全 文 ：免疫学杂志 2016年2月 第32卷 第2期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 32 No. 2 Feb. 2016
·论 著· [文章编号]1000-8861（2016）02-0164-04；[DOI]10.13431/j.cnki.immunol.j.20160033
重组相思子毒素B链蛋白的制备与分析
王俊虹*，杨 帆，魏茂提
[摘 要] 目的构建、表达和纯化相思子毒素B（ATB）链蛋白并分析其抗原性和毒性。 方法运用密码子优化软件优化
ATB基因，合成目的基因亚克隆至原核载体pQE-80L构建表达质粒pQE80L-ATB，转化至E. coli M15获得表达工程菌株，并对
诱导表达条件和纯化条件进行优化；通过Western blot检测重组蛋白的抗原性；采用人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞
GES-1进行重组蛋白的细胞毒性实验。结果 ATB开放阅读框架全长804 bp，编码268个氨基酸残基；表达工程菌株在30 ℃、
1 mmol/L IPTG，3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白，相对分子质量均约为30 000，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后纯度达97%
以上，Western blot和MTS实验结果表明，目的蛋白能特异性识别抗相思子毒素多克隆抗体且无毒性。结论重组ATB蛋白实现
高表达，具有良好的抗原性，为相关疫苗研究奠定基础。
[关键词]相思子毒素B链；抗原性；生物恐怖
[中图分类号] R136.4 [文献标识码] A
Construction and characterization of a recombinant abrin B chain
protein
WANG Junhong1, *, YANG Fan2 , WEI Maoti1
1. Tianjin Key Laboratory for Biomarkers Occupational and Environmental Hazard, Military Epidemiology and
Statistics Section, Faculty of Rescue Medicine, Logistics University of Chinese Peoples Armed Police Force, Tianjin
300309, China; 2. Department of Military Psychology, Logistics University of Chinese Peoples Armed Police Force,
Tianjin 300309, China
*CorrespondingAuthor:WANGJunhong, E-mail: wangjunhong11007@163. com
[Abstract] This experiment designed to construct, express and purify a recombinant abrin B chain protein
(rATB), and then assess its antigenicity and toxicity. rATB was prepared by replacing rare codon with synonymous
codons of high-frequency and subcloned to construct recombinant expression vector pQE80L-ATB. After
expression and purification, rATB was determined by immunoblotting and MTS for its antigenicity and toxicity. Data
showed that an 804 bp gene encoding the recombinant protein with 268 amino acid residues was acquired. M15/
pQE80L-ATB was induced at 30 ℃ by 0.1 mmol/L IPTG for 5 h, and the relative mass of ATB was approximate
30 kDa. SDS-PAGE indicated that the purity of the protein was up to 97% after Ni-NTA purification; Western blot
indicated that rATB could react specifically with the rabbit pAb against AT; MTS showed that rATB was non-toxic
even at high doses. In conclusion, rATB from E. coli possess good antigenicity and can be highly expressed, which
proved a base for developing effective and non-toxic vaccine.
[Key words] Abrin toxin B chain; Antigenicity; Bioterrorism
基金项目：军事预防医学“2110”三期工程建设项目
作者单位：300309，天津市职业与环境危害防制重点实验室武警后
勤学院救援医学系部队卫生统计和流行病学教研室（王俊虹，魏茂
提），军事心理学教研室（魏茂提）
*通信作者：王俊虹，E-mail: wangjunhong11007@163.com
相思子毒素（abrin toxin，AT）是来源于相思子
（Abrusprecatorius）的一种细胞毒性蛋白，由 A链
（ATA）和B链（ATB）2条多肽链通过二硫键组成，其
中A链呈酸性，为毒性单位；B链呈中性，为结合单
位[1-2]，小鼠腹腔LD50约为 0.04 μg/kg [3-4]。由于AT具
有天然资源丰富、制备容易、中毒后无特异症状等特
点，因此很容易被恐怖分子作为生物恐怖剂使用[4]，
也是我国新形势下反恐工作的重要组成部分。
目前，针对毒素中毒免疫预防措施主要包括疫
苗主动免疫接种[1,5]和应用抗体进行治疗[3,6]2方面，由
于中和性抗体只能产生短期的被动免疫保护效果，
因此有效的方法是使用预防性疫苗。AT相关生防
疫苗的研究较少，包括甲醛化的类毒素[5]和基于A链
蛋白的疫苗[1]，但二者的使用受限于毒性问题。同时，
文献报道B链亚单位同样具有很好的免疫原性[7-11]，
而且其他相关报道显示作为AT的候选疫苗，B链亚
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单位具有独特的优势 [12]。首先，如破伤风、霍乱毒
素、白喉等其他的A-B家族毒素已经采用其各自的
B亚单位制备疫苗并被证明是有效的；其次，由于
ATB能特异性的结合到M细胞表面，因此具有佐剂
活性；最后，相思子毒素的B链是无毒的，因此作为
疫苗应用于人体就不存在毒性的问题。
本研究旨在利用原核表达系统高效表达重组
ATB蛋白；分析重组蛋白的抗原性和细胞毒性，为筛
选抗AT中毒的疫苗研制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒与细胞 pMD18-T载体购自TaKaRa
公司；含有目的基因的质粒pUC-ATB由生物公司合
成；原核表达载体 pQE-80L购自Qiangen公司；宿主
菌E. coli DH5α和M15、人正常肺上皮细胞Beas-2B
和胃黏膜细胞GES-1为本实验室保存。
1.2 主要试剂 2×KOD PCR反应试剂（KOD DNA聚
合酶、PCR Buffer、dNTP 混合物）、DL2000 核酸
Marker、限制性内切酶 BamHⅠ、Hind Ⅲ、EcoRⅠ购
自大连 TaKaRa公司，质粒提取试剂盒为北京天根
生物公司产品，5 ml镍预装柱购自GE healthcare公
司，山羊抗兔 IgG购自Santa Cruz公司，抗天然AT兔
多克隆抗体由本实验室制备，细胞毒性试验检测试
剂盒购自Sigma公司，其它化学试剂为国产分析纯。
1.3 编码序列的优化与合成 天然AT有a、b、c、d 4种
亚型，a亚型的细胞毒性最强，本研究选取 a亚型的
氨基酸序列。运用Condonopt软件，采用GenBank检
索登录号 1908235A优化ATB基因，并在上、下游分
别含BamH I、HindⅢ酶切位点，由南京金斯瑞公司
合成，获得pUC-ATB/E. coli Top10F’。
1.4 目的基因表达载体的构建 BamH I和Hind Ⅲ双
酶切克隆测序载体pUC-ATB和表达载体pQE-80L，
胶回收后在16 ℃、T4 DNA连接酶条件下过夜连接，构
建重组表达质粒 pQE80L-ATB，连接产物转化至
CaCl2法制备的E. coli M15感受态细胞中，构建重组
表达菌株M15/pQE80L-ATB，PCR筛选阳性克隆，提
取质粒，进行双酶切鉴定。
1.5 重组蛋白的诱导表达和表达形式的确定 经
PCR 和酶切鉴定正确后，挑新鲜单菌落 M15/
pQE80L-ATB以1∶100转接于10 ml的Amp抗性的LB
培养基（100 μg/ml）37 ℃过夜培养。次日按1∶100比
例转接于 500 ml含Amp抗性的 LB液体培养基，于
37 ℃ 200 r/min振摇培养 3~4 h至OD600 nm为 0.6~0.8
时，加IPTG至终浓度1 mmol/L，30 ℃诱导5 h。8 000 g
4℃离心5 min收集菌体，沉淀用0.01 mol/L PBS洗后
重悬，于冰上超声破碎后，收集上清及沉淀。行凝胶
电泳鉴定，并用考马斯亮蓝染色观察结果。
1.6 重组蛋白的纯化和定量 按 1.5方法进行扩
大培养，离心收集后将沉淀用 0.01 mol/L PBS洗
涤 2次，再分别用 2% Tritox-X 100、2% Tween-20、
1 mol/L NaCl、2 mol/L尿素各洗涤 3次，然后加入
Buffer A（20 mmol/L PB、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L
咪唑，8 mol/L尿素，pH8.0），并上样到Ni柱中，经咪
唑洗脱后收集蛋白目的峰。将收集的蛋白进行梯度
透析复性，分别经 4、2、1、0.5 mol/L尿素和PBS缓冲
液，4 ℃条件下搅拌48 h以上，并用PEG20000浓缩。
行SDS-PAGE电泳分析纯度，采用BCA法定量。
1.7 重组蛋白Western blot分析 行凝胶电泳 rATB
蛋白和M15/pQE80L空质粒表达的菌体蛋白，并转
移至硝酸纤维素薄膜。将转好的硝酸纤维素薄膜
于3% BSA封闭液中37 ℃封闭1 h，用洗涤液振荡洗
膜 3 min/次，共 3次。抗天然AT兔多克隆抗体（一
抗，稀释度为1∶1 000）室温孵育1 h后洗膜3次。再
用HRP标记的羊抗兔 IgG（二抗，稀释度为1∶50 000）
室温孵育1 h，洗膜3次后经化学发光成像系统成像。
1.8 重组蛋白毒性分析 采用MTS试剂盒测定重组
蛋白 rATB和天然AT对人正常肺上皮细胞Beas-2B
和胃黏膜细胞GES-1的杀伤作用。1640培养基培
养人正常肺上皮细胞Beas-2B并计数为（1~2）×104/
孔，DMEM培养基胃黏膜细胞GES-1并计数，分别以
100 μl/孔加入 96孔板中。空白孔只加细胞培养
基。37 ℃ 5% CO2培养箱中生长24 h；分别用2种培
养基对测定蛋白（分别为 rATB或天然AT）进行 5倍
稀释后加入 100 μl/孔（rATB的质量浓度为 1 000、
200、40……0.000 1 ng/ml；AT的质量浓度为20、4、……
0.000 01 ng/ml），阴性对照孔不加毒素；96孔板至
5% CO2细胞培养箱中37 ℃，培养72 h；PBS洗板3遍
后96孔板依次先后加入100 μl培养基和20 μl试剂
盒自带的MTS，并在 37 ℃条件下培养 2 h；Multiskan
Mk3酶标仪上读取A490 nm值并计算细胞生存率。
2 结果
2.1 重组质粒 pQE80L-ATB的构建和鉴定 优化
ATB基因序列成大肠杆菌高频密码子，ATB全长
786 bp，编码268个氨基酸残基。用BamH I/HindⅢ对
重组质粒 pQE80L-ATB进行酶切鉴定和PCR鉴定。
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图1结果显示成功构建了重组质粒pQE80L-ATB。
M) DL2000 DNA marker; 1) PCR amplification products of
pQE80L-ATB; 2) pQE80L-ATB digested by BamHI/HindШ.
图1 质粒pQE80L-ATB的鉴定
Fig 1 Identification of recombinant expression plasmid
pQE80L-ATB
2.2 重组蛋白的诱导表达 M5/pQE80L-ATB工程菌
在沉淀中出现大量目的蛋白，相对分子质量约为30 000
（图2a），表达量约占 73.43%。经Ni柱纯化，目的蛋
白在含 500 mmol/L咪唑洗脱液中被洗脱下来（图
2b），纯化后的纯度为 97%左右。经复性、浓缩后质
量浓度约为0.832 mg/ml。
M) Low molecular weight protein marker; 1,2) total cellular lysate
of M15/pET80L-ATB induced without or with IPTG, respectively; 3) cell
supernatants; 4) cell debris; 5) the purified rATB.
图2 rATB纯化产物SDS-PAGE分析（a）和纯化图谱（b）
Fig 2 The expression(a) and purification(b) analysis of rATB
protein
2.3 重组蛋白的抗原性分析 免疫印迹显示，纯化
后的 rATB蛋白能特异性的与抗天然AT兔多抗体发
生反应（图3），说明目的蛋白具有特异的抗原性。
M) Low molecular weight protein marker; 1) pQE-80L
vector-transformed cell lysates recognized by the rabbit pAb against
AT; 2) purified rATB recognized by the rabbit pAb against AT.
图3 rATB的Western blot分析
Fig 3 Western blot analysis of rATB
2.4 重组蛋白的毒性分析 MTS法测定 rATB对细胞
毒性实验表明，rATB对人正常肺上皮细胞Beas-2B
和胃黏膜细胞GES-1是无毒性的，这与文献报道相
一致；同时细胞存活曲线图 4 表明天然 AT 对
Beas-2B的 IC50约为 0.16 ng/ml，图 5显示 GES-1的
IC50约为0.032 ng/ml。
图4 人正常肺上皮细胞Beas-2B的杀伤作用曲线
Fig 4 Cytotoxic effects of rATB and AT on Beas-2B
图5 人正常胃黏膜细胞GES-1的杀伤作用曲线
Fig 5 Cytotoxic effects of rATB and AT on GES-1
3 讨论
AT是植物来源的蛋白毒素，属于Ⅱ型核糖体失
活蛋白（RIP），其毒性是普通化学武器的几百倍，是
迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一[1]，发展
有效的防治手段已成为各国生防领域的重要研究任
务，而主动免疫是一种预防毒素中毒的有效方法。
目前关于AT相关的生防疫苗研制较少。其中，类毒
素是将天然毒素经甲醛化处理后可以保护免疫动物
的致死剂量毒素中毒[5]，由于具有一定毒性而未有进
一步的发展。2008年，Surendranath等[3]报道了一种
中和性 IgG单抗（D6F10），可以在细胞内或小鼠体内
抑制AT中毒。2011年，我室Han等[1]采用定点突变
技术获得ATA突变体（mABRAE164AR167L），能抵
抗10×LD50剂量的天然毒素攻毒，显示出良好的免疫
原性。
关于毒素B链的免疫原性则存在争议，有文献
报道B链的免疫原性不如A链 [8-10, 13-16]，不适合做疫
苗候选。但也有研究者认为证明B链亚单位同样具
有很好的免疫原性，而且其他毒素的B链蛋白已被
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证明是一种良好的疫苗候选抗原[12]。此外，B链蛋白
在毒素中发挥结合链作用，因此在缺乏A链的情况
下，B链蛋白是无毒性的，这也是B链蛋白疫苗优于
基于A链蛋白或全毒素疫苗的优势。
本研究首先应用密码子优化软件Condonopt对
ATB进行基因优化，替换大肠杆菌稀有密码子为高
频密码子，并成功构建原核表达载体pQE80L-ATB，
重组蛋白以包涵体形式存在，且相对分子质量均约
为 30 000，采用Ni-NTA亲和层析柱纯化，蛋白纯度
均达97%以上。经免疫印迹实验验证，rATB可与相
应的抗天然AT兔多克隆抗体发生特异性反应，MTS
细胞毒性试验结果表明 rATB无毒性，这与文献报道
相一致[11]。
总之，本研究在大肠杆菌表达系统中获得 rATB
的高效表达，重组蛋白无毒性且保留了良好的抗原
性，为下一步研究相思子B链疫苗奠定了基础。
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（收稿日期：2015-04-20；修回日期：2015-10-22）
（编辑 汤玉瑜）
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