全 文 ：[收稿日期 ] 　2009-03-16
[基金项目 ] 　质检行业公益项目(2007GYJ023);国家质检总局
科技攻关项目(2006IK165);军队专题(06Z069)
[作者简介 ] 　聂　聪(1981-),女 ,吉林省长春市人 ,长春理工
大学硕士研究生, 生物医学工程专业 , 主要从事
生物毒素的相关研究。
＊通讯联系人 ,王　静 , E-mail:wangjing01155@ 126.com;王景
林 , E-mail:wangjl6481@hotmail.com
胶体金免疫层析技术快速定量检测相思子毒素
聂　聪2 , 王　静 1＊ ,孙肖红 1 ,高　姗2 ,于源华 1 , 康　琳2 ,王景林 2＊
(1.中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所 ,北京　100123;2.军事医学科学院微生物流行病研
究所病原微生物生物安全国家重点实验室 ,北京　100071)
[摘要 ] 　目的:建立胶体金免疫层析技术快速定量检测相思子毒素。方法:利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层
析技术 ,建立相思子毒素的快速检测方法 ,评价其特异性和敏感性 , 并拟合检测曲线进行定量检测。在面粉 、饼干 、
奶粉 、苹果汁 、牛奶 、果冻等食品样品中添加相思子毒素模拟污染样品 , 评价该方法对固体 、半固体 、液体等食品样
品的检测能力。结果与结论:该法可在 15 min内完成定性和半定量检测 , 灵敏度为 30 ng/ml, 线性范围 30 ～ 600
ng/ml、回收率 80% ～ 110%, 变异系数小于 15%。所建立的检测相思子毒素的胶体金免疫层析方法 , 能快速 、灵敏 、
特异 、准确地检测样品中的相思子毒素 ,并可实现定量 , 适用于现场快速检测。
[关键词 ] 　相思子毒素;胶体金;免疫层析;定量检测
[中图分类号 ] 　R446.6 [文献标识码 ] 　A
[文章编号 ] 　1000-5501(2009)06-0546-04
Rapidandquantitativedetectionofabrinusingcoloidgoldimmunochromatographic
assay
NIECong2 , WANGJing1＊ , SUNXiao-Hong1 , GAOShan2 , YUYuan-Hua1 , KANGLin2 , WANGJing-Lin2＊
(1.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine, Beijing100123, China;2.StateKeyLaboratoryofPathogenandBiose-
curity, InstituteofMicrobiologyandEpidemiology, AcademyofMilitaryMedicalSciences, Beijing100071, China)
[ Abstract] 　Objective:Todeveloparapidandquantitativedetectionmethodforabrinusingcoloidgoldimmunochroma-
tographicassay.Methods:Therapiddetectionmethodwasestablishedwithdouble-antibodysandwichassay.Quantification
wasrealizedbyconstructingastandardcurve.Thespecificityandsensitivityofthemethodweretested, anditsfeasibility
wasevaluatedbyvariousabrin-addedfoodsamples.ResultsandConclusion:Thisestablishedmethodcouldaccomplish
qualitativeandsemi-quantitativedetectionin15 minutes;thesensitivitywasupto30ng/mlwithalinearrangefrom30ng/
mlto600ng/ml.Therecoveryratewas80%-110%, andthevariationcoefficientwaslessthan15%.Thecolloidalgold
immunochromatographicassayisrapid, specific, sensitive, accurateandsuitableforfielddetection.
[ Keywords] 　abrin;colloidgold;immunochromatographicassay;quantitativedetection
　　相思子毒素(abrin)是从豆科藤本植物相思子(Abrus
precatorius)的种子中提取的一种剧毒高分子蛋白毒素 , 其含
量占种子的 2.8% ～ 3.0%。小鼠的 LD50为 0.04 μg/kg, 成
年人的致死剂量为 5.0 ～ 7.0 μg/kg, 已被列为潜在的重要毒
素战剂和生物恐怖病原物质之一 [ 1, 2] 。对该毒素的检测只
能依赖于抗原 、抗体特异反应的免疫学方法 [ 3] ,如双抗体夹
心 ELISA法 [ 4 ～ 7] 。由于 ELISA需要多次孵育 , 检测时间较
长 ,不适宜现场检测。胶体金免疫层析技术具有简单 、快速 、
灵敏 、可现场操作等优点 , 已被广泛应用于鼠疫 、禽流感 、嗜
肺军团菌等的检测 [ 8 ～ 11] , 但尚无研制相思子毒素检测试纸
条的报道。目前国内 ELISA检测法以脱毒的天然相思子毒
素为抗原制备抗体 [ 12, 13] ,从生物安全角度考虑 , 此方法不适
合大量制备抗体。本研究利用双抗体夹心法 , 研制相思子毒
素胶体金免疫层析试纸条 ,并结合金标分析仪实现了相思子
毒素的快速定量检测 [ 14 , 15] , 可满足应对生物恐怖现场快速
检测的需要。
1　材料和方法
1.1　抗原及抗体
纯化的天然相思子毒素 , 以亲和层析方法纯化的兔 、鼠
抗重组相思子 A链多克隆抗体等 , 均为本室制备。
1.2　层析测试条耗材
结合垫 (玻璃纤维)、硝酸纤维素膜 (NC膜 , SHF
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军事医学科学院院刊　 2009年 12月 第 33卷第 6期
BullAcadMilMedSci, Dec2009;　 Vol33　No6　
1350225)、样品垫及吸水垫 、滤纸购自 Minipore公司。
1.3　实验仪器
金标分析仪(中国科学院上海光学精密机械研究所 、中
国检验检疫科学研究院联合研制)。
1.4　胶体金免疫层析试纸条的制备
1.4.1　样品垫制备　采用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液对
玻璃纤维素膜进行预处理。
1.4.2　胶体金结合垫　采用柠檬酸钠法制备 25 nm的胶体
金颗粒 [ 16] 。将制备好的胶体金以 0.1mol/LK2CO3调节 pH
值至 8.0～ 8.5后 ,标记鼠抗重组相思子毒素 A链抗体 ,标记
量为 1ml胶体金标记 12 μg抗体 , 37℃干燥 2 h。
1.4.3　硝酸纤维素膜　检测带:兔抗重组相思子毒素 A链
多克隆抗体 1 mg/ml, 1 μl/cm;质控带:羊抗鼠 1 mg/ml, 1
μl/cm, 37℃干燥 1.5 h[ 8～ 11] 。
1.4.4　组装　将样品垫 、结合垫 、吸水垫依次贴在底衬卡
上 ,切成宽度为 0.4 cm的条 , 装壳 , 保持干燥 , 室温贮存备
用 [ 8 ～ 11] 。
1.5　样品实用性检测
用样品处理液(5 mmol/LPBS, pH 7.4)将动物血清 、牛
奶等黏稠液体样品进行 1∶20稀释 , 橙汁 、苹果汁等液体样
品 1∶4稀释;饼干等固体食品按 1/100(W/V)加入样品处理
液溶解 ,静止取上清;果冻等半固体食品按 40/100(W/V)加
入样品处理液溶解 ,静止取上清。分别添加不同剂量的天然
相思子毒素作为模拟检测样品。
1.6　检测结果的判读
1.6.1　定性检测　将处理后的样品和样品处理液(作为阴
性样品)100μl加到制备好的层析条样品垫端 , 静置 15 min,
观察结果。检测带和质控带均出现红色判为阳性 ,仅质控带
出现红色为阴性 , 检测带和质控带均不显色 , 则为试纸条失
效。
1.6.2　定量检测
1.6.2.1　判定值(CUT-OFF)的确定　按 1.6.1将阴性样品
检测 20次 ,用金标分析仪扫描读取信号 T/C比值 。 20个样
品 T/C比值的平均值与 3倍标准差之和为 CUT-OFF值。
1.6.2.2　定量检测判定　将显色后的金标条放入金标分析
仪扫描 , 读取信号 T/C比值 , 大于判定值为阳性。
1.6.2.3　定量检测重复性　按 1.6.1检测 6个浓度的天然
相思子毒素样品 , 每个浓度检测 10次 , 并且用金标分析仪扫
描读取信号 T/C比值。每个浓度样品 10次检测的 T/C值
的标准差与平均值的比值即为变异系数。
2　结果
2.1　方法优化
观察不同 pH值 、盐离子浓度 、缓冲液 、检测时间 、牛血
清白蛋白(BSA)量 、样品加样量 、胶体金颗粒加样饱和量 、样
品垫采用不同表面活性剂及浓度处理条件对结果的影响 , 以
确定最佳反应条件。
2.2　直观检测灵敏度评价
按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条 , 检
测不同浓度的天然相思子毒素。将天然相思子毒素用样品
处理液稀释成 15, 30, 60, 120, 600, 1 200, 3 000, 6 000 ng/ml。
如图 1所示 , 120, 600, 1 200, 3 000, 6 000 ng/ml为强阳性反
应;30, 60 ng/ml为弱阳性反应;15 ng/ml无阳性反应;即肉
眼可观察到的最低浓度为 30 ng/ml。
图 1　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条的检测敏感性
1.阴性对照;2～ 9.相思子毒素浓度 6 000, 3 000, 1 200, 600, 120, 60, 30, 15ng/ml
2.3　特异性试验
按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条 , 分
别检测浓度为 50, 100, 500 ng/ml的蓖麻毒素 、蓖麻凝集素、肉
毒毒素 、葡萄球菌肠毒素、BSA溶液 ,检测结果均无阳性反应。
2.4　样品实用性检测
将天然相思子毒素添加到动物血清 、牛奶 、橙汁 、苹果
汁 、饼干 、果冻 、奶粉中 , 使终浓度为 30, 120, 600 ng/ml作为
模拟样品。检测结果为:120 ng/ml, 600 ng/ml均为阳性反
应 ,最低检测线均为 30 ng/ml。如图 2所示 , 动物血清模拟
样品检测 , 120ng/ml, 600 ng/ml为强阳性反应;30 ng/ml为
弱阳性反应;即肉眼可观察到的最低浓度为 30 ng/ml。
图 2　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条检测动物血清模拟样品
1.阴性对照;2～ 4.动物血清模拟样品浓度 600, 120, 30ng/ml
547　第 6期　　　　　　　　　　　　　　　聂　聪 ,等.胶体金免疫层析技术快速定量检测相思子毒素
2.5　定量检测结果
2.5.1　结果判定　检测不同浓度天然相思子毒素 , 每个浓
度检测两次 , 取两次 T/C比值的平均值。经过计算判定值
(CUT-OFF)为 0.043, 浓度为 7.5 ng/ml、 15 ng/ml的天然相
思子毒素的平均 T/C比值均为 -0.03, 低于 0.043, 为阴性;
30 ～ 6 000 ng/ml的天然相思子毒素的平均 T/C比值分别为
0.05, 0.05, 0.09, 0.15, 0.27, 0.54, 0.55, 0.60, 高于
0.043的结果为阳性;当天然相思子毒素浓度大于 30 ng/ml
时 , T/C比值平均值大于 0.043, 故检测灵敏度为 30 ng/ml。
检测结果见表 1。
2.5.2　标准曲线拟合　以天然相思子毒素的浓度为横坐标
(X),金标分析仪读值 T/C比值(Y)为纵坐标作图 , 建立胶
体金检测标准曲线。当天然相思子毒素浓度为 30 ～ 600 ng/
ml时 ,毒素的浓度与其金标分析仪读值 T/C比值之间呈良
好的线性关系 (图 3), 线性回归方程为 Y=0.0009X+
0.021, R2为 0.9993。
表 1　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条各浓度检测结果
相思子毒素浓度
(ρB/ng· ml-1)
检测值T(V)
T1 T2
质控值 C(V)
C1 C2
T/C值
T/C1 T/C2 T/C平
结果
　　0 0.004 0　　 0.531 0.514 0 0 0 -
　　7.5 0.018 0.012 0.476 0.430 -0.03 -0.03 -0.03 -
　　15 0.014 0.014 0.554 0.380 -0.02 -0.03 -0.03 -
　　30 0.025 0.026 0.523 0.522 0.05 0.05 0.05 +
　　37.5 0.019 0.022 0.476 0.430 0.04 0.05 0.05 +
　　75 0.046 0.049 0.479 0.516 0.09 0.09 0.09 +
　　150 0.090 0.085 0.550 0.551 0.16 0.14 0.15 +
　　300 0.163 0.164 0.615 0.571 0.26 0.28 0.27 +
　　600 0.325 0.284 0.597 0.523 0.54 0.54 0.54 +
　　 1200 0.332 0.327 0.606 0.584 0.54 0.56 0.55 +
　　 6000 0.335 0.357 0.561 0.588 0.59 0.60 0.60 +
图 3　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条检测系统拟合工
作曲线
X.天然相思子毒素浓度;Y.各浓度下金标分析仪读值 T/
C比值
2.5.3　回收率　在线性检测范围内 , 检测已知浓度的天然
相思子毒素 ,根据金标分析仪读值 T/C比值和标准曲线计算
出检测浓度 ,检测浓度与理论浓度的比值百分率为回收率。
由表 2可见 ,检测理论浓度为 30, 60, 120, 300, 600 ng/ml
的天然相思子毒素时 ,其回收率在 92.2% ～ 115%之间。
表 2　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条检测系统回收率
金标分析仪
T/C值
检测浓度
(ρB/ng· ml-1)
理论浓度
(ρB/ng· ml-1)
回收率
(%)
0.05 32.22 30 　 107
0.09 76.67 60 　 128
0.15 143.33 120 　 119
0.27 276.67 300 　 92.2
0.54 576.67 600 　 115
2.5.4　重复性　重复检测浓度为 30, 60, 120, 300, 600
ng/ml的天然相思子毒素 , 每个浓度检测 10次 , 变异系数介
于 0.8% ～ 11%(表 3)。
表 3　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条检测系统的变异系数
(n=10)
浓度(ρB/ng· ml-1) 金标分析仪 T/C值 变异系数(%)
30 0.046±0.005164 11
60 0.086±0.005164 6
120 0.145±0.00527 3.6
300 0.266±0.006992 2.6
600 0.538±0.004216 0.8
2.6　稳定性试验
将新制备的胶体金免疫层析试纸条于 37℃存放 8 d, 分
别用 120, 60, 30 ng/ml天然相思子毒素及 120, 60, 30 ng/
ml天然蓖麻毒素 、天然蓖麻凝集素进行检测 , 结果显示检测
120, 60, 30ng/ml的天然相思子毒素均为阳性反应 ,检测灵
敏度为 30 ng/ml;检测 120, 60, 30 ng/ml天然蓖麻毒素 、天
然蓖麻凝集素均为阴性反应(图 4)。与新制备的检测试纸
条相比 ,灵敏度没有明显下降 ,且特异性良好。
3　讨论
相思子毒素与蓖麻毒素已被列为重要的生物恐怖剂 , 建
立快速 、敏感的检测相思子毒素的方法是应对生物恐怖的有
效措施之一。本研究建立了相思子毒素胶体金免疫层析试
纸条 ,能在 15min内检测到样品中的天然相思子毒素 , 灵敏
度为 30 ng/ml。
548 军事医学科学院院刊　 2009年 12月 第 33卷第 6期　
　　　图 4　相思子毒素胶体金免疫层析试纸条稳定性检测
1.阴性对照;2 ～ 4.相思子毒素浓度 120, 60, 30ng/ml
　　本研究利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术 , 研
制了相思子毒素胶体金免疫层析试纸条 , 为降低由于使用多
克隆抗体标记和捕获导致的非特异性吸附 ,对检测体系和方
法进行了优化。首先将反应系统中的钾离子去除 , 实验发现
钾离子容易导致非特异吸附;然后将样品结合垫采用分散剂
和封闭剂进行预处理 , 确定了最佳反应条件 , 保证了检测方
法的敏感性和特异性。 成年人相思子毒素的致死剂量为
5.0 ～ 7.0 μg/kg,本研究制备的相思子毒素胶体金免疫层析
试纸条定性检测相思子毒素灵敏度达到 30 ng/ml, 已达到临
床检测范围 [ 1 , 2] ,敏感性与 ELISA法相近 [ 4～ 7] 。在模拟样品
检测中 ,检测固体 、液体 、半固体样品中天然相思子毒素的灵
敏度达到 30 ng/ml,可用于不同状态可疑样品的快速检测;
制备的胶体金免疫层析试纸条在 37℃放置 8 d后检测发现
试纸条的检测敏感性没有下降 , 显示了良好的稳定性 , 相当
于 4℃存放 12个月的效果;与蓖麻毒素等相似毒素没有交叉
反应 , 特异性良好。
利用金标分析仪建立了胶体金免疫层析法定量检测相
思子毒素的工作拟合曲线 , 在线性范围内(R2为 0.9993;线性
范围 30 ～ 600 ng/ml)可以进行定量检测。经检测发现 , 该方
法回收率高(80% ～ 110%), 重复性良好;变异系数小于
15%,准确性较好。双抗体夹心 ELISA进行定量检测时存在
检测时间较长的缺点 [ 4 ～ 7] ,而本方法可以在 15 min内完成一
定范围内的定量检测 ,时间缩短 3 ～ 4 h, 同时在准确性 、重复
性 、稳定性方面均可以与 ELISA相媲美 。此外 , 经过检测系
统的优化 ,克服了胶体金免疫层析法在检测血清 、食品 、饮料
等样品时出现爬样困难及假阳性的现象。
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(本文编辑　杨兆弘)
549　第 6期　　　　　　　　　　　　　　　聂　聪 ,等.胶体金免疫层析技术快速定量检测相思子毒素