全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 22 食品科学 ※分析检测204
固定 pH法连续测定齿果酸模中的
总酸度和粗蛋白
朱盈蕊，高向阳 *，马紫英
(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)
摘 要：为建立一种连续测定齿果酸模中总酸度和粗蛋白含量的新型方法，利用超声波辅助 -中性甲醛提取酸性物
质，以KOH 溶液为标准溶液，用固定 pH 法滴定样液总酸度并除去过量甲醛后，加入浓硫酸消解完全，中和过
量硫酸后用甲醛将NH 4+转化为H+，以KOH标准溶液用固定 pH滴定法连续测定粗蛋白含量。结果表明：干基样
品总酸度(H+)为 0.9178mol/kg，相对标准偏差＜ 5%(n＝ 6)。干基样品粗蛋白含量为 15.30g/100g，相对标准偏差＜
3 %( n ＝ 6 )，与国标法对照，测定粗蛋白没有显著性差异。该法操作简单、快速、方便，试剂用量少，工作效
率大大提高，利于推广应用。
关键词：齿果酸模；固定 p H 法；总酸度；粗蛋白；连续测定
Continuous Determination of Total Acidity and Crude Protein of Rumex dentatus Whole Plant by Fixed pH Method
ZHU Ying-rui，GAO Xiang-yang*，MA Zi-ying
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)
Abstract ：A new fixed pH method for the continuous determination of total acidity and crude protein in Rumex dentatus whole
plant was established. The acids in samples were extracted by formaldehyde with the aid of ultrasound, and a fixed pH titration
method was used to determine the total acidity using KOH as a standard solution. After the determination of the total acidity,
the excessive formaldehyde in the sample solution was removed and then digested with concentrated sulfuric acid. The extra
sulfuric acid was neutralized and the NH4＋dissociated into H+ by formaldehyde. The crude protein was determined by fixed pH
titration method using KOH as the standard solution as well. The total acidity (H＋) of a dried sample was 0.9178 mol/kg with
a relative standard deviation less than 5% (n= 6), and the crude protein was 15.30 g/100 g with the relatively standard deviation
less than 3% (n = 6). These results indicated no obvious difference from those determined by the national standard method. In
conclusion, the method has been proven to has many advantages such as simplicity, rapidity, easy operation, low regent
consumption, short assay time, thus deserving to be popularized.
Key words：Rumex dentatua L.；fixed pH method； total acidity；crude protein；continuous determination
中图分类号：O657.92；TS201.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)22-0204-05
收稿日期：2011-06-22
基金项目：河南省重点学科建设项目(10466-X-082301)
作者简介：朱盈蕊(1986—)，女，硕士研究生，主要从事食品营养分析与食品新资源开发研究。E-mail：zhuyanan521@163.com
*通信作者：高向阳(1949—)，男，教授，大学，主要从事食品分析、食品新资源开发研究。E-mail：ndgaoxy@163.com
齿果酸模(Rumex dentatua L.)别名牛舌草、羊蹄大
黄、土大黄等[1]，为蓼科酸模属(Rumex L.)植物，主要
分布于我国华北、西北、华东、华中地区及四川、贵
州、云南省，尼泊尔等国也有生长[ 2 ]。齿果酸模喜阴
暗潮湿环境，性味酸、寒，有清热解毒、活血止血、
通便杀虫之功效，可用于各种炎症的治疗，其根叶亦
有抑菌和止血作用[3-4]。目前对齿果酸模药用价值研究较
多，而对其营养成分研究较少。
植物中酸性成分影响着植物的色、香、味、稳定
性和食用品质及加工储藏性能，齿果酸模中主要含没食
子酸、抗坏血酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、异香
草酸等常见有机酸[5]。测定总酸度对判断植物的成熟度
具有重要意义[6]，其测定方法主要有酸碱滴定法[7-8]、电
导滴定法[9]、原子吸收法[10 ]、顺序注射滴定法[11- 13]等。
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酸碱滴定法不能测定颜色较深、混浊度较大或含有铵根
离子等极弱酸的试液，而且由于植物样品的复杂性，常
常难以确定所含主要酸性组成的成分，计算结果时不易
确定酸的换算系数，较难反映植物中总酸的真实含量。
蛋白质是评价食物营养价值的重要指标[14]，常用凯氏定
氮法[15]、双缩脲法、紫外 -可见分光光度法[16]等进行测
定。凯氏定氮法操作繁杂，工作效率较低，且上述方
法均不能连续测定样品中总酸度和粗蛋白。本实验利用
超声波的强烈振动和空化效应[17]，加速样品中酸性物质
的溶出，加入甲醛将 NH4+转化为等物质的量的 H+，以
每千克样品中能被滴定的H+的物质的量进行计算。用固
定 pH法测定样品中的总酸度[18]后，再加入浓硫酸和催
化剂消解完全，样品中的氨基酸氮转化为 NH 4+，除去
过量硫酸后，用甲醛将 NH 4+转化为等物质的量的 H +，
用KOH标准溶液滴定至原来的 pH值，根据此期间消耗
KOH的物质的量计算样品中粗蛋白的含量。本实验方法
试液无需蒸馏、测定不受浑浊度等因素的干扰、操作
简便，可实现连续快速测定样品中两个指标，工作效
率大大提高，利于推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
齿果酸模(Rumex dentatua L.)采自郑州市东风渠旁，
由河南农业大学生命科学学院朱长山教授鉴定，叶苗呈
新鲜、润亮浅绿色。
pH8.20、pH5.00的甲醛溶液：使用前分别向两瓶
甲醛试剂中滴加KOH标准溶液，在离子分析仪上分别
调至 pH8.20、pH5.00，备用。催化剂：硫酸铜和硫酸
钾按等质量比例混合，于研钵中充分研磨后，移入广
口瓶中贮存，备用。所用试剂均为分析纯；水为石英
亚沸二次重蒸水。
101-2-S-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械
厂；SB-5200 DTD超声波清洗机(额定功率 200W) 宁波
新芝生物科技股份有限公司；H HS 型电热恒温水浴锅
天津市华北实验仪器有限公司；Kjeltec 2300自动定氮仪
丹麦 Foss公司；pH3-3c型离子分析仪 上海精密科学
仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 指标测定
齿果酸模依次用自来水、二次重蒸水洗净，晾
干，称取 3g左右(精确至 0.0001g)，研钵中研碎，用少
量重蒸水移至 100mL烧杯中，按 10:1(mL/g)液料比加重
蒸水和 2.00mL pH8.20的甲醛，超声 25min后，40℃水
浴 10min，在离子分析仪上用 0.05000mol/L KOH标准溶
液滴定至 pH8.20 [18]，记录消耗标准溶液的体积，并进
行平行和空白测定。称取样品的同时按GB 5009.3—2010
《食品中水分的测定方法》测定样品中水分的质量分数
ω[ 1 9 ]。按式(1)计算总酸度。
X＝ c×(V1－V2)÷mf×(1－ω) (1)
式中：X 为齿果酸模总酸度，即每千克齿果酸模
干基样品所样品消耗 KOH的物质的量 /(mol/kg)；c为
KOH标准溶液的物质的量浓度 /(mol/L)；V1、V2分别为
试液、空白溶液消耗KOH标准溶液的体积 /mL；m f为
称取样品质量 /g；ω为样品中水分质量分数 /%。
滴定至 pH8.20的试液在通风橱中于 75℃红外加热炉
上加热成糊状体，挥发除去剩余甲醛，用重蒸水移至
定氮仪消化管中，加 0.3g催化剂和 5mL浓 H2SO4，在
420℃消解 90min，冷却后移入 50mL容量瓶，用重蒸水
多次洗涤消化管，洗涤液移入容量瓶，用重蒸水稀释
至刻度，混匀后移取 20.00mL于 100mL小烧杯中，在离
子分析仪上逐滴加入KOH溶液至 pH5.00后，加入 pH5.00
甲醛溶液 15.00mL，混匀，用 0.05000mol/L KOH标准
溶液再逐滴滴至 pH5.00，记录消耗的体积，同时进行
全程空白实验，按式(2)计算干基样品中的粗蛋白质量
分数。

(V3－V4)× c× 0.01401× 50
ω1/(g/100g)＝—————————————×F×100 (2)

mf×(1－ω)×20
式中：ω 1为干基样品中粗蛋白质的质量分数/%；
V3、V4分别为样品和空白消解液消耗KOH标准溶液的
体积 /mL；c为KOH标准溶液浓度 /(mol/L)；0.01401为
1mmol KOH标准溶液相当于氮的质量 /g；mf为称取样品
的质量 /g；ω为样品中水分的质量分数 /%；F为氮换算
为样品中蛋白质的系数，即 6.25 [15 ]。
1.2.2 试验设计
单因素试验：按照 1.2.1节方法考察液料比、超声
处理时间、水浴放置时间、水浴温度、pH8.20甲醛加
入量对总酸度测定结果的影响。
正交试验：根据单因素试验结果，选择对总酸度
测定影响较大者进行三因素三水平正交试验，确定最佳
试验条件。
最终测定条件的确定：在以上试验基础上考察样品
消解条件、pH5.00甲醛加入量、样品处理方法，确定
最终测定条件。将所得最终测定条件与国标方法相比
较，考察所建立方法的可信度。
2 结果与分析
2.1 单因素试验条件的确定
2.1.1 液料比的选择
按 1.2.1节方法，分别以 5:1、10:1、15:1、20:1、
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25:1的液料比，加入 pH8.20的甲醛 3.00mL，常温超声
15min后，于 60℃中放置 10min测定总酸度。由图 1
可知，液料比为 10:1时总酸度达到最大值，测定结果
较好。
2.1.2 超声处理时间的选择
在常温、液料比为 10:1的条件下，加入 pH8.20的
甲醛 3.00mL，在超声额定功率为 200W时对样品分别处
理 5、1 0、1 5、20、2 5、3 0、4 0 mi n，6 0℃水浴放
置 10min后，按 1.2节方法测定总酸度。由图 2可知，
超声处理 20min时测定效果较为理想。
2.1.3 水浴放置时间的确定
为保证测定过程中试液温度和放置时间的一致，减
少测定误差，控制液料比为 10:1，加入 pH8.20的甲醛
3.00mL，在常温、超声额定功率 200W处理 20min后，
于 60℃水浴中分别放置 5、10、15、20、25min，按
1.2.1节方法测定总酸度。由图 3可知，在 60℃水浴中
放置 10min，测定结果较好。
2.1.4 水浴温度的影响
控制液料比为 10:1，加 pH8.20的甲醛 3.00mL，常
温超声 20min 后，分别在 20、40、60、80、97℃水
浴中放置 10min，按照 1.2.1节方法测定总酸度，以 3次
平行测定的平均值作图。由图 4 可知，测定前在 60℃
水浴中放置 10min，测定结果较好。
2.1.5 pH8.20甲醛加入量的影响
设定液料比为 10:1，分别加入 0.00、1.00、2.00、
2.50、3.00、3.50、4.00、5.00mL pH8.20的甲醛，在
常温、超声额定功率 200W超声 20min后，60℃水浴放
置 10min，按 1.2.1节方法各进行 3次平行测定，取平均
值作图。由图 5可知，甲醛体积为 2.00mL时总酸度测
定结果最大，说明样品中的弱酸转化较为完全，本实
验选择加入甲醛加入量为 2.00mL。
2.2 总酸度提取工艺条件正交试验
以上单因素试验发现，液料比、超声时间、水浴
温度对总酸度的测定影响较大。由此设计三因素三水平
正交试验，对试验条件进一步优化，因素和水平见表
1，正交试验结果见表 2。
图 1 液料比对总酸度的影响
Fig.1 Effect of solvent-to-solid ratio on the determination of
total acidity
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
总
酸
度
/(
m
ol
/k
g)
液料比(mL/g)
5:1 10:1 15:1 20:1 25:1
图 2 超声处理时间对总酸度的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the determination of total acidity
1.26
1.20
1.14
1.08
1.02
0.96
0.90
总
酸
度
/(
m
ol
/k
g)
超声时间 /min
5 10 15 20 25 30 35 40
图 3 水浴放置时间对总酸度的影响
Fig.3 Effect of heating time in 60 ℃ hot water bath on the
determination of total acidity
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
总
酸
度
/(
m
ol
/k
g)
水浴时间 /min
5 10 15 20 25
图 4 水浴温度对总酸度的影响
Fig.4 Effect of hot water bath temperature on the determination of
total acidity
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
总
酸
度
/(
m
ol
/k
g)
水浴温度 /℃
20 40 60 80 100
图 5 pH8.20甲醛加入量对总酸度的影响
Fig.5 Effect of amount of added formaldehyde (pH 8.20) on the
determination of total acidity
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
总
酸
度
/(
m
ol
/k
g)
甲醛体积 /mL
0 1 2 3 4 5
207※分析检测 食品科学 2011, Vol. 32, No. 22
水平
因素
A液料比(mL/g) B超声波处理时间 /min C水浴温度 /℃
1 5:1 15 40
2 10:1 20 60
3 15:1 25 80
表 1 总酸度提取工艺条件正交试验因素和水平
Table 1 Coded values and corresponding actual values of the process
conditions for total acid extraction used in orthogonal array design
试验号 A B C 总酸度 /(mol/kg)
1 1 1 1 0.9237
2 2 1 2 0.7159
3 3 1 3 0.7003
4 1 2 2 0.6209
5 2 2 3 1.0926
6 3 2 1 0.8722
7 1 3 3 1.1103
8 2 3 1 1.1190
9 3 3 2 0.7551
K1 2.6579 2.3429 2.9179
K2 2.9275 2.5857 2.0919
K3 2.3276 2.9844 2.9032
k1 0.8860 0.7810 0.9726
k2 0.9758 0.8619 0.6973
k3 0.7759 0.9948 0.9677
R 0.1999 0.2138 0.2753
表 2 总酸度提取工艺条件正交试验设计及结果
Table 2 Orthogonal array design layout, experimental results and
range analysis
由表 2极差分析可以看出，影响总酸度测定结果的
因素依次为水浴提取温度、超声处理时间、液料比。
比较 k 值大小可以看出，酸性物质提取的优化条件为
A2B3C 1，即液料比为 10:1、超声处理时间 25min、水浴
温度 4 0℃。
2.3 最终测定条件的确定
2.3.1 样品消解条件的确定
实验结果表明，在 420℃定氮仪消化管中对样品消解
90min，消解液呈无色或淡黄色透明液体，消解效果理想。
2.3.2 pH5.00甲醛加入量的确定
按 1.2节方法分别向 20.00mL消解液中加入 3.00、
5.00、10.00、15.00、20.00mL pH5.00的甲醛转化样品
后，按 1.2.1节方法测定粗蛋白，同时进行 3次平行测
定，取平均值作图。由图 6可知，加入甲醛 15.00mL时，
粗蛋白的测定结果最大且稳定，本实验选择 pH5.00甲醛
加入量为 15.00mL。
2.3.3 样品处理方法的确定
齿果酸模用自来水和重蒸水充分清洗，于洁净处自
然风干，放入 60℃恒温箱中干燥至质量恒定，用植物
粉碎机磨成粉末，置于干燥器中，备用。取 0.5g(精确
至 0.0001g)按 1.2.1节方法测定干样中总酸度和粗蛋白。
齿果酸模鲜样按照 1.2.1节方法测定，6次平行测定的均
值结果见表 3。
齿果酸模样品
总酸度 粗蛋白
含量 /(mol/kg) RSD/% 含量 /(g/100g) RSD/%
鲜样 0.9178 4.7 15.30 2.3
干样 0.5779 3.8 5.22 2.9
表 3 鲜样和干样齿果酸模中总酸度和粗蛋白测定结果 (n=6)
Table 3 Total acidity and crude protein contents in fresh and dry
samples of Rumex dentatus whole plant (n=6)
注：测定结果以干基计。下同。
齿果酸模鲜样与干样的对照测定结果表明，总酸度
与样品的新鲜程度和处理方法有关，样品烘干粉碎后测
定其总酸度大大降低，而蛋白质含量变化不大，干燥
粉碎过程对蛋白质影响较小。从营养角度综合考虑，齿
果酸模新鲜食用较好。
2.4 对照测定
按照 1.2.1节方法中固定 pH法与国标法对照测定齿
果酸模鲜样中的总酸度，各进行 6次平行测定，将平均
值换算成干基含量，结果见表 4。
固定 pH法 国标法
F值 t值
含量 /(mol/kg) 标准偏差 S 含量 /(mol/kg) 标准偏差 S
0.9178 0.024 0.7213 0.052 4.71 8.40
表 4 固定 pH 法与国标法测定齿果酸模鲜样总酸度的结果 (n=6)
Table 4 Comparison of total acidity results determined by the fixed
pH method and the national standard B method (n=6)
在置信度为 95%时对测定结果进行F检验和 t检验，
结果表明固定pH法与国标法测定的偶然误差无显著性差
异，置信度为 9 5%。但存在系统误差，固定 pH 法测
定结果明显高于国标法，表明国标法不能直接测定样品
中Ka值小于 10-7的有机弱酸部分，在固定 pH法中得到
图 6 pH5.00甲醛加入量对粗蛋白测定结果的影响
Fig.6 Effect of amount of added formaldehyde (pH 5.00) on the
determination of crude protein
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
粗
蛋
白
量
/g
/1
00
g)
甲醛体积 /mL
0 5 10 15 20
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令人满意的测定，总酸度含量更加符合客观实际。
按照 1.2.1节方法中固定 pH法与国标法对同一齿果
酸模鲜样品中的粗蛋白分别进行 6次平行测定，按干基
计算，检验无可疑值后，取平均值报告，结果见表 5。
固定 pH法 国标法
F值 t值
含量 /(g/100g) 标准偏差 S 含量 /(g/100g) 标准偏差 S
15.22 0.43 14.84 0.20 4.62 2.17
表 5 固定 pH 法与国标法测定齿果酸模鲜样粗蛋白的结果 (n=6)
Table 5 Comparison of crude protein results determined by the fixed
pH method and the national standard method (n=6)
在置信度为 95%时对测定结果进行 F检验和 t检
验，结果表明固定 pH 法与国标法测定结果之间无显
著性差异。
3 结 论
超声波辅助 -甲醛提取法可以克服国标法测定食品
总酸度时不能测定极弱酸性物质的不足，本实验依据酸
碱反应的实质，以每千克样品中可滴定的H+的物质的量
计算总酸度，使被测样品有了更加合理的、便于相互
比较的统一计算方法，能真实地反映样品中客观存在的
总酸度，更加符合实际。总酸度与样品的新鲜程度和
处理方法有关，样品烘干粉碎后测定，其总酸度大大
降低，从营养角度综合考虑，齿果酸模新鲜食用较好。
固定 pH 法测定粗蛋白无需蒸馏和使用指示剂，样品消
解、转换后直接滴定，不受试液颜色、浑浊度的影响，
一次称样能连续测定同一样品中的两项营养指标，操作
方便，省时省力，为食品样品总酸度和粗蛋白的连续
测定提供了一种简便快速的分析方法，有一定的推广应
用价值。
参 考 文 献 ：
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