全 文 ：第25卷第2期
2016年2月
武警后勤学院学报（医学版）
Journal of Logistics University of PAP（Medical Sciences）
vol.25 No.2
Feb. 2016
重组相思子毒素B链蛋白免疫原性研究
王俊虹1，2，魏茂提1，2，徐忠伟3（1.武警后勤学院部队流行病学和统计学教研室，天津 300309；2.天津市职业与环境危
害防治重点实验室，天津 300309；3.武警后勤学院中心实验室，天津 300309）
摘 要：【目的】评价重组相思子毒素B链蛋白（rATB）作为相思子毒素疫苗的免疫原性。【方法】以rATB为免疫原，采用2×2×
2×3析因设计方式分别免疫雌性Balb/C小鼠，主因素包括：重组蛋白的剂量、免疫方式、免疫周期、攻毒剂量。每次采用间接
ELISA方法检测小鼠血清中IgG，并进行天然毒素攻毒实验。体外中和实验依据上述所选的免疫方案进行，分析免疫保护效
果。【结果】间接ELISA结果表明rATB蛋白免疫小鼠后血清中能检测到相应的抗AT特异性抗体，IgG的效价均可达到1:106以
上，PBS对照组则没有抗体产生（P<0.05）；小鼠攻毒保护实验和体外中和实验结果说明，腹腔注射rATB在25 μ g/只的蛋白免
疫剂量下，免疫周期为0-14-28-42 d，可以抵抗最高剂量为5×LD50的天然AT毒素中毒，保护率为100%。【结论】rATB蛋白免
疫小鼠后显示出良好的免疫原性，为相关疫苗研究奠定基础。
关键词：相思子毒素；B链；免疫原性；疫苗；生物恐怖
【文章编号】2095-3720(2016)02-0093-04 【中图分类号】R967 【文献标志码】A
Study on immunogenicity of recombinant abrin toxin B chain protein
WANG Jun-hong, WEI Mao-ti, XU Zhong-wei（Military Epidemiology and Statistics Section, Logistics University of PAP,
Tianjin 300309, China)
Abstract:【Objective】To evaluate the immunogenicity of the recombinant abrin toxin B chain protein (rATB) as a vaccine.【Methods】
By 2×2×2×3 factorial design, female Balb/C mice were immunized by the immunogen of rATB. The main factors included the dose of
rATB, route of immunization injection, immunization interval and dose of native toxin challenge. The indirect enzyme-linked immuno-
sorbent assay (ELISA) was used to measure the serum antibody titer of IgG in mice. The native toxin challenge experiment was carried
out. The in vitro neutralization assay was done according to the above scheme. And the efficacy of passive protection was analyzed.【Re-
sults】The results of indirect ELISA showed that the anti-rATB antibody could be detected in the sera of mice immunized by rATB. The
titers of IgG reached 1:106 or more. In contrast, the antibody response was not found in PBS-vaccinated mice (P<0.05). The results of
challenge trials with native AT and in vitro neutralization assay confirmed that the rATB administered by intraperitoneal injection with
25 μ g per mouse could elicit a stronger immune response and protect the mice from a dose of native AT toxin up to 5×LD50 in the im-
munization interval of 0-14-28-42 d. Besides, the protection rate was 100%.【Conclusion】The rATB can trigger a good immune re-
sponse and protective efficacy in mice, and it may be a promising vaccine candidate against human exposure to abrin toxin.
Key words: Abrin toxin; B chain; Immunogenicity; Vaccine; Bioterrorism
相思子毒素（abrin toxin，AT）来源于植物相思子
（Abrus precatorius），与蓖麻毒素（ricin toxin，RT）同
属于Ⅱ型核糖体失活蛋白（ribosome- inactivating
proteins，RIP），其分子量约为65 kd［1，2］。AT由两条
多肽链以二硫键相连，A链（ATA）为毒性链，通过使
核糖体失活而抑制蛋白质合成，B链（ATB）是结合
链，介导A链进入细胞内发挥毒性作用［2］。AT的毒
性非常强，是 RT 的 75 倍，即小鼠腹腔 LD50约为
0.04 μ g/kg[3]。由于AT具有获得容易、毒性强、提取
[基金项目]军事预防医学“211”三期项目；武警后勤学院博士启动
金项目（WHB201508）
[收稿日期]2015-10-11; [修回日期]2015-12-28
[作者简介]王俊虹，博士，讲师，主要从事生物战剂的侦检与防治。
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论 著
93
DOI:10.16548/j.2095-3720.2016.02.003
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技术简单等特点，作为重要的毒素型生物恐怖剂，
易成为恐怖分子的优先选择，因此发展有效的防治
手段已成为各国生防领域的重要研究任务。目前
关于AT的中毒预防措施主要包括中毒前的疫苗接
种[1，4，5]、中毒后的抗体救治[3]以及选择性小分子抑制
剂（Retro-2）[6]。其中，中和性抗体只能产生短期的
被动免疫保护效果，Retro-2则通过逆转毒素（AT和
RT）在人体内的运输，从而影响宿主细胞和毒素的
相互作用。作为被美国疾病控制中心定义为B级的
生物威胁剂，AT的防治研究重点主要集中在疫苗研
制，相关的生防疫苗较少，包括类毒素和基于A链蛋
白的疫苗。由于甲醛化的AT类毒素仍有毒性而限
制了在人体的使用[3]。基于A链蛋白的疫苗是指利
用毒性A链进行定点突变，获得突变体，降低毒性的
同时保留了抗原性和免疫原性[1，4]，该类疫苗的使用
也受限于毒性问题。同时，文献报道B链亚单位同
样具有很好的免疫原性[3，7，8]，而且其他相关报道显
示作为AT的候选疫苗，B链亚单位具有独特的优
势。首先，如破伤风、霍乱贺毒素、白喉等其他的A-
B家族毒素已经采用其各自的B亚单位制备疫苗并
被证明是有效的；其次，ATB能特异性的结合到M
细胞表面而有佐剂活性；最后，相思子毒素的B链是
无毒的，因此作为疫苗应用于人体就不存在毒性的
问题。本研究旨在利用本室制备的重组蛋白rATB
（E. coli M15/pQE80L-ATB诱导表达），根据重组蛋
白进入机体的途径、剂量、次数、免疫间隔时间免疫
小鼠，评价免疫效果，为相关疫苗研究提供基础。
1 资料和方法
1.1 一般资料
1.1.1 重组蛋白和天然毒素 含有目的基因的表达
菌株E. coli M15/pQE80L-ATB、重组蛋白和天然AT
均由我室制备。
1.1.2 主要试剂 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊
抗鼠IgG、ELISA用显色液均购自北京天根生物公
司；其它化学试剂为国产分析纯。
1.1.3 实验动物 购于军事医学科学院实验动物中
心的雌性Balb/C小鼠，体质量约18~20 g，6~8周龄，
动物质量合格证号：SCXK-(军)2014-005。
1.2 方 法
1.2.1 实验动物分组 Balb/C小鼠随机分为24组，每
组5只，采用2×2×2×3析因设计，主因素包括：重
组蛋白rATB的剂量（15、25 μ g/只）、免疫方式（腹腔
注射、皮下多点注射）、免疫周期（周期Ⅰ为0-7-14-
21 d，周期Ⅱ为0-14-28-42 d）、攻毒剂量（2×、5×、
6×LD50）。
1.2.2 免疫方案 将PBS稀释的rATB溶液每只小鼠
注射体积100 μ l，注射部位分别为小鼠腹腔或皮下
多点，如表1。
表1 rATB免疫实验动物的免疫方案
AT 剂量
2×LD50
5×LD50
6×LD50
免疫效果
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
腹腔注射
15 mg
Group 1
Group 2
Group 3
Group 4
Group 5
Group 6
25 mg
Group 7
Group 8
Group 9
Group 10
Group 11
Group 12
皮下多点注射
15 mg
Group 13
Group 14
Group 15
Group 16
Group 17
Group 18
25 mg
Group 19
Group 20
Group 21
Group 22
Group 23
Group 24
1.2.3 血清抗原特异性IgG检测 每次免疫1周，攻毒
后1周尾静脉取血，室温留取血清备用。采用间接
ELISA法分析血清IgG，具体操作方法：（1）将定量后
的rATB蛋白用包被液稀释至5 μ g/ml，100 μ l/孔，
4℃包被过夜。（2）弃包被液后洗涤液洗板 3次，
3 min/次，加3%BSA封闭液，37℃封闭1 h。（3）洗板
3次，加入待用血清（PBS按照 1:10，1:102，1:103，1:
104，1:105，1:106，1:107，1:108稀释），37℃温育1 h。（4）
PBST洗板3次，分别加入预先用PBS按1:5 000稀释
的二抗（HRP标记羊抗鼠IgG），并在37℃条件下温
育1 h。（5）分别加入显色液A、B各50 μ l后显色，终
止液用2 mol/L H2SO4。（6）酶标仪读取A450的吸光度。
1.2.4 小鼠攻毒保护试验 小鼠血清IgG抗体效价在
四免以后均可达1:106以上。各组按表进行小鼠攻
毒保护试验，即分别注入含2×LD50，5×LD50，6×
LD50剂量的天然AT。此外，5只小鼠组成PBS免疫
组，注入含2×LD50天然毒素。每天观察小鼠体质量
变化和死亡情况，共10 d。
1.2.5 重组蛋白免疫小鼠血清的体外中和实验 根
据 1.2.4 结果，选取 rATB免疫小鼠的免疫方案为
group 10，即腹腔注射、重组蛋白剂量25 μ g/只、免疫
周期为0-14-28-42 d。收集免疫方案group10的小
鼠血清。同样大小的Balb/C小鼠20只，分为4组，每
组5只小鼠。将本室纯化天然AT配制成10 μ g/ml
（LD50=2.58 μ g/kg），实施体外中和试验。（1）第1组
（2 倍 LD50）：1 250 μ l 免疫鼠血清+10 μ l 原液＋
1 240 μ l PBS溶液混合，37℃温育30 min，腹腔注射
500 μ l/只。（2）第2组（5倍LD50）：1 250 μ l免疫鼠血
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清+26 μ l原液＋1 224 μ l PBS溶液混合。（3）第3组
（6倍LD50）：1 250 μ l免疫鼠血清+30 μ l原液＋1220
μ l PBS溶液混合。（4）对照组（2倍LD50）：1 250 μ l免
疫鼠血清+10 μ l原液＋1 240 μ l PBS溶液混合。
1.2.6 统计学分析 采用2×2×2×3析因设计进行
免疫原性评价。数据经SPSS和Graphpad软件进行
统计。计量资料采用（x±s）表示，采用方差分析和t
检验分析。计数资料采用Cochran-Mantel-Haenszel
进行统计分析。
2 结 果
2.1 间接ELISA法检测IgG
重组蛋白按2×2×2×3析因设计的免疫方案
免疫Balb/C小鼠，四免后血清IgG效价达到1:106，攻
毒后产生了2次免疫应答（表2）。
2.2 小鼠攻毒保护实验
2×LD50，5×LD50剂量天然毒素攻毒组各组小
鼠存活率为100%，小鼠体质量在攻毒后有所减轻，
10 d内逐渐恢复正常；6×LD50天然毒素攻毒组小鼠
生存率为40%~60%。经统计学分析，免疫剂量、注
射方式、免疫周期对小鼠免疫保护无差异（P>0.05），
攻毒剂量有统计学意义（P<0.05）。综合以上结果，
选择免疫方案为rATB用量为25 μ g/只，免疫方式
为4次腹腔注射免疫，免疫周期为0-14-28-42 d；可
以保护小鼠的最大攻毒剂量为5×LD50。对照组
2×LD50剂量天然毒素攻毒后，小鼠体质量明显减
轻，并全部死亡（数据未显示）。见表3。
表3 体内攻毒实验小鼠存活情况和体质量变化（x±s）
表2 不同时期血清中IgG抗体效价水平
2.3 小鼠体外中和实验
如表4所示：2×LD50和 5×LD50剂量组存活率
100%；6×LD50 剂量组小鼠死亡 3 只（生存率为
40%）。作为对照组，2×LD50攻毒剂量下小鼠均全
部死亡。
表4 免疫血清体外中和实验小鼠存活情况
组 别
体外中和组
对照组
指 标
存活/总数
体质量(g)
存活/总数
体质量(g)
攻毒剂量
2×LD50
5/5
21.54±0.76
0/5
-
5×LD50
5/5
20.99±0.93
-
-
6×LD50
5/5
17.86±0.99
-
-
3 讨 论
相思子毒素是高分子植物蛋白毒素，毒性是普
通化学武器的几百倍[1，2]，作为重要的致死性生物毒
素战剂，开展针对AT的预防性疫苗用于保障国家
和军队应对生物恐怖的能力，具有十分重要意义。
目前关于AT相关的生防疫苗研制较少。其中，
类毒素是将天然毒素经甲醛化处理后可以保护免
疫动物的致死剂量毒素中毒[3]，由于具有一定毒性
而未有进一步的发展。2011年，Han等采用定点突
变技术获得ATA突变体（mABRAE164AR167 L），能
抵抗10×LD50剂量的天然毒素攻毒，显示出良好的
免疫原性[1]。同年，韩艳辉等将RTA突变体（mRI-
CAD75AV76MY80A）和 ATA 突变体（mABRAE164
AR167L）相连，成功表达获得二价候选疫苗mRICA/
mABRA，该疫苗能抵抗6×LD50剂量的天然AT和
RT混合物攻毒[4]。2014年Zhang T等利用ATA的截
断片段免疫小鼠可抵抗40×LD50的AT攻毒[5]。但是
方案
Ⅰ
Ⅱ
rATB
15 mg
25 mg
15 mg
25mg
腹腔注射
1
102
102
102
102
2
104
104
104
104
3
105
106
106
106
4
106
107
106
107
攻毒
107
108
107
108
皮下多点注射
1
102
102
102
103
2
103
104
103
103
3
104
105
104
105
4
106
106
106
107
攻毒
107
107
107
108
AT
2×LD50
5×LD50
6×LD50
方案
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
腹腔注射
15 mg
存活/总数
5/5
5/5
5/5
5/5
2/5
2/5
体质量(g)
23.02±0.66
23.15±0.32
22.91±0.39
23.01±0.94
18.67±0.43
18.93±0.44
25 mg
存活/总数
5/5
5/5
5/5
5/5
3/5
3/5
体质量(g)
23.75±0.78
23.87±0.51
22.01±0.58
21.75±0.49
20.21±0.87
19.87±0.46
皮下多点注射
15 mg
存活/总数
5/5
5/5
5/5
5/5
2/5
2/5
体质量(g)
22.97±0.52
23.21±0.27
20.94±0.73
22.39±0.72
18.43±0.67
19.85±0.74
25 mg
存活/总数
5/5
5/5
5/5
5/5
3/5
3/5
体质量(g)
22.45±0.74
22.99±0.21
21.35±0.34
22.11±0.38
20.54±0.72
19.90±0.49
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以上基于A链的疫苗均由于毒性的问题而有待进一
步研究。
关于毒素B链的免疫原性则一直存有异议，有
文献报道B链的免疫原性不如A链[9]，因此目前的疫
苗研制基本集中在A链亚单位。但也研究者认为B
链亚单位同样是良好的疫苗候选抗原[7，8]，尤其是作
为结合链，ATB是无毒性的，因此本研究利用本室
制备的重组蛋白免疫小鼠评价其免疫原性。通过
现有免疫方案的优化，选取蛋白用量25 μ g/只、腹
腔注射、免疫周期0-14-28-42 d为后续实验的免疫
方案。四免后小鼠血清IgG效价可达1:106，攻毒后
则产生了二次免疫应答。经小鼠攻毒保护实验和
体外中和实验结果说明，rATB可以完全抵抗5×
LD50剂量的天然AT攻毒。
总之，本研究对大肠杆菌表达系统中获得的重
组蛋白rATB进行了免疫原性分析，结果表明免疫小
鼠可保护致死剂量的天然毒素的攻毒，为下一步研
究相思子B链疫苗奠定了基础。
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(责任编辑：张璐)
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(责任编辑：董瓅瑾)
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