全 文 ： 论著 文章编号:1007 -8738(2007)08 - 0763 - 03
双抗体夹心 ELISA法检测相思子毒素
穆晞惠 , 童朝阳*, 郝兰群 , 许秀玲 , 刘　冰 , 沈　桦 (防化研究院第四研究所 , 北京 102205)
收稿日期:2006 - 09 -27;　接受日期:2006 - 11 - 06
作者简介:穆晞惠(1978 - ), 女 , 黑龙江鸡西人, 研究实习员
*Correspond ing au thor, Te l:010-66758322
E-m ail:zhaoyangtong@ sohu. com
[摘 要 ] 　目的:建立相思子毒素 (abrin)的酶联免疫检测方
法 , 为 abrin临床诊断 、中毒治疗 、 法医学鉴定等应用领域提
供技术基础和参考依据。方法:采用双抗体夹心 ELISA法来
检测微量 abr in。结果:该法检测 abrin线性范围为 0. 25～ 125
μg /L, 线性回归方程为 Y =0.51015X +0.4153(r=0.9880, n =10,
P <0.0001), 检测下限为 0. 25 μg /L。不同浓度蓖麻毒素
( ric in)、 葡萄球菌肠毒素 B(SEB)对检测结果基本无干扰。
该法能用于 ab rin毒素污染水样 、 土样 、 食品 、 血液等模拟样
品的分析 , 相对标准差为 3.52%～ 4. 86%, 具有较好的重现
性。结论:成功地建立了双抗体夹心 ELISA法检测 ab rin, 将
多克隆抗体的强富集能力和单克隆抗体(mAb)的特异性结合
起来 , 提高检测的灵敏度和特异性 , 可适用于各种微量 abrin
样品的分析。
[关键词 ] 相思子毒素;双抗体夹心法;酶联免疫吸附试验
[中图分类号 ] R122. 12　　　[文献标识码 ] B
　　相思子毒素 (abrin)是从豆科植物种子中分离的
一种细胞毒性蛋白 , 其结构 、作用机制与蓖麻毒素类
似 , 相思子毒素没有特异的化学基团和元素 , 一般的
物理 、化学和生化方法很难给予鉴别 , 中毒早期无特
殊中毒症状和病变 , 待发现中毒症状后 , 已难以治
疗 , 对这类毒素的检测只能依赖于抗原-抗体特异反
应的免疫学检测方法 [ 1 -9] , 但国内至今未有这方面
的报道 。本研究中我们将多克隆抗体的强富集能力
与单克隆抗体 (mAb)的高度特异性相结合 , 巧妙设
计了一种灵敏度高 、特异性强的检测方法 , 为毒素临
床诊断 、中毒治疗 、法医学鉴定等应用领域提供技术
基础和参考依据 。
1　材料和方法
1. 1　材料　 ab rin标准品 、 abrin mAb和多克隆抗体均由本实
验室制备;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG、 底物 N-四
甲基联苯胺(TMB)、 牛血清白蛋白(BSA)购自华美生物技术
有限公司;680型酶标仪(B ioRad, 美国)。
1. 2　方法
1. 2. 1　 abrin mAb与多抗的效价测定　用常规间接 ELISA
法 [ 10] , 并判断抗体的活性。
1. 2. 2　夹心 ELISA法　①抗体包被:用 pH 9.6的 0. 05 m ol /L
碳酸盐缓冲液将 ab rin多抗稀释成浓度为 5 m g /L包被酶标
板 , 每孔 0. 1 m L。 42℃孵育 5 h, 倒去包被液 , 用 PBS-T洗 3
次 , 甩干。其中一孔不加包被抗体 , 作为试剂空白。 ②封闭:
用 10 g /L BSA-PBST封闭板上的空白位点 , 每孔 0.2 mL,
37℃孵育 1 h, 甩干。 ③加待检样品:除试剂空白及另留 1排
孔作为阴性对照外 , 其余各孔加待测样品或倍比稀释的标准
品各 0.1 m L, 阴性对照孔加 0. 1 mL的 10 g /L BSA-PBS, 37℃
孵育 1 h, 用 PBS-T洗 3次 , 甩干。 ④加 abrin mAb:除试剂空
白孔外 , 其余各孔加浓度为 10 m g /L的 ab rin mAb 0. 1 mL,
37℃孵育 1 h, 用 T ris-HC l-T洗 3次 , 甩干。 ⑤加辣根过氧化
物酶标记山羊抗小鼠 IgG:所有各孔加 1∶8 000稀释的羊抗鼠
IgG液 0.1 mL, 37℃孵育 1 h, 用洗涤液 T ris-HC l-T洗 6次 ,
甩干。 ⑥加底物显色:每孔加 10 g /L TMB 0.1 mL, 37℃孵育
15 m in, 再加 2 m o l /L H2 SO 4 0. 05 mL, 使反应终止。 ⑦读数:
在伯乐 680型酶标仪上 450 nm 波长处 , 测定 A450值 , 用试剂
空白孔调零。
1. 2. 3　检测限 、线性范围与特异性　根据上述步骤建立双抗
体夹心 ELISA法的标准曲线 , 判断该法的检测限 、 线性范围
等指标 , 并用此法检测不同浓度 abrin、蓖麻毒素 ( ricin)和金
黄色葡萄球菌肠毒素 B(SEB)来考察其特异性。
1. 2. 4　 ab rin模拟样品的测定　称取土壤 、 奶粉 、饼干各 1 g,
血液 5μL, 加稀释液搅匀至 5 mL, 自来水 、 鲜牛奶直接取
5 mL, 每个样品中加入 abrin至最终浓度为 15. 6 μg /L的
ab rin模拟样品。对不同模拟样品 3 000 r /m in, 10 m in离心 ,
取上清液测定 abrin浓度 , 并计算检测的回收率 、 相对标准差
等指标。
2　结果
2. 1　abrin mAb与多抗的效价测定　 abrin mAb、多抗的效价
分别约为 1∶2.5×105和 1∶3×106 , 表明该两种抗体活性能很
好的满足本实验的需要。
2. 2　最适抗体包被浓度的确定　分别用浓度为 0. 5、 1、 2. 5、
5、 10、 20、 30和 40 mg /L的 abrin多抗包被酶标板 , 加入浓度
为 7.8 μg /L的 abrin标准品及浓度为 20 mg /L的 abrin mAb,
同等条件下进行双抗体夹心 ELISA, 根据 A450值的变化选择适
合的包被浓度。在浓度 0.5～ 5 mg /L时 A450值呈递增趋势 , 当
>5 mg /L时趋于饱和 , 故本试验确定 abrin多抗最适包被浓
度为 5 m g /L (图 1)。
　　在抗体包被方式研究中我们已经发现 42℃包被 5 h法优
于通常采用的 4℃过夜法 , 此种包被方法不仅缩短了包被时
间 , 而且提高了检测的灵敏度。在此基础上 , 我们进一步比
较了包被不同浓度 abrin mAb、多抗检测效果 (图 2), 研究结
果发现包被 abrin多抗检测不同浓度的毒素时 A
450
值呈现出线
763ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Chin J Ce llM o l Immuno l)2007, 23(8)
DOI牶牨牥牣牨牫牬牪牫牤j牣cnki牣cjcmi牣牥牥牬牫牪牰
性递增 , 并逐渐达到饱和的趋势 , 而包被 mAb没有这种关
系 , 表明包被 abrin多抗明显优于 mAb。
图 1　不同包被浓度的 abrin多抗与 A
450
值的关系
图 2　 abrin mAb、多抗包板与 A
450
值间的关系
2. 3　 abr in mAb最适浓度的确定　用浓度为 5 m g /L的 abrin
多抗包板 , 封板后加入浓度为 7. 8 μg /L的 ab rin标准品 , 洗
板后加入浓度分别为 0. 5、 1、 5、 10、 15、 20、 25和 30 m g /L的
abrin mAb, 同等条件下进行双抗体夹心 ELISA, 根据 A450值的
变化选择适合浓度的 abrin mAb。在浓度 0. 5 ～ 10 m g /L时
A450值呈递增趋势 , 当浓度 >10 mg /L时趋于饱和 , 故本试验
确定 ab rin mAb最适浓度为 10 m g /L。
2. 4　相思子毒素工作曲线的建立　以制备的 abrin标准品浓
度为横坐标 , 以 A450值为纵坐标作图 , 建立的双抗体夹心
ELISA法检测 abrin的标准曲线。当 abrin浓度为 0. 25 ～ 125
μg /L之间时 , 检测毒素的对数浓度(X)与其 A450值(Y)之间
呈良好的线性关系 , 对此进行线性回归分析 , 当待测 abrin浓
度在 0. 25 ～ 125 μg /L时 , 浓度和 A450值呈线性回归关系
(图 3), 线性回归方程为 Y =0. 51015X +0. 4153(r =0.9880,
n =10, P <0.0001)。
图 3　双抗体夹心 ELISA法检测 abrin工作曲线
2. 5　检测限和重现性　在 0. 25 ～ 125 μg /L检测的浓度范围
内 , 以 P /N>2.1作为判定阳性的标准, 则检测限为 0.25μg /L。
在检测的线性浓度范围内 , 选择 4个浓度 (62.5、 15. 6、 3. 9
和 0. 96 μg /L)abrin标准品 , 每个浓度反复测定 4次 , 分析双
抗体夹心 ELISA法检测 abrin的重现性。该方法检测 4个浓度
abrin的相对标准差分别为 3.52%、 3. 86%、 4. 69%和 4.86%,
平均相对标准差为 4.23%, 故具有较好的重现性(表 1)。
表 1　双抗体夹心 ELISA法检测不同浓度相思子毒素的数据
Ab rin
(g /L)
A450
1 2 3 4
x±s RSD(%)
62. 5 1. 386 1. 292 1. 308 1. 375 1. 340±0. 05 3. 52
15. 6 1. 089 1. 019 1. 079 1. 118 1. 076±0. 04 3. 86
3. 9 0. 759 0. 705 0. 693 0. 756 0. 728±0. 03 4. 69
0. 96 0. 397 0. 356 0. 372 0. 362 0. 372±0. 02 4. 86
2. 6　特异性　用建立的双抗体夹心 ELISA法检测 abrin时 ,
随着 abrin浓度增加 , A450值呈线性递增趋势。而选用 abrin抗
体 , 采用该法检测不同浓度 ricin和 SEB时 , 其所得 A450值与
阴性值接近 , 表明该法检测 ab rin具有很好的特异性。
2. 7　abr in模拟样品的测定　该法能满足水样 、土样 、 食品 、
血液等人工模拟样品的分析要求 , 具有较好的回收率和重现
性 (表 2)。
表 2　Abrin模拟样品的测定 (n=6)
样品
种类
实际值
(g /L)
测定值
(g /L)
回收率
(%)
相对标准差
(%)
水样 7. 8 7. 6±0. 31 97. 7 4. 07
土壤 7. 8 7. 5±0. 38 95. 5 5. 10
奶粉 7. 8 7. 4±0. 45 94. 2 6. 12
鲜牛奶 7. 8 7. 3±0. 39 93. 3 5. 36
饼干 7. 8 7. 2±0. 30 92. 1 4. 18
血液 7. 8 7. 0±0. 34 90. 3 4. 83
3　讨论
ab rin由于毒素纯化 、抗体制备较困难 , 国内至
今未有建立 ELISA检测 abrin的报道 。本研究我们在
长期从事 abrin纯化 、抗体制备的基础上 , 建立一种
双抗体夹心 ELISA法检测 abrin方法 , 具有较高的灵
敏度 、特异性和重现性 。在夹心法抗体的选择试验
中 , 我们发现包被多抗的效果明显优于 mAb, 这可能
与多克隆抗体对抗原有更大的亲和力 (本试验中
abrinmAb、多抗的亲和常数分别为 2.87×107 mol /L、
4.21×108 mo l /L),包被多抗更容易富集溶液中的
ab rin, 并将其牢牢 “抓住 ”, 而 mAb由于亲和力较弱 ,
不易富集溶液中的 abrin并将其 “抓牢 ”, 在洗脱的过
程中容易脱落 , 导致了包被 mAb测定时结果非常不
理想。此外 , 我们实验室还将这种 “双抗体夹心技
术”成功用于生物素-亲和素系统的免疫分析中 , 建
立了 “双抗体夹心-生物素-酶标亲和素 ELISA法 ”
(S-BA-ELISA)来检测 abrin, 也达到了提高检测灵敏
度的目的。与 S-BA-ELISA法相比 , 我们建立的 S-
ELISA除检测限稍低外 , 其检测的线性范围更宽 。
这些研究均表明 , 采用多抗进行包被 、 mAb进行识
(下转 766页 )
764 ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Ch in J Ce llM ol Immuno l)2007, 23(8)
图 1　FLAG-FHLs在 293T细胞中的表达
A:α-FHL2Western b lot分析 FLAG-FH Ls的表达;B:α-FLAG W estern
b lot分析 FLAG-FH Ls的表达. 1:pcDNA3-FLAG; 2:p cDNA3-FLAG-
FH L1;3:pcDNA3-FLAG-FH L2;4:p cDNA3-FLAG-FHL3;5:pcDNA 3-
FLAG-FHL4;6:pcDNA3-FLAG-FH L5.
图 2　W estern blot分析 FHL2在组织中的表达
A:α-FH L2;B:α-GAPDH. 1:乳腺;2:前列腺;3:心脏;4:脾;5:胃;
6:肌;7:肝组织.
2. 3　FHL2在乳腺癌细胞和肝癌细胞中的表达　FH L2在乳
腺癌细胞系 MDA-M B-468、 MCF10A、 T47D4、 MCF7和肝癌细
胞株 H epG2、 Lo2中表达(图 3), 而在另外一些乳腺癌细胞
系 , 如 MDA-MB-453、 SKBR3、 MDA-MB-436和人胚肾细胞
293T不表达。
图 3　W estern blot分析 FHL2在乳腺癌和肝癌细胞中的表达
A:α-FHL2;B:α-GAPDH. 1:MDA-MB-468;2:MCF10A;3:T47D;
4:MDA-MB-453;5:MCF7;6:SKBR3;7:MDA-MB-436;8:293T;
9:H epG2;10:Lo2.
3　讨论
高灵敏性的抗体对于基因的功能研究有很重要
的作用。我们制备的抗体滴度高 , 不仅可以检测到
文献报道的心脏和肌组织中 FHL2的表达 , 还发现其
在乳腺 、前列腺和肝脏中也有表达 , 推测 FHL2在更
广泛的组织中发挥功能 。另外 , FHL2在乳腺癌和肝
癌细胞中表达 , 预示其在癌症的发生发展中发挥一
定的作用 。
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(上接 764页 )
别的这种 “双抗体夹心免疫分析技术”可将多克隆抗
体的强富集能力与 mAb的特异性结合起来 , 达到了
提高检测的灵敏度和特异性的目的。
在建立该方法的过程中 , 我们发现洗脱液的 pH
值 、离子强度是影响检测结果的一个重要因素 , 通常
采用的近中性的洗脱缓冲液 (例如 pH7.4 PBS)进行
洗脱时本底值非常高 , 不能用于免疫检测。这可能
是因为未结合的 abrin mAb、辣根酶标记山羊抗小鼠
IgG非特异性地吸附到固相载体上 , 引起试验非特异
性显色导致本底值升高 , 因此 , 在操作过程中应尽可
能地减少非特异性吸附 。根据这一设想 , 我们在试
验中选择高离子强度 、偏碱性的 pH9的 1mol /L Tris-
HC l缓冲液(含 1mL /L Tw een-20)洗去未结合的 abrin
mAb、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG , 显著降低了测定
的本底值 , 灵敏度大大提高。
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