顺序不同 ,可将毒
素分为A-1型(A 链 N-末端顺序为 EDRPIKFS),A-
2型(A 链 N-末端顺序为 QDQVIKFT), 2 种 A 链
有 83%的同源性 ,2种A 链的羧基末端均为 Asn 。
根据异毒素对 Sepharose 4B的亲和力差异可分
为2类异毒素 ,第 1类对 Sepharose 4B 有较强的亲
和力 , 凝集活性强 , 为 S 型(或 B-1 型);第 2 类对
Sepharose 4B 的亲和力较弱 ,凝集活性较弱 ,为 W
型(或 B-2型)。毒素 B链均含有 2个半乳糖结合位
点 ,在一级结构上的位置为 Asn51和 Asn260 ,其中
对于 S型毒素 ,B 链的 2个半乳糖结合位点附近均
有 1个芳香族氨基酸 。而对于 W 型毒素 ,B 链的 2
个半乳糖结合位点附近以 His253代替了 S 型毒素
相应位置的 Trp253 ,从而使其对半乳糖的结合能力
减弱 ,这可能是不同异毒素毒性有差异的原因之一 。
不同异毒素B链除了 12个氨基酸不同外 ,其他序列
高度保守 ,其羧基末端为 Phe。
国外学者对 8 种 RIPS 进行了氨基酸顺序比
较 ,发现在相思子毒素的 A 链中有 13个绝对保守
的氨基酸 , 分别为 Tyr17 , Phe20 , Arg25 , Ty r74 ,
Tyr113 , Gly130 , Ala152 , Glu164 , Ala165 , Arg167 ,
Glu195 ,Asn196 , Try198 , 表明这类 RIPS 可能起源
于共同祖先[ 8] 。
相思子毒素所含的糖基主要存在于 B 链上 ,糖
的类型为甘露糖和 N-乙酰葡萄糖胺 ,毒素经糖基修
饰后 ,可以增加其自身结构的稳定性 ,防止降解 ,增
强对极端条件的适应性。目前已阐明了 Abrin a 的
B 链的 2个糖基化位点附近的氨基酸序列及糖链结
构 ,糖肽附近的氨基酸顺序为 Asp-Asn(CHO)-Gly-
Thr ,Gly-Asn(CHO)-Asn ,其序列分别类似于 Ricin
D 的 B 链 Asp94-Asn(CHO)-Gly-Thr97 , Thr134-Asn
(CHO)-Asn136 。
1.2　高级结构　晶体结构研究表明[ 9 ～ 11] ,相思子
毒素A 链分为3个折叠区域 ,区域 1由第 1 ～ 109位
氨基酸残基组成 ,包含 6个平行的 β-折叠(a , b , c ,d ,
e , f)和 2个α-螺旋(A ,B),螺旋 A由第 14 ～ 28位氨
基酸残基组成 ,螺旋 B 由 93 ～ 97位氨基酸组成 ,它
们在一级结构上的排序为 aAbcdeBf。区域 2 包含
第 110 ～ 197位氨基酸残基 ,是相思子毒素 a与蓖麻
毒素分子中最保守的区域 ,包括 5个α-螺旋(C ,D ,
E ,F ,G), C 从第 113 ～ 119 位氨基酸残基 , E 从第
148～ 167 位氨基酸残基 ,F 从第 169 ～ 180 位氨基
酸残基 ,G 从第 189 ～ 196位氨基酸残基 。相思子毒
素 a的这 4个螺旋与蓖麻毒素相应的 4个螺旋极为
相似 ,只有 D 螺旋 ,第 131 ～ 142 位氨基酸残基 ,二
者的差异较大 。相思子毒素 a的 D 螺旋的氨基酸
残基数比蓖麻毒素少 3 个。区域 3 包含第 198 ～
251位氨基酸残基 ,含 2个α-螺旋(H , I)和 2个反平
行 β-折叠(g ,h)。一级结构排序为 HghI 。相思子毒
素 a的 A 链羧基末端比蓖麻毒素少 4个氨基酸残
基 。关于相思子毒素 a 及蓖麻毒素的 A 链折叠上
的差异都有可能影响对核糖体的识别和结合。
相思子毒素 a的 B链的整个折叠方式与蓖麻毒
素相似 ,但它们的 N-末端氨基酸残基第 1 ～ 12位及
几个突环(第 39 ～ 45 , 100 ～ 106 , 109 ～ 118 , 133 ～
139 ,166 ～ 170 ,193 ～ 204 位氨基酸残基)有较大差
异 。相思子毒素 a的 B链由 2个区域组成 ,每个区
域又包含4个亚区λ,α, β ,γ,每一区域的主体结构是
由α,β ,γ组成 ,亚区 2λ连接 B 链的 2个区域 ,亚区
1λ参与 A ,B链之间二硫键的形成 , 2个λ亚区间有
同源性 ,但与其他亚区有区别 。2个亚区的α,β , γ
间均有同源性。除了 1λ亚区 ,相思子毒素 a的 B链
的其他亚区的氨基酸链长度与蓖麻毒素的相应亚区
相同 。相思子毒素 a 的 1λ亚区 N-末端比蓖麻毒素
的 1λ亚区多 4 个氨基酸残基 。相思子毒素 a 的 B
链的每一个区域均包含一个疏水核 ,形状类似于蓖
麻毒素的疏水核 。早先有人提出了蓖麻毒素的 B
链的进化理论 ,认为 B链的祖先是 1α亚区 ,因为仅
是 1α肽链保留了所有的关键结构和功能特征 ,基因
复制和融合产生了α,β , γ分子 ,然后加上λ肽链进
一步稳定了分子结构 ,再复制产生(α,β ,γ,λ)2 结构。
在相思子毒素 a的 B链晶体结构研究中也表明其极
符合于蓖麻毒素的 B链的进化方式。
2　相思子毒素的毒性机制
相思子毒素对真核细胞的作用至少涉及 3个方
面:①B链结合于细胞膜上的受体。②完整相思子
毒素或片段跨膜转运进入胞质。 ③通过 A链催化
失活核糖体 ,抑制蛋白质的合成。相思子毒素对细
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菌核糖体无效 ,植物细胞的核糖体比动物细胞的核
糖体对相思子毒素的敏感性弱 。
标记示踪显示 ,很多类型的细胞表面都能与相
思子毒素结合 ,在 4℃条件下 ,毒素-受体复合物是
呈弥散分布的 ,当细胞在内化允许的温度条件下孵
育时 ,发现毒素可同时通过被覆小凹和非被覆小凹
2条途径进入细胞内。无论通过何种途径入胞 ,相
思子毒素进入细胞内可能定位于由单位膜形成的小
泡和管状结构内 。Sandvig 等发现 ,毒素内化后具有
逆行转运的特点 ,即通过膜泡将毒素运输到高尔基
堆 ,形成分泌囊泡进一步转运到内质网 ,其中有极少
量的毒素到达胞质。A链被运至核糖体后 ,发挥其
N-糖苷酶的作用 ,可催化真核细胞核糖体 60S 大亚
基的 28S rRNA的第 4324位脱腺嘌呤 ,使之不与延
长因子 2结合 ,从而抑制蛋白质合成过程中多肽链
的移位 ,最终因蛋白质合成障碍导致细胞死亡 。
Arg167在 A链毒性作用中起重要作用[ 8] 。将
Arg167突变为 Leu , 活性下降至原来的 1/625。
Glu164在维持稳定结构方面有重要作用 ,将 Glu164
突变为 Ala ,活性仅降至原来的 1/25 。X-衍射分析
表明 ,在脱嘌呤过程中 ,Glu164 起稳定核糖体中氧
正碳离子(Oxycarbonium)的作用 , Glu164 突变成
Ala后产生的洞穴能被邻近的 Glu194补充。
3　相思子毒素的临床应用前景
3.1　抗癌药　早期研究表明 ,相思子毒素对动物白
血病 、B-16黑色素瘤 、Lew is肺癌和人癌移植物 ,如
纤维肉瘤 、卵巢肉瘤 、恶性黑色素瘤 、卵巢癌 、Ew ing
肉瘤等均有不同程度的抗肿瘤活性 ,但随着进一步
的临床研究 ,表明其特异性较差 ,原因在于相思子毒
素的 B链几乎可以和所有细胞的糖蛋白或糖脂结
合 ,因而使得相思子毒素分子直接用作抗癌药受到
局限 。但是近年来有文献[ 13]报道 ,口服相思子毒素
对手术后恶性肿瘤的转移有抑制作用 ,相思子毒素
抑制小鼠癌转移的最小有效剂量为 1ng·d-1 ,最佳
剂量为 2 ～ 5ng·d-1 。研究表明 ,一部分口服的相思
子毒素可结合胃肠道壁的淋巴细胞膜受体进入体
内 ,即通过消化道的淋巴系统而吸收 ,从而发挥其特
异的生物学功能 。小鼠口服相思子毒素可诱导外周
白细胞和淋巴细胞的增加 ,诱导γ-干扰素的生成 ,
从而增强机体的抗肿瘤免疫。由此推测相思子毒素
作为抗癌药物可能因为其发挥了双面作用 ,一方面
为相思子毒素对肿瘤细胞有直接杀伤作用 ,另一方
面为相思子毒素可增强机体的抗肿瘤免疫功能。
3.2　免疫毒素　免疫毒素是毒素与针对特异性肿
瘤的靶向部分 ,如单克隆抗体 、激素 、细胞因子 ,通过
化学交联或基因融合后所制备的重组毒素 ,可定向
至靶肿瘤细胞并将其杀伤 ,相思子毒素制备的免疫
毒素极大地提高了其选择性。Waw rzynczak 等[ 14]
使用交联剂 SPDB将针对人类小细胞肺癌(SCLC)
表面抗原的单克隆抗体(SWA11)与相思子毒素 A
链偶联制成的免疫毒素。体外试验表明 ,蛋白合成
被抑制 50%的免疫毒素浓度为 10pmol·L-1 ,蛋白
合成被抑制 99%的免疫毒素浓度为 1nmol·L-1 。
相思子毒素 A 链与针对人结肠癌胚抗原(CEA)产
生的单克隆抗体(C27)偶联制备的免疫毒素
(MAAAC),在体外体内均显示了高度特异性。体
外试验表明 ,免疫毒素可以有效抑制培养基中分泌
CEA的人结肠癌细胞(LS174T),其 50%的克隆被
抑制和 50%的蛋白质生物合成被抑制所需的毒素
浓度分别为 0.09 和 0.06μg·mL-1 ,如果延长免疫
毒素的处理时间 ,克隆抑制达到 96.3%,此免疫毒
素具有很好的靶细胞特异性 ,对于能分泌结肠癌胚
抗原的靶细胞(LS174T)的毒性是不存在相应抗原
的其他细胞的16倍[ 15] 。体内试验表明 ,免疫毒素可
以完全杀灭移植于裸鼠体内的 LS174T 。预测由相思
子毒素 A链制备的免疫毒素对肿瘤患者可能有较好
的临床疗效。
Waw rzynczak等使用相同的交联剂 SPDP ,将单
克隆抗体与一系列毒素 ,如蓖麻毒素 A 链 、相思子
毒素A 链 、白树因毒素 、蒴莲根毒素交联构建免疫
毒素 ,发现相思子毒素 A链构建的免疫毒素有最长
的血清半衰期 。分析原因可能在于相思子毒素 A
链有独一无二的特征:①不含糖基 。 ②等电点为
4.6 ,较蓖麻毒素 A 、白树因毒素 、蒴莲根毒素的等电
点(分别为7.5 ,8.15 , 8.6)偏酸性 ,很可能相思子毒
素 A链与抗体之间的局部电荷相互作用诱导形成
的杂交分子 ,有更为致密的构象 ,其间的二硫键受到
保护 ,不易受还原剂的攻击作用;另一种可能为相思
子毒素 A链在二硫键附近氨基酸侧链含大量负电
荷 ,与谷胱甘肽(生理条件带负电荷 ,是体循环中最
丰富的还原性分子)产生电荷排斥效应 。相思子毒
素 A链制备的免疫毒素有较长的血清半衰期 ,有利
于其发挥更大的药效。
完整相思子毒素比相思子毒素 A 链制备的免
疫毒素毒性大 ,但由于相思子毒素 B链的非特异性
结合使完整相思子毒素制备的免疫毒素的应用受到
限制。
目前 ,相思子毒素制备的免疫毒素均为通过常
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规化学方法连接载体和毒素 ,其原料消耗大 ,制备过
程复杂 ,在某种程度上限制了其生产 、发展和应用 。
近年来应用分子生物学技术将毒素或改造后的毒素
基因与抗体可变区或细胞因子等载体基因融合 ,克
隆表达后获得基因重组免疫毒素 ,从而克服了用化
学交联方法制备免疫毒素的缺点 ,扩大了载体选择
范围 ,使免疫毒素载体的范围越来越广。凡是能将
毒素携带至靶细胞表面 ,并与相应的靶细胞或受体
结合后通过受体介导的内吞作用进入细胞内部 ,并
使免疫毒素穿膜进入胞质发挥毒性作用的成分均可
作为载体[ 16 ～ 19] 。
人们对相思子毒素在医疗上的应用价值作了大
量探索[ 12～ 20] ,由于该毒素的独有特征 ,随着研究的
进一步深入 ,相信其在医疗上将会有更广阔的应用
前景 。
[ 作者简介] 　李丽琴(1972-), 女 , 博士。 主要从事植物毒
素研究。联系电话:(010)66758323。
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(收稿日期:2001-12-31　修回日期:2002-02-05)
　　最新的 COX-2抑制剂伐地考昔片剂(valdecoxib , 商品名 Bex tra)2001 年底获 FDA 许可 ,现已在美国全面上市 ,用于治疗骨
关节炎(OA)、成人类风湿性关节炎(RA)以及用于治疗经期痛性痉挛。
Bextra 是 Pharmacia/P fizer公司推出的第 2 个 COX-2 抑制剂 ,它耐受性良好 , 上消化道安全性良好。在 2 项为期 3 个月的
大型随机临床研究中 ,与非甾体抗炎药(NSAID)布洛芬 、萘普生和双氯芬酸相比 , Bex tra组内窥镜检出的胃十二指肠溃疡发生
率明显较低。内窥镜检查结果与临床有关的严重上消化道反应之间的相关性尚未确定。最常见的不良反应有头痛 、腹痛 、消
化不良 、上呼吸道感染 、恶心和腹泻。
妊娠末期患者禁用 Bex tra和塞来昔布(因可能增加早产儿动脉导管闭合的危险);此外 , 哮喘 、荨麻疹患者 、服用阿司匹林
或其他 NSAID出现过敏反应的患者禁用。体液潴留 、高血压或心衰患者慎用。有肝 、肾功能障碍的患者应告知其医生。
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　Chinese Jou rnal of New Drugs 2002 , Vol.11 No.5 中国新药杂志 2002年第 11卷第 5期