全 文 ：　第 27卷 第 1期
2006 年 1 月
武汉大学学报(医学版)
Medical Journal o f Wuhan Unive rsity
Vol.27 No.1
Jan , 2006
作者简介:罗凡 ,女 , 1982- ,医学硕士生 ,主要从事临床病毒学研究
通讯作者:杨占秋 ,男 , 1952- ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事医学病毒学研究
草血竭抗流感病毒的研究
罗　凡1 　侯　炜1 　杨占秋1 　郝建新2 　锡谷达夫3 　森修一3
1武汉大学医学院病毒学研究所/病毒学国家重点实验室　武汉　430071;
2湖北中医学院药学系　武汉　430061;
3日本福岛县立医科大学微生物系　日本福岛　960-1242
摘要　目的:为研究草血竭体外抗流感病毒作用机理。方法:采用噻唑蓝(M TT)比色法检测细胞活性及空斑
减数实验测定病毒滴度 ,以确定草血竭两个有效成分细胞内抗流感病毒的作用。结果:实验发现草血竭水煮醇沉干
浸膏和草血竭纯化部分既不能阻断流感病毒侵入细胞 , 也不能抑制流感病毒的生物合成 , 且各药物浓度组均出现
典型的细胞病变效应(CPE);但草血竭水煮醇沉干浸膏与草血竭纯化部分能够明显杀灭病毒 ,即随药物浓度的增
加 , CPE 特征逐渐减弱 , 病毒滴度也逐渐降低 , 而空斑减数率明显升高。结论:草血竭在体外通过直接灭活作用发
挥抗流感病毒作用。
关键词　草血竭;流感病毒;抗病毒作用
中图分类号　R373.1+3　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2006)01-0072-03
Antiviral Activity of Polygonum PaleaceumWall Against Influenza Virus in Vitro
LUO Fan
1 , HOUWei1 , YANGZhanqiu1 , HAO Jianxin2 , TATSUO Suzutani3 , SHUICHI Nori3
1StateK ey Laboratory o f Virolog y &Insti tute of Virology ,S chool o f Medcine ,
Wuhan University , Wuhan 430071 ,China
2
Dep t.o f Pharmacology , Hubei College o f Tradi tional Chinese Medicine , Wuhan 430061 , China
3Dept.of Microbiology , Fukushima Medical Univ ersity , 1 HIK arigaoka , Fukushima 960-1295 , Japan
Abstract
Objective:To investigate polyg onum paleaceum walls anti-influenza virus ef fects in vi tro.
Methods:The anti-viral effects of tw o active components abst racted f rom poly gonum paleaceum
wall w ere investig ated by the technique o f plaque test in culture , by applying M T T colo rimetric
assay fo r viable cell rate.Results:I n v itro , tw o active components w ere observed to be inhibitor s
ag ainst inf luenza virus in a concentration-dependent manner.A s the do se of drugs increased , viral
ti ters decreased and plaque inhibit ion rate increased co rrespondingly .Conclusion:Poly gonum
paleaceum wall direct ly inactivate inf luenza virus but not inhibi t the viral biosynthesis or blo ck
the adsorption to susceptible cells in v itro.
Key Words　Poly gonum Paleaceum Wall;Inf luenza Virus;Anti-viral Ef fect
　　流行性感冒是由流行性感冒病毒(influenza vi-
rus ,简称流感病毒)引起的严重危害人类健康的一
种急性病毒性呼吸道传染病[ 1] ,具有传染性高 、传播
迅速 、易发生流行等特点 ,每年冬春季节均有大规模
爆发与流行 。甲型流感病毒由于抗原极易发生变
异 ,曾多次造成世界性大流行。目前 ,国际上预防与
DOI :10.14188/j.1671-8852.2006.01.022
　第 1 期 罗　凡 ,等.草血竭抗流感病毒的研究
治疗流感的主要措施有:①疫苗接种[ 2] :由于流感
病毒的抗原变异 ,上一次流感发病期间所用的疫苗
对下一次流感爆发会失去预防作用 ,且疫苗的预防
效果也只有 70%-90%;②金刚烷胺类药物[ 3] :是目
前临床上常用的抗流感药物 ,但存在神经毒性 、长期
用药易产生耐药株 、对乙型流感病毒无效等缺点;③
神经氨酸酶抑制剂[ 4] 和反义寡核苷酸[ 5] :目前尚处
于进一步深入研究阶段 ,临床上应用不广。因而 ,抗
流感病毒药物研究具有重要的实际意义。实验初步
发现草血竭有抗单纯疱疹病毒-1 型作用 ,在此基础
上本实验初次将草血竭用于抗流感病毒作用的研
究 ,现报告如下 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　药物　草血竭经湖北中医学院郝建新教授
鉴定 。草血竭水煮醇沉干浸膏(以下简称为样品 1):
每毫升含 0.142 8 g 生药 ,湖北省中医学院生产 ,批
号:990318;草血竭纯化部分(以下简称为样品 2):每
毫升含 0.283 g 生药 ,湖北省中医学院生产 , 批号:
020526。
1.1.2　细胞　传代犬肾细胞(MDCK)由武汉大学
医学院病毒学研究所提供。培养 MDCK 细胞的培
养基用DMEM(Dulbecco s M odif ied Eagle s Medi-
um)培养基(美国 Gibco公司产品)。MDCK细胞生
长液中含有 10%的胎牛血清 、1×105 U/L 青霉素 、
100 mg/L 链霉素;MDCK 细胞维持液中除含有 2%
的胎牛血清外 ,其它同细胞生长液 。
1.1.3 　病毒 　流感病毒为 Yamagata/120/86/
H1N1株由日本福岛医科大学微生物系锡谷达夫教
授惠赠。
1.2　方法
1.2.1　药物细胞毒性测定　在 96 孔板上 ,加每孔
0.1 ml 1×109/L 浓度的 MDCK细胞 ,培养 24 h ,加
含药维持液。含药维持液浓度为0.01 , 0.1 , 1.0 , 10 ,
100 , 1 000 mg/L , 37 ℃、5%CO2培养 ,以 MTT 法检
测细胞存活率 。每一药物浓度均重复 4 孔 ,同时设
正常细胞对照。
1.2.2　药物抗病毒实验　接种在 24孔板上的细胞
长成单层后分成 3 组 ,分别以 3种不同方式进行抗
病毒试验 ,各组均设正常细胞对照以及单用病毒感
染对照:①药物对流感病毒侵入 MDCK 细胞的阻
断作用(预防作用):以含不同浓度药物的 DMEM 培
养液预先与细胞孵育 1.5 h ,用 PBS 洗涤 3次后 ,以
每孔 2.5×105 PFU/L 的流感病毒感染细胞 , 35 ℃吸
附 1.5 h后 ,加含 2%琼脂糖的细胞维持液 ,置 35 ℃、
5%CO 2培养 ,每日检查病毒生长情况 ,4 d后以空斑减
数实验检测病毒滴度。 ②药物对流感病毒的直接杀
伤作用:将含不同浓度药物的 DMEM 培养液与 2.5×
10
5
PFU/L 的病毒悬液等量混合 ,摇匀 , 35 ℃水浴作
用 1.5 h后 ,再将其感染 MDCK 细胞 ,吸附 1.5 h后
PBS洗涤 ,其它处理同上 。③药物对流感病毒生物合
成抑制作用:先以病毒感染细胞 ,吸附 1.5 h后 ,用
PBS洗 3次 ,加入含不同浓度药物的细胞维持液 ,同
上法培养与检查。以上实验均重复两次。
1.3　实验结果评判方法
1.3.1　空斑减数实验　待 MDCK 细胞长成完整单
层后 ,去掉旧培养液。按上述 3种方式处理后 ,加入
细胞维持液(含 2%琼脂糖)培养 4 d , 每孔加 1
m l10%甲醛固定 20 min后 ,弃琼脂块 ,加入 0.1%结
晶紫染色 ,计算空斑数 。每次实验重复 3次 。
空斑减数率=(病毒对照组空斑数-药物处理
组空斑数)/病毒对照组空斑数×100%。
1.3.2　细胞存活率测定实验　采用改进的 MT T
法[ 6] ,在培养 33 h 的细胞中每孔加 5 g/ L M TT10
μl ,继续培养 4-6 h ,每孔加二甲基亚砜 100 μl ,振荡
混匀后立即在 570 nm 波长下测定吸光度 A值 。
细胞存活率=药物组平均 A 值/细胞对照组平
均 A 值×100%
1.4 　实验结果的统计学处理方法 　用统计软件
SPSS11.5回归 Reg ression 的 Probit计算半数细胞
存活率。用统计软件 SPSS 11.5的 one-way ANO-
VA 、q检验 、S-N-K法分析草血竭样品 1与样品 2对
流感病毒的直接杀伤作用 ,检验水平α=0.05。
2　结果
2.1　草血竭样品 1与样品 2对MDCK细胞的毒性
作用　根据所得数据 ,采用 Reed-Muench 法计算出
草血竭样品 1和样品2对细胞的50%毒性浓度(Cy-
totoxic Concentration ,CC50),其均小于 100 mg/ L。
2.2　草血竭样品 1与样品 2对流感病毒侵入细胞
的阻断作用　研究结果表明分别以浓度为 0.39 ,
1.56 ,6.25 ,25 ,100 mg/ L 的草血竭样品 1与样品 2
预先处理细胞 1.5 h后 ,再以流感病毒攻击 ,培养 4
d ,各浓度组均出现以细胞皱缩 、变圆 、脱落 、破裂等
为特征的典型 CPE ,检查发现空斑减数率与病毒对
照组一致 ,表明草血竭样品 1和样品 2对流感病毒
侵入细胞无阻断作用。
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武汉大学学报(医学版) 第 27 卷
2.3　草血竭样品 1与样品 2对流感病毒生物合成
抑制作用　先以病毒攻击细胞 ,吸附 1.5 h 后加入
不同浓度药物 , 4 d 内观察到 ,在最高药物浓度下流
感病毒仍能够感染细胞并在其中生长繁殖 。实验表
明 ,空斑减数率不受药物浓度的影响 ,药物处理组与
病毒对照组空斑率一致 ,即草血竭样品 1和样品 2
不能抑制流感病毒的生物合成 。
2.4　草血竭样品 1与样品 2对流感病毒直接杀伤
作用　实验结果表明 ,草血竭样品 1 与样品 2 有明
显的直接杀伤流感病毒作用 ,表现在随药物浓度的
增加 ,细胞皱缩 、变圆 、脱落 、破裂等典型 CPE 特征
逐渐减弱 ,空斑减数率明显升高。草血竭样品 1 与
样品 2在浓度为 0.39 ,1.56 ,6.25 , 25 ,100 mg/ L 时 ,
随药物浓度的增加空斑减数率增加 ,表现出明显的
量效关系(见表 1)。
表 1　草血竭对流感病毒直接杀伤作用
Table1　Anti-influenza virus activity of polygonum
paleaceum wall by directly virucidal effect
Drug dose
(mg/ L)
Plaqu e numbers(piece)
Sample 1 S am ple 2
Plaque reduction rate(%)
S amp le 1 Sample 2
0.39 30.0＊ 37.5＊ 20.0 0.0
1.56 26.0＊＊ 37.5＊ 30.7 0.0
6.25 18.5■ 27.0＊ 50.7 22.9
25.0 1.0■ 21.0■ 97.3 40.0
100.0 11.0■ 7.0■ 70.7 80.0
Virus
cont rol
37.5 35.0 100.0 100.0
　C om pared w i th virus con t rol , ＊P>0.05 , ＊＊P<0.05 , ■P<0.01
3　讨论
病毒性疾病严重危害人类健康 ,随着化学药物的
应用 ,人们发现由此引起的问题也日益严重 ,主要是
毒副反应大 、易产生耐药性 ,而且有效药物很少 ,抗病
毒的种类也有限。天然药物具有无污染 、低毒副反应
等优点 ,中草药是其中的重要组成部分 ,从中筛选有
效药物成为当前抗病毒新药研究的热点。草血竭为
较常用草药 ,蓼科(poly gonaceae),多年生草本 ,分布于
四川 、贵州 、云南等省 ,具有散血止血 、下气止痛 、收敛
止泻之功效 ,用于治疗慢性胃炎 、胃及十二指肠溃疡
等 ,民间也用于治疗痢疾具有良好效果[ 7] 。张小郁
等[ 8] 将草血竭用于镇痛抗炎作用的研究 ,发现对急性
炎症有一定的对抗作用 ,对热板法引起的疼痛有镇痛
作用 ,且持续时间较长 ,有利于炎症的治疗。另实验
将草血竭用于抗单纯疱疹病毒-1型研究 ,结果表明 ,
在无毒浓度内其对病毒有抑制作用(另文报道)。
为了寻找有效治疗流感病毒的药物 ,本实验首次
将草血竭用于抗流感病毒的研究。研究结果表明 ,草
血竭水煮醇沉干浸膏和草血竭纯化部分对 MDCK细
胞的毒性作用相同 ,对 MDCK细胞 CC50均小于 100
mg/ L。草血竭水煮醇沉干浸膏和草血竭纯化部分对
流感病毒感染均无预防作用 ,也无抑制流感病毒生物
合成作用。草血竭水煮醇沉干浸膏和草血竭纯化部
分均产生直接破坏作用 ,随着药物浓度的增加 ,空斑
减数率升高 ,并表现出量效关系。草血竭对流感病毒
无预防作用 ,说明草血竭不能与细胞表面的受体结
合 ,这可能由于草血竭经两种方法提纯后 ,成分仍复
杂 ,针对细胞表面的单一病毒受体的成分含量低 ,从
而不能预防病毒的感染 。但草血竭水煮醇沉干浸膏
和草血竭纯化部分能直接杀伤流感病毒 ,其作用机
理有待于进一步研究。通过现代分析化学的方法对
草血竭化学成分的分离 、纯化 、结构分析鉴定 、抗氧
化活性及其抗炎镇痛等药理活性研究 ,发现草血竭
中可能含有植物甾醇或甾体皂甙 、蒽醌或其甙类以
及糖类 、酚类和鞣质类等 ,初步揭示草血竭清热解毒
作用的药理基础 ,这为草血竭抗流感病毒有效成分
的分离提供了依据 。由于中药成分的复杂性可能影
响体外药效的稳定性 ,同时体外研究也不能充分体
现药物在体内的生化转化效应 ,所以 ,本实验有待于
在动物体内进一步研究草血竭的抗病毒作用 ,以期
获得一种有效的抗流感病毒中药 。
参考文献
[ 1] 　张其威 , 张楚瑜.抗病毒中药研究的最新进展[ J] .中成
药 , 2005 , 27(1):116.
[ 2] 　李仁清 , 阮力.流感疫苗研究进展[ J] .中华实验和临床
病毒学杂志 , 2004 , 18(2):198.
[ 3] 　庞浩龙 , 李站立 , 贡联兵.中西药抗流感病毒研究概况
[ J] .中华临床医药 , 2004 , 5(1):84.
[ 4] 　S tiver G.The treatment o f influenza with antiviral
drug s[ J] .CMAJ , 2003 , 168 (1):49.
[ 5] 　陈忠斌 , 王升启 ,管伟 ,等.反义寡核苷酸体外抗流感病
毒活性[ J] .微生物学报 , 2000 , 40(5):482.
[ 5] 　刘钊 , 杨占秋 , 肖红 , 等.MT T 法在抗病毒药物筛选中
的应用[ J] .武汉大学学报(医学版), 2004 , 25(3):333.
[ 7] 　张小郁.草血竭提取物对胃肠功能的影响[ J] .中药材 ,
2002 , 25(3):192.
[ 8] 　张小郁.草血竭镇痛抗炎作用的研究[ J] .中药药理与
临床 , 2001 , 17(2):19.
(2005-06-15收稿)
编辑　孙孝云
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